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第52讲　基因工程的基本工具与操作程序
【课标要求】 1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的； 2．阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具； 3．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
考点1　基因工程的基本工具
考 点 剖 析
知识1　基因工程概述
基因工程又叫作重组DNA技术。
项目 内容
主要技术 转基因技术
操作环境 　体外　
操作水平 　DNA分子水平　
理论依据 基因重组
供体 提供　目的基因　
受体 复制或表达目的基因
基本过程 切割→改造和拼接→导入→表达
优点 克服　远缘杂交不亲和　的障碍，定向改造生物的　遗传性状　
知识2　基因工程的基本工具
1．限制性内切核酸酶(限制酶)
图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是　黏性末端　，在识别序列中心轴线处切开产生的是　平末端　。
2．DNA连接酶
(1)作用：在两个核苷酸之间形成　磷酸二酯键　以连接两个DNA片段。
(2)主要类型：①E．coli DNA连接酶：从　大肠杆菌　中分离；②　T4_DNA连接酶　：从T4噬菌体中分离。两者都能连接　黏性末端　和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。
? 归 纳 总 结
与DNA有关的酶
酶 作用 作用相关“键”
限制酶 切割DNA片段，产生两个(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段 破坏磷酸二酯键
DNA连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键
解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链(ATP 水解供能) 破坏氢键
DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键
DNA(水解)酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键
逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 形成磷酸二酯键
3．载体
(1)作用：将基因送入细胞。
(2)种类：质粒、　噬菌体　、动植物病毒等。
(3)重要的载体之一——质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的　环状双链DNA分子　。
②质粒适于作基因载体的特点(载体须具备的条件)
特点(条件) 作用
有一个至多个　限制酶切割位点　 供外源DNA片段插入其中
能在细胞中进行　自我复制　，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在
带有　标记基因　(常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等 便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功)
? 深 度 指 津
最常见的标记基因——抗生素抗性基因
目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示(以氨苄青霉素抗性基因为例)：
思辨小练
1．判断下列说法的正误：
(1)目前使用的限制酶都是从原核生物中得到的。(　×　)
提示：限制酶主要是从原核生物中得到的，目前许多已商业化生产。
(2)质粒是存在于细菌细胞中的一种细胞器。(　×　)
提示：质粒不是细胞器。
(3)重组DNA技术所用的工具酶包括限制酶、DNA连接酶和载体。(　×　)
提示：重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶。
(4)不同的限制酶切割同种DNA片段，可能得到相同的黏性末端。(　√　)
(5)用DNA连接酶可连接两种来源不同的DNA。(　√　)
(6)用同一种限制酶切割目的基因和质粒，是为了获得相同的黏性末端，以便连接。(　√　)
(7)限制酶的识别序列都由6个核苷酸组成。(　×　)
提示：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
2．限制酶在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？请解释。
提示：原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性(细胞自身不含相应碱基序列)或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
典 题 精 析
考向1　基因工程中工具酶的选择和利用
(多选)(2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有(　BD　)
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
解析：由图示可知，基因A突变为a发生了碱基替换(T//A→G//C)，A错误；Hind Ⅲ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；a基因有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后会产生1个约600 bp的片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后能产生1个200 bp左右、1个400 bp左右的片段，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点数不同，产生的片段大小不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　B　)
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
解析：由于引物只能引导子链从5′到3′延伸，题干假设引物长度为8个碱基，由题图DNA片段中序列可知，其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′，另一个引物序列为5′-AGCTAGCA-3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；步骤①用到两种限制酶切割，这两种限制酶的识别序列不同，载体一般为环状，且载体中至少含有1个限制酶NheⅠ的识别序列，至少有1个CfoⅠ的识别序列，因此用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都可以连接黏性末端，D正确。
? 深 度 指 津
限制酶的选择
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。
甲 乙
(2)根据质粒的特点选择限制酶(见下图)
(3)农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而宜选取丙。
考向2　载体和标记基因
(多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的有(　AC　)
A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子
B．两种载体都要具有一个或多个限制酶切点，以便目的基因的插入
C．表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点
D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体
解析：克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，故克隆载体必须具备的元件是复制原点、标记基因，而启动子和终止子是参与转录过程的，A错误；表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达，包括转录和翻译，因此表达载体的元件中必须含有标记基因(用来筛选表达载体)，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制，C错误。
考点2　基因工程的操作程序
考 点 剖 析
知识1　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
2．基因表达载体的构建(核心工作)
(1)过程
(2)基因表达载体的组成
? 深 度 指 津
复制原点≠启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子：一段有特殊序列结构的　DNA片段　，基本组成单位是脱氧核苷酸，其位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3′端。
(2)起始密码子和终止密码子位于　mRNA　上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近mRNA的5′端。
(3)复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个复制原点。
3．将目的基因导入受体细胞
受体细胞 常用方法 操作过程
植物细胞(常用体细胞或受精卵) 　花粉管通道法　(我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二：将DNA溶液滴加在受粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
　农杆菌转化法　 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T-DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
动物细胞(常用受精卵) 　显微注射法　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
微生物细胞 　Ca2+处理法　(感受态细胞法) Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子
? 解 疑 释 惑
(1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为　转化　。实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
(2)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其 Ti质粒上的　T-DNA　转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
4．目的基因的检测与鉴定
(1)通过　PCR　等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。
(2)利用　抗原—抗体杂交　技术检测目的基因是否翻译。
(3)进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。
注：若用报告基因，如绿色荧光蛋白基因与目的基因构建融合基因，可根据荧光情况进行定性、定量和定位的研究分析。
知识2　PCR技术
1．原理：　DNA半保留复制　和DNA的热变性。
2．特点：可在短时间内　大量扩增　目的基因。
3．PCR反应所需的条件及作用
条件 作用
有一段已知目的基因的核苷酸序列 便于合成　引物　
在一定的　缓冲液　中进行 提供相对稳定的pH环境
4种脱氧核苷酸(实际上用脱氧核苷三磷酸，即dNTP) 作为合成DNA子链的　原料　，同时提供　能量　
DNA母链 作为DNA复制的模板
　耐高温　的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链
引物(是一小段　短单链核酸　，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对) 使DNA聚合酶能够从引物的　3′　端开始连接脱氧核苷酸
4．过程及图解
循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量约为　2n　。
思辨小练
1．判断下列说法的正误：
(1)利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物的碱基序列应互补。(　×　)
提示：利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物间的碱基序列一般不能互补。除非是重叠延伸 PCR 和多片段的无缝克隆。
(2)体内DNA复制和PCR技术都需要解旋酶打开DNA双螺旋。(　×　)
(3)体内DNA复制和PCR过程中，都是一条链连续复制(前导链)，一条链不连续(后随链)。(　×　)
提示：PCR中，两条子链都是连续合成的。
(4)构建基因表达载体时，须将目的基因插入启动子与终止子之间。(　√　)
(5)农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞。(　×　)
提示：农杆菌转化法的受体细胞常见的是双子叶植物和裸子植物体细胞，目前该方法在某些单子叶植物中获得了成功。
(6)目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制。(　×　)
提示：目的基因没有整合到受体细胞前可随质粒复制而复制。
(7)农杆菌转化法实质是将Ti质粒转移到宿主细胞的染色体上。(　×　)
提示：农杆菌转化法实质是将Ti质粒上的T-DNA(含目的基因)转移到宿主细胞的染色体上。
2．要合成有生物活性的胰岛素，为什么受体细胞最好用单细胞真核生物？
提示：胰岛素是分泌蛋白，形成成熟的胰岛素需要内质网、高尔基体的加工、分泌，故最好选用真核生物如酵母菌作受体细胞。从另一个角度分析，也便于从培养液中分离目的基因的表达产物。
3．自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能　将游离的脱氧核苷酸连接到已有片段的3′端　来合成子链(延伸方向是5′→3′)。
典 题 精 析
考向1　基因表达载体的构建
(2025·徐州三中)乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列分析不合理的是(　D　)
A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性
B．可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞
C．基因表达载体质粒除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等
D．标记基因AmpR即可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
解析：目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存或活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A合理；PCR技术可以扩增特定基因片段，因此可以用来检测受体细胞中是否成功导入了L-PG基因，B合理；基因表达载体通常需要包含启动子、终止子等调控元件，以确保目的基因能够正确表达，C合理；标记基因AmpR可筛选含有目的基因的受体细胞，对重组质粒进行初步筛选，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，D不合理。
考向2　基因工程的操作过程
(2025·苏锡常镇二调)人类血液中的纤维蛋白原是血液凝固的主要蛋白质成分，由Aα、Bβ和γ三条肽链组成，重组人纤维蛋白原(rFib)的开发有望消除血源性感染的风险。某科研团队欲通过培育转基因蚕并利用蚕茧高效生产人纤维蛋白原，流程如下图。请回答下列问题：
(1)纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链首先在　(游离的)核糖体　上合成，然后Aα和γ链在内质网中与Bβ链结合形成六聚体Aα2Bβ2γ2，最后在　高尔基体　中加工修饰并分泌到细胞外。
(2)选取从人类肝脏的cDNA文库扩增目的基因的原因是　相关基因只在肝细胞中表达　；步骤①PCR条件如下：94 ℃，5 min→25个循环(变性、退火、延伸)→72 ℃，7 min，其中退火温度设置需参考引物中碱基的　组成和数量　，延伸阶段使用ExTaqDNA聚合酶，该酶的作用有　从引物的3′端开始连接脱氧核糖核苷酸　和在扩增产物的3′端额外添加上一个碱基“A”。
(3)步骤②中，将Fib-Bβ插入　3′　(填“3′”或“5′”)端含有碱基T的克隆载体中，将克隆后的Fib-Bβ用　BamH_Ⅰ、Xho_Ⅰ　限制酶处理后通过DNA连接酶连接到表达载体上完成载体1的构建。载体2采用类似方法构建。
(4)步骤③分别将载体1和载体2注入胚盘期蚕卵中，在荧光体视显微镜下观察　红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白　在眼部的表达，显示阳性表达的即为转基因Bβ-蚕和转基因Aα/γ-蚕。对转基因蚕进行DNA杂交，分析表明Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和　插入目的基因的位置　有关。
(5)丝胶蛋白启动子将重组纤维蛋白原链的cDNA定向表达在丝腺细胞中，然后依靠吐丝分泌到蚕茧中。科研人员对丝腺细胞中的mRNA进行检测并对蚕茧中的蛋白质进行分析，结果如下表。
组别 mRNA 蛋白质电泳条带
Aα链mRNA Bβ链mRNA γ链mRNA Aα Bβ γ
非转基因蚕(对照组) － － － － － －
转基因Bβ-蚕 － ＋ － － － －
转基因Aα/γ-蚕 ＋ － ＋ ＋ － ＋
转基因Aα/Bβ/γ-蚕 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
注： “＋”表示有，“－”表示无。
根据实验结果推测，　Aα链、γ链和Bβ链共表达　可能是Bβ链分泌到蚕茧中的必要条件之一。
解析：(1)由题意知，纤维蛋白原是血液的成分，即需要分泌到细胞外，属于分泌蛋白。分泌蛋白首先在游离核糖体上合成，然后游离核糖体附着在内质网继续合成，在内质网中对蛋白质进行初步加工，在高尔基体进一步加工成熟。(2)细胞分化的实质是基因的选择性表达。肝脏细胞中有血浆蛋白基因表达，因此肝脏细胞含有目的基因的mRNA。退火温度与氢键数有关，引物的碱基数量、GC含量都会影响氢键数。TaqDNA聚合酶的作用是从引物的3′端连接脱氧核苷酸。(3)因为扩增产物的3′端有一个游离碱基A，形成黏性末端，根据碱基互补配对原则，将扩增产物插入载体时，需要在载体3′端加一个碱基T，使两种黏性末端互补配对。从图中可看出，载体1 Fib-Bβ的上、下游分别有限制酶Xho Ⅰ 和BamH Ⅰ 的识别序列。(4)载体1、2都含有眼部特异性启动子3xP3，载体1中该启动子启动红色荧光蛋白基因的转录，载体2中该启动子启动绿色荧光蛋白基因的转录，因此通过观察眼部是否有相应的荧光蛋白产生，即可判断载体是否导入。Bβ-蚕和Aα/γ-蚕均存在多个转基因品系，这可能与插入的目的基因数量和位置有关。(5)从表中看出，使Bβ链能够分泌到蚕茧中的只有第4组，即需要Aα、Bβ、γ同时导入并表达。
A练
一、 单项选择题
1．(2025·黑吉辽蒙卷)下列关于耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是(　B　)
A．基本单位是脱氧核苷酸
B．在细胞内或细胞外均可发挥作用
C．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应
D．为维持较高活性，适宜在70～75 ℃下保存
解析：耐高温的DNA聚合酶的本质是蛋白质，基本单位为氨基酸，A错误；耐高温的DNA聚合酶在细胞内的DNA复制和体外的PCR反应中均能发挥作用，B正确；缺少引物和缓冲液时无法催化反应，C错误；耐高温的 DNA 聚合酶虽然能在较高温度下发挥作用，但一般在低温下保存，D错误。
2．用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　D　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若只用HindⅢ一种酶切割质粒和目的基因，则产生相同的黏性末端，可能导致目的基因正向连接或反向连接，故目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，而重组质粒和空质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，则目的基因插入四环素抗性基因(TetR)中，重组质粒的大小与空质粒不同，故可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因(TetR)，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响，则重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
3．(2025·福建卷)紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(　A　)
A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上
C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
解析：农杆菌转化前，需要将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态，A错误；农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA中，因此紫杉醇合成的相关基因会随T-DNA整合到烟草染色体DNA上，B正确；紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌作用，C正确；利用转基因技术生产紫杉醇前体，可减少对天然红豆杉的依赖，有利于保护其资源，D正确。
4．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　B　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对 DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
5．(2025·南京协同体七校期中)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是(　B　)
A．①②的操作中需要使用限制酶和DNA聚合酶
B．一般情况下，⑤只要表现出抗虫性状，就表明植株发生了可遗传变异
C．③→④过程利用了膜的结构特性，重组Ti质粒整合到④的染色体上
D．④的染色体上若含有抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
解析：①②表示重组质粒的构建，重组质粒的构建需要限制酶和DNA连接酶参与，不需要DNA聚合酶，A错误；一般情况下，⑤只要表现出抗虫性状就表明抗虫基因表达了，即植株发生了可遗传变异(属于基因重组)，B正确；③→④过程利用了农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA具有可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上的特点，C错误；若受体细胞的染色体上含抗虫基因，并不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，D错误。
6．(2026·如皋期初)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(　B　)
A．DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
解析：体内DNA复制由ATP(解旋)、dNTP提供能量，体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量，A错误。DNA聚合酶需要Mg2+激活，因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+，B正确。根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，C错误。引物③的5′端添加了某序列，经过第 1 次循环，得到的1个 DNA 分子中有 1 条链含有该序列；经过第 2 次循环，得到的1个 DNA 分子的两条链均含有该序列，所以至少需经 2 次循环就可获得该序列的双链产物，D错误。
7．(2025·无锡期中)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色。某实验室使用细菌质粒构建含eGFP基因的表达载体，然后将基因表达载体转入细菌，涂布平板后培养。下列叙述错误的是(　C　)
A．通过PCR方法获得eGFP目的片段需要先设计一对特异性引物
B．PCR延伸阶段设置72 ℃既能保证Taq酶高活性又能防止新合成的产物变性
C．质粒中含有多个不同的限制酶酶切位点不利于eGFP基因与质粒连接
D．若在平板上观察到多个绿色单菌落，则说明eGFP基因表达载体构建成功
解析：PCR扩增目的基因需要根据目的基因两端的序列设计一对特异性引物，A正确；PCR延伸阶段的温度设置为72 ℃，这是TaqDNA聚合酶的最适温度，既能保证酶的高效催化，又不会使新合成的DNA链变性(DNA高温变性通常在90 ℃以上)，B正确；质粒中含多个不同的限制酶酶切位点，可提供多种酶切选择，便于目的基因与质粒的连接，C错误；若平板上出现绿色单菌落，说明eGFP基因在细菌中成功表达，表明表达载体构建成功，D正确。
二、 多项选择题
8．(2026·苏州期初)下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点。下列叙述正确的有(　AB　)
限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′
AluⅠ 5′-AG↓CT-3′
HindⅡ 5′-GTY↓RAC-3′
Sau3AⅠ 5′-↓GATC-3′
SmaⅠ 5′-CCC↓GGG-3′
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ能识别GTTAAC序列，也能识别GTCGAC序列
B．AluⅠ和SmaⅠ切割后的序列可通过T4 DNA连接酶相连
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶可识别相同的序列，但切割后形成不同的黏性末端
D．AluⅠ和Sau3AⅠ破坏的都是识别序列中心轴线处的磷酸二酯键，因而形成平末端
解析：当Y为T，R为A时，HindⅡ的识别序列为GTTAAC，当Y为C，R为G时，HindⅡ的识别序列为GTCGAC，A正确；Alu Ⅰ和Sma Ⅰ切割后形成的都是平末端，可通过T4 DNA连接酶相连，B正确；BamH Ⅰ识别序列是5′-G↓GATCC-3′，切割后的末端是-GATC-，Sau3A Ⅰ识别序列是5′-↓GATC-3′，切割后的末端是-GATC-，故BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制酶可识别不同的序列，C错误；由表格可知，Sam3AⅠ识别序列是5′-↓GATC-3′，该限制酶的切割位点不在识别序列中心轴线上，不能形成平末端，D错误。
9．(2025·淮安调研)下列有关基因工程工具的叙述，正确的有(　BD　)
A．一种限制性内切核酸酶只能识别某种特定的核糖核苷酸序列
B．E．coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接
C．限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶
D．新型冠状病毒(RNA病毒)不可以作为基因工程的载体
解析：每种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，A错误；E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接黏性末端，B正确；限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程常用的工具，其中限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，C错误；基因工程中常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，新型冠状病毒对受体细胞有害，不安全，因此不能作为基因工程的载体，D正确。
10．(2025·盐城射阳中学)如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的有(　ACD　 )
A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花
B．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
解析：花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确；要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建基因表达载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，B错误；授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，D正确。
三、 非选择题
11．(2025·徐州考前打靶)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起肺炎等疾病，不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。为验证Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关，进行以下实验。请回答下列问题：
　
注：Y是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。
(1)为获得R基因的上游、下游两个片段，设计了如图所示的两组引物分别进行PCR扩增，在每种引物的　5′　端应添加相应的限制酶识别序列，其中使用引物组合　引物1和引物3　可扩增得到含R基因和上游片段的DNA，使用另一组引物可扩增得到含R基因和下游片段的DNA。对两次PCR 的产物均用　SacⅡ和EcoR_Ⅰ　进行酶切，回收上、下游片段，与用Sac Ⅱ酶切质粒1所得大片段通过　DNA连接　酶连接，最终可以获得质粒2。
(2)将质粒2与用一定浓度的　CaCl2(或Ca2+)　处理过的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa混合，一段时间后涂布在含　氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)　的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落(S1)。
(3)质粒2与Sa的基因组发生同源重组，可敲除R基因。将S1多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含　脱水四环素　的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含　头孢霉素　的平板上，若无法增殖，则对应菌落(S2)中细菌的R基因可能被敲除。
(4)以S2菌株基因组为模板，分别用引物组合A(引物1＋引物4)、B(引物2＋引物3)、C(引物1＋引物3)、D(引物2＋引物4)进行PCR，再用　琼脂糖凝胶电泳　技术鉴定。若仅扩增出长度为　1.9_kb　的DNA片段，则可确认R基因被敲除，从而证明Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关。
解析：(1)在PCR技术中，DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，所以应在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列，这样在后续对PCR产物进行酶切时，就可以将带有目的基因(R基因及其上下游序列)的片段切下来用于构建质粒等操作；由图可知，引物1和引物3中间包括R基因和上游片段的DNA，可扩增得到含R基因和上游片段的DNA；选择引物2和引物4可扩增得到含R基因和下游片段的DNA。由图可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因以及上下游片段(或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增)，用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段用DNA连接酶连接，获得质粒2。(2)将质粒2与用一定浓度的CaCl2处理过的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa混合，诱导质粒2导入Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)的平板上，能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。(3)因为Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，要筛选并获得不再含有质粒2的菌落，就需要将菌液稀释涂布在含有脱水四环素的平板上，含有质粒2的菌体会因为脱水四环素诱导Y基因表达而死亡，从而筛选出不含质粒2的菌落。为了验证R基因是否被敲除，由于推测Sa产生头孢霉素抗性与其基因组中R基因有关，所以从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，说明失去了头孢霉素抗性，则可能失去了R基因。(4)PCR结果可用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，若仅扩增出长度为1.9 kb(0.7＋1.2＝1.9 kb，即上游片段＋下游片段)的DNA片段，而没有其他片段，说明R基因(2.2 kb)已被敲除。
12．(2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题：
限制酶 识别序列及切割位点
Bgl Ⅱ
Nde Ⅰ
Xho Ⅰ
EcoR Ⅰ
BamH Ⅰ
Sal Ⅰ
Xba Ⅰ
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、　4种脱氧核苷酸　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　延伸　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的　5′端　(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-　AGATCT　-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是　BamHⅠ、EcoRⅠ　，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到　栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上　，抗性基因　2　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　再分化　形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
解析：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的识别序列，而S基因内部含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列，要用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ或Xba Ⅰ切割载体，又不能用Xba Ⅰ、Nde Ⅰ或BamH Ⅰ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ切割载体，用BamH Ⅰ的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′-AGATCT-3′。(3)T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
B练
一、 单项选择题
1．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　C　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA连接酶连接
解析：酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA连接酶连接平末端效率低，应该用T4 DNA连接酶连接；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选。
2．(2026·徐州期中)如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体(能产生调控基因表达的RNA)修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是(　C　)
A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体
B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复
C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险
D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素
解析：构建含目标基因的表达载体时，不仅需要DNA连接酶，还需要限制酶来切割载体和获取目的基因，A错误；外泌体能产生调控基因表达的RNA，并不是携带目标基因直接整合到受损细胞的基因组中，而是通过调控基因表达来实现修复，B错误；直接移植干细胞，干细胞作为外来细胞，容易引起免疫排斥反应，而外泌体是细胞分泌的物质，相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险，C正确；外泌体能产生调控基因表达的RNA，而胰岛素是由胰岛B细胞中的相关基因表达产生的，D错误。
3．(2025·江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　B　)
A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B．在含重组Ti质粒的农杆菌中，U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
解析：将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状，那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别，A错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图可知，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达，B正确。当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素，C错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定能表达D基因，因此不一定是抗病植株，D错误。
4．(2025·高邮期中)下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　C　)
A．构建该基因表达载体所用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
B．将完成导入的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
C．将完成导入的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的细菌无法生长
D．可利用PCR技术检测人的生长激素基因是否在工程菌中转录和翻译
解析：构建该基因表达载体所用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，A错误；能在含四环素的培养基上生长的是抗四环素基因未被破坏的细菌，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入了重组质粒或普通质粒的细菌，B错误；由于重组质粒上的氨苄青霉素抗性基因被破坏，所以在含有氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的细菌无法生长，C正确；可利用PCR技术检测人的生长激素基因是否在工程菌中转录，但是不能检测是否翻译出相关蛋白质，D错误。
5．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　C　)
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；筛选平板中长出的白色菌落只能确定导入了重组质粒，但目的基因可能没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
6．(2026·如皋一调)下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　C　)
A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差
B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异
C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量
D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个
解析：引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，A正确；不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确；PCR延伸时由dNTP的特殊的化学键(磷酐键)供能，无需额外ATP，C错误；第n次循环需合成a·2n-1个新DNA分子，合成1个DNA分子需2个引物，故需a·2n个引物，D正确。
二、 多项选择题
7．(2025·海安中学)苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因如何在棉花(真核生物)细胞中有效表达，科学家需要考量的因素有(　AC　)
A．原核细胞的启动子和终止子无法被真核细胞的RNA聚合酶有效识别
B．原核细胞基因与真核细胞基因的空间结构不同，影响转录
C．原核细胞与真核细胞对密码子的使用频率不同，导致翻译效率低下
D．原核细胞基因转录产生的mRNA在真核细胞的核糖体无法翻译
解析：启动子和终止子是调控基因转录起始和终止的关键序列。原核生物(如苏云金芽孢杆菌)的启动子和终止子的序列特征与真核生物(如棉花)的启动子和终止子完全不同，真核生物的RNA聚合酶无法识别原核生物的调控序列，反之亦然，A符合题意；原核细胞和真核细胞的基因都是具有遗传效应的DNA片段，空间结构为双螺旋结构，B不符合题意；如果Bt基因的密码子使用频率与棉花基因的密码子使用频率差异很大，那么棉花细胞内的tRNA可能无法高效地与之匹配，导致翻译速度减慢，甚至提前终止，最终导致蛋白产量低，C符合题意；核糖体的功能是识别mRNA上的密码子并招募相应的tRNA来合成蛋白质，原核细胞和真核细胞的核糖体虽然大小和组成略有不同，但它们识别mRNA密码子的机制是基于相同的遗传密码表，因此，只要mRNA的序列是正确的，并且有合适的起始信号，真核细胞核糖体可以翻译原核细胞来源的mRNA，D不符合题意。
8．(2025·扬州仪征期初)大丽轮枝菌(一种丝状真菌)是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下图。下列相关叙述错误的有(　AC　)
A．图中启动子能被DNA聚合酶识别并结合，驱动sGFP基因的持续转录
B．被相关限制酶处理后，图中b链上黏性末端的碱基序列(5′→3′)为AGCT
C．若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP，则5轮后消耗引物数为32个
D．③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP
解析：启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的转录，A错误；用限制酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ对sGFP片段和质粒进行剪切，图中质粒大片段的左端的限制酶是Hind Ⅲ，根据Hind Ⅲ识别的碱基序列可知，图中b链上黏性末端的碱基序列(5′→3′)为AGCT，B正确；若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP，则5轮后消耗引物数为25×2－2＝62个，C错误；③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP，因为导入原始质粒的农杆菌也具有抗性，D正确。
9．(2026·扬州中学)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的有(　BD　)
A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板
B．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞
D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和AgeⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
解析：由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，而RNA聚合酶在转录时，只能识别模板链的3′端，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链是DNA分子的不同链，A错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，B正确；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；根据题图分析可知，在不破坏LUC基因前提下，为连入GUS基因，需用Sal Ⅰ和Age Ⅰ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，D正确。
三、 非选择题
10．(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
注：LB/RB：T-DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；bp：碱基对。
甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　复制原点　。选用图甲中的SmaⅠ 对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ 和　Xba_Ⅰ　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　DNA聚合酶　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　Spe_Ⅰ、Sma_Ⅰ　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　550　bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　4　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　连接(或环化)　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　测序和序列比对　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
注：P1、P2表示引物。
乙　基因组DNA酶切后含T-DNA的片段
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　不能　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
解析：(1)Ti质粒和普通质粒一样，具有复制原点，复制原点与其在宿主中的复制能力密切相关。选择载体上的酶切位点，第一，BamH Ⅰ不能选，因为涉及终止子序列被切开；第二，能与SmaⅠ组合且能切出黏性末端的只剩下XbaⅠ和PstⅠ这两个限制酶；第三，涉及要补平黏性末端，只有XbaⅠ切出的黏性末端(5′ 磷酸突出的末端)可以作为模板，在DNA聚合酶的催化下，从其互补链的3′-OH开始连接脱氧核苷酸补平黏性末端，如图1所示；而PstⅠ切出的黏性末端是3′ 端突出的末端，无法从其互补链的5′-P基团开始连接脱氧核苷酸，如图2所示。
图1
图2
第一，补平的载体和SmaⅠ切割的抗除草剂基因既可以正向连接，也可以反向连接；第二，SmaⅠ切出的平末端和补平的XbaⅠ的黏性末端连接后形成的重组位点，两个限制酶识别序列消失，另一边2个Sma Ⅰ位点连接后形成的重组位点仍然能保留该酶切位点；第三，能切出较准确片段的只剩下Sma Ⅰ和基因内的Spe Ⅰ 两个酶切位点；第四，在进行目的基因和载体连接过程中，由于连接的是平末端，因此，存在载体自连、载体串联、载体和单一基因连接及载体和串联基因连接等情况，但无论何种连接方式，只有单基因和单载体的连接片段在SmaⅠ和SpeⅠ切割下能出现一长一短两条带，且短的条带约为550 bp才是正向连接(图3)，而反向连接的片段切出的较短条带是200 bp (图4)。
图3
图4
(2)根据题意，要求限制酶能在基因组中切割更多更小的片段，识别序列长度为4、6、8个碱基对的限制酶在基因组中理论上分别为每44、46、48碱基对区域内会有一个酶切位点。因此，选择识别序列为4个碱基对的酶切割小麦基因组可产生更短的切割序列，连接后有利于后续PCR 进行。另外，要对图乙的未知序列进行扩增，只有连接(环化)后才能形成两个引物之间的扩增目标区，达到扩增引物之间区域的目的。琼脂糖凝胶电泳只能判断产物的有无或大小，但无法确定碱基序列，所以不能用于判断2条片段是否属于同一个基因。测序可以确定碱基序列，要确定2条片段是否属于同一个基因，进行序列比对即可。(3)突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
11．(2025·苏州调研)羊口疮是由羊口疮病毒(Orfvirus，OrfV)引起的一种人畜共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和F1L基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal，进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题：
图1
(1)为将B2L基因和F1L基因成功连接，引物R1和引物F2的5′末端添加的部分序列必须能够发生　碱基互补配对　。PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，若将它们变性后混合，链①与链⑧杂交后，　不能　(填“能”或“不能”)延伸获得B2L-F1L融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑，其原因是　DNA聚合酶无法从杂交片段的5′端开始延伸(或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5′端)　。
图2
图3
(2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带　3/三　最可能表示B2L-F1L融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是　电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列(及是否产生突变)　。
(3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5′端外侧应添加限制酶　EcoR_Ⅰ　识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是　RNA聚合酶　。
(4)转化时常用　Ca2+(CaCl2溶液)　处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有　氨苄青霉素和X-gal　的培养基筛选大
肠杆菌，挑选　白　色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。
解析：(1)引物R1和引物F2的5′末端添加的部分序列必须能够发生碱基互补配对。这是因为将B2L基因和F1L基因成功连接，需要通过引物设计使得两个基因的末端能够互补配对，从而在PCR扩增过程中形成融合基因。图2中链①与链⑧杂交后，不能延伸获得B2L-F1L融合基因，原因是DNA聚合酶只能从5′端向3′端延伸，无法从杂交片段的5′端开始延伸(或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5′端)，而链①与链⑧杂交后，DNA聚合酶无法从链①和链⑧的5′端延伸子链，补全DNA。(2)在琼脂糖凝胶电泳中，条带3的大小与预期的B2L-F1L融合基因大小(510＋540＝1 050 bp)相符，因此最可能是融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA片段的大小，不能确定碱基序列及是否产生突变，进而无法确定其序列的准确性，基因测序可以精确地确定DNA序列，确保融合基因的正确性。(3)a链是模板链，且引物R2的5′端对应a链的3′端，应位于质粒启动子一侧，同时形成重组质粒时需切除LacZ基因，则靠近质粒启动子一侧可用的限制酶为EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ，但重组质粒b链3′端有Hind Ⅲ的识别位点，因此R2的5′端只能添加限制酶EcoR Ⅰ的识别序列。转录时，与启动子结合的酶是RNA聚合酶。RNA聚合酶能够识别启动子序列，并在启动子的指导下开始转录过程。(4)转化时常用CaCl2处理大肠杆菌。CaCl2处理可以使大肠杆菌细胞壁的通透性增加，从而更容易吸收周围环境中的DNA分子。用含有氨苄青霉素和X-gal的培养基筛选大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因(Ampr)是质粒上的一个标记基因，含有质粒的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。同时，X-gal可以用于鉴定是否存在LacZ基因，含有LacZ基因的菌落呈蓝色，而LacZ基因被破坏或缺失的菌落呈白色。挑选白色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。这是因为含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色，而含有空质粒的大肠杆菌菌落呈蓝色。

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