资源简介

3.2基因工程的操作程序 第2课时
教 案
一、教学目标
1.能用结构与功能观解释基因表达载体的组成部分以及目的基因检测与鉴定的方法。
2.能运用流程图的形式概括出基因工程的基本操作程序。
3.面对日常生活或社会热点话题中与基因工程有关的话题时，能基于基因工程原理表达自己的观点。
二、教学重难点
教学重点
1.基因工程基本操作程序的四个步骤。
2.目的基因导入动物细胞的方法。
3.荧光蛋白在生物学中的应用。
三、教学过程
【新课导入】
回顾基因工程的基本程序相关内容
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建（核心）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
上节课已经学习过目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建，这节课我们来学习第三步：将目的基因导入受体细胞，第四步：目的基因的检测与鉴定。
【新课讲授】
（三）将目的基因导入受体细胞
1.转化指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
2.转化的受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
①农杆菌转化法
展示资料：冠瘿瘤
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。
提出问题：为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。
A.载体：农杆菌Ti质粒（T-DNA)
B.受体细胞：主要是双子叶植物和裸子植物
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
C.过程
展示农杆菌转化法示意图：
D.转化的具体方法：
可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；受体细胞为体细胞。
可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等；受体细胞为受精卵。
②花粉管通道法
A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
B.在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
C.实例：将Bt基因导入棉花细胞
（2）将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②操作程序：
问题：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
③拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。
（3）将目的基因导入微生物细胞——Ca2＋处理法（感受态细胞法）
①受体细胞：微生物（常用大肠杆菌）
优点：繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
②方法流程：
③实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
小结：
（四）目的基因的检测与鉴定
1.目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
2.检测内容及方法
（1）分子水平的检测
①PCR等技术：通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
②抗原-抗体杂交技术：从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
（2）个体水平鉴定：包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
小结：
DNA分子杂交法：
其基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。若待测DNA中有能与探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已插入转基因生物染色体的DNA中（如图)。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2.材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
⑧PCR反应体系的配方
3.方法步骤
（1）DNA的扩增
①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（3）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜
③加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
注意：
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。
4.结果分析与评价
（1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
提示：可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750 bp。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等
3.个体生物学水平的鉴定具体方法举例
到社会中去
到社会中去
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延竣棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
提示：
1.这是一个开放性的问题，需要学生在找资料来回答。随着田向监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫格铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度连国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2.科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略；该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
（2）田间策略；这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
四、板书设计
3.2 基因工程的基本操作程序

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