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第53讲　DNA相关的两个实验、基因工程的应用
【课标要求】 1．实验：DNA的提取与鉴定； 2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验；3．举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质； 4．概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质； 5．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
实验16　DNA的粗提取与鉴定
实 验 基 础
1．实验思路、原理
(1)提取的基本思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，利用这些差异，对DNA进行提取。
(2)相关原理
2．材料选择
(1)依据：选用　DNA含量高　的组织，成功的可能性更大。
(2)常用材料：新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花、鸡血和猪肝等(方法可能稍有不同)。
3．实验过程
? 解 疑 释 惑
(1)研磨液的成分和作用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
(2)研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
(3)低温放置几分钟(或酒精预冷)的作用：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
(4)搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
(5)思考：教材中为什么将DNA粗提取实验安排在基因工程部分？
提示：PCR需要的模板就是从细胞中提取的。(科研人员提取DNA的技术更高，无论实验室操作还是科研人员操作，都要尽可能提纯并保证DNA的完整性。)
实 验 延 伸
用鸡血细胞作为实验材料的操作流程(苏教版)
步骤 材料/方法 说明
制备鸡血细胞液 新鲜鸡血 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核(或不含有DNA)，故不选用哺乳动物的血液作为高中DNA提取的材料
提取血细胞核物质 加入一定量的蒸馏水，破碎细胞，并用玻璃棒搅拌，过滤，获取含有DNA的滤液 细胞吸水涨破，玻璃棒搅拌加速细胞破裂
析出DNA ①取滤液加入物质的量浓度为2 mol·L-1的NaCl溶液； ②缓缓加入一定量的蒸馏水，调节物质的量浓度至0.14 mol·L-1，析出DNA，丝状物不再增加时停止加蒸馏水； ③用玻璃棒挑起丝状物，获得含一定杂质的DNA DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同
向滤液中加入等体积的、冷却的体积分数为95%的酒精，静置2～3 min，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起白色丝状物(DNA) 酒精能够减少DNA的降解，同时也能够溶解杂质
实验素养
一、实验基本理论——实验变量与原则
取两支20 mL的试管，各加入2 mol·L-1的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL 的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
1．上述实验中，自变量是　丝状物或沉淀物的有无　，因变量是　溶液颜色　，无关变量是　2_mol·L-1的NaCl溶液、二苯胺试剂和沸水及加热5_min　等。
2．实验遵循的原则：两支20 mL的试管说明实验需要　分组　，2 mol·L-1的NaCl溶液5 mL、4 mL的二苯胺试剂和沸水中加热5 min中的数字则说明实验要遵循　等量　原则，“将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中”则说明实验需遵循　单一变量　原则。
二、试剂的选择和使用
1．使用鸡血提取DNA时，需在鸡血中加入柠檬酸钠，目的是　防止血液凝固　；在鸡血细胞溶液中加入蒸馏水，目的是　使鸡血细胞破裂　。
2．使用洋葱提取DNA时，需要加入研磨液，研磨液能够　使细胞核DNA释放　，另外有利于蛋白质与DNA发生分离。
3．DNA在物质的量浓度为　0.14　mol·L-1的NaCl溶液中溶解度最低。使用体积分数为95%的冷却酒精可使DNA　析出　(填“析出”或“溶解”)。
4．此实验中二苯胺试剂的作用是　鉴定DNA　，需要现配现用。
题 组 运 用
1．(2026·海安开学考)下列关于洋葱DNA粗提取与鉴定的叙述，正确的是(　D　)
A．利用DNA溶于酒精的原理可初步分离DNA与蛋白质
B．研磨液中的SDS能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
C．将洋葱研磨液倒入塑料离心管内，离心后弃去上清液
D．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
解析：DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可将DNA与蛋白质分离，A错误；研磨液中的SDS能瓦解细胞膜，但不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度，B错误；将洋葱研磨液倒入塑料离心管内，应保留上清液，C错误；在一定温度(水浴)下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，D正确。
2．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　A　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺试剂加热后可能变蓝的干扰
解析：在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 min以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组即可，二苯胺试剂本身加热后不会变蓝，D错误。
实验17　利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定
实 验 基 础
1．实验原理
(1)扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够　自动调控温度　的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
(2)电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷　相反　的电极移动。
(3)鉴定原理：PCR的产物一般通过　琼脂糖凝胶　电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　大小　和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为　300_nm　的紫外灯下被检测出来。
2．设备：　PCR仪　、电泳装置等。
3．实验过程
(1)PCR操作过程
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 　94　℃，5 min — —
30次 94 ℃，30 s 　55　℃，30 s 　72　℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，10 min
注：①预变性可使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合；②最后一轮延伸给予更长时间的主要目的是使子链充分延伸，得到更多的等长DNA。
(2)电泳鉴定：配制　琼脂糖　溶液，加入核酸染料混合→制备凝胶→加缓冲液(没过凝胶1 mm为宜)→加样(PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，留一个孔加　标准参照物　)→进行电泳(待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止)→　紫外灯　下鉴定。
? 解 疑 释 惑
注意区分“核酸染料”和“指示剂”！指示剂一般是加样时添加的，主要有3个作用：①提示操作者何时停止电泳；②有助于判断加样时样品是否到达加样孔底部；③由于指示剂密度较大，有助于DNA样品沉降。
题 组 运 用
1．(2024·黑吉辽卷)关于“采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物”的实验，下列叙述正确的是(　A　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中的指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当指示剂前沿接近凝胶边缘时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段在高于等电点的pH溶液中带负电，向正极迁移，同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
2．(2025·全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　D　)
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测，样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
解析：配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向正极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关，甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段(2个条带)，这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，据图推测，样品4可能是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。
考点　基因工程的应用、蛋白质工程
考 点 剖 析
知识1　基因工程的应用
1．基因工程在农牧业方面的应用
分类 导入目的基因 转基因生物实例
植物 转基因抗虫植物 外源　抗虫　基因 抗虫棉花、玉米等
转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的　抗病　基因 抗病毒甜椒、番木瓜等
转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种　除草剂　的基因 抗除草剂玉米、大豆等
改良植物的品质 富含　某些必需氨基酸　的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米
与植物　花青素　代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛
动物 提高动物的生长速率 外源　生长激素　的基因 转生长激素基因的鲤鱼
改善畜产品的品质 　肠乳糖酶　的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛
? 解 疑 释 惑
培育转基因哺乳动物的一般流程
2．基因工程在医药卫生领域的应用
(1)微生物制药
(2)利用哺乳动物批量生产药物——　乳腺(房)生物反应器
(3)建立移植器官的工厂
利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入　调控基因表达的DNA序列　，以抑制　抗原决定基因　的表达，或设法除去　抗原决定基因　，再结合克隆技术，培育出不会引起　免疫排斥　反应的转基因克隆猪器官。
3．基因工程在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、　氨基酸　和　维生素　等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过　工业发酵　生产凝乳酶。
? 概 念 辨 析
试管动物、克隆动物和转基因动物的比较
比较项目 试管动物 克隆动物 转基因动物
含义 用体外受精的方法获得的动物 用人工方法(核移植或胚胎分割)得到的无性繁殖系 染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物
技术基础 体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植 核移植技术、早期胚胎培养(胚胎分割)、胚胎移植 重组DNA分子技术、早期胚胎培养、胚胎移植
实例 试管牛 多莉羊 转基因奶羊
过程
生殖方式 有性生殖 无性生殖 有性生殖或保持原生殖方式
遗传物质 遗传物质来自两个供体 核基因来自供核个体，质基因来自提供卵母细胞的个体 遗传物质除了来自亲代外，还接受外源基因
意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期 加速家畜遗传改良进程、挽救濒危物种等 改良动物品质、制备生物反应器等
相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎(说明：若是鱼、蛙、鸟等非哺乳类动物，则不涉及胚胎移植技术)
知识2　第二代基因工程——蛋白质工程
1．对蛋白质工程的理解
基础 蛋白质分子的　结构规律　及其与　生物功能　的关系
手段 通过　改造　或　合成　基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质
目的 获得满足人类的生产和生活需求的　蛋白质　
2．蛋白质工程崛起的缘由
(1)基因工程在原则上只能生产　自然界中已存在的蛋白质　。
(2)天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却　不一定完全符合人类生产和生活的需要　。
3．蛋白质工程的基本思路
A．　预期功能　，B．　转录　，C．　翻译　。
4．蛋白质工程的应用
医药工业方面 如研发速效　胰岛素类似物　，延长　干扰素　的保存期，改造抗体等
酶方面 改进酶的　性能　或　开发新的工业用酶　，如提高酶的催化活性、提高酶的稳定性等
农业方面 除了改造某些重要的酶，如参与调控光合作用的酶，还用于设计优良微生物农药等
? 概 念 辨 析
蛋白质工程和基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
原理 中心法则的逆推 基因重组
过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果 生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现
思辨小练
1．判断下列说法的正误：
(1)乳腺生物反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(　×　)
提示：乳腺生物反应器是把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵中。
(2)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(　×　)
提示：蛋白质工程中直接改造的是基因，不是蛋白质。
(3)蛋白质工程遵循中心法则，而基因工程不遵循。(　×　)
(4)根据某多肽链的一段氨基酸序列，可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。(　×　)
提示：由于密码子的简并性等原因，根据某多肽链的一段氨基酸序列，不容易确定基因的脱氧核苷酸序列。
(5)蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(　√　)
2．科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在　膀胱上皮　细胞中特异性表达。它与乳腺生物反应器一样，具有　收集药用蛋白较容易　，且有　不会对动物造成伤害　的优点；且相比之下，还能不受　性别和年龄　的限制。
3．为什么蛋白质工程不是直接改造蛋白质，而是通过基因改造或基因合成来完成的？
提示：①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传下去的。②对基因进行改造比对蛋白质进行直接改造容易操作，难度小得多。
典 题 精 析
考向1　基因工程的应用
(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-(GTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是　EcoR_Ⅰ和Hind_Ⅲ　。
(2)步骤②转化时，科研人员常用　CaCl2　处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有　卡那霉素　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是　S-F和P-R　。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　启动子　结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是　C　(从图2的“A～D”中选填)。
图2
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
(ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是　SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多(或SOD-ELP50溶液的蛋白质含量比SOD组高)　。
(ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是　高温使蛋白变性　。
(ⅲ)据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有　低温/20_℃下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，(杂蛋白较少，)有利于酶活性的保持　。
解析：(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入SOD基因之后，由图1可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。(2)将目的基因导入大肠杆菌时常用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，选引物S-F和P-R可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，ELP50为750 bp，SOD为462 bp，一共1 212 bp，则对应404个氨基酸，其脱水缩合形成的蛋白质质量为404×0.11 kDa≈44 kDa，电泳后应该为条带C。(4)(ⅰ)由图可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白含量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，与SOD组相比，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量更高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
(2025·泰州开学考)水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了图1所示实验。请回答下列问题：
图1
(1)为获取图1中水稻B基因编码蛋白的序列(740 bp)，通常采用从　体细胞或精子　中提取总RNA，经　RT-PCR　技术获得大量的B基因编码序列。
(2)将B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因(460 bp)连接成融合基因，融合基因及重组表达载体构建均采用了无缝克隆的同源重组技术。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用　限制性内切核酸酶(限制酶)　(填酶名称)。
(3)检测转基因水稻是否含有融合基因，可通过PCR技术对融合基因进行扩增并通过　琼脂糖凝胶　电泳进行鉴定，需注意观察当　指示剂前沿　接近凝胶边缘时，停止电泳，取出凝胶置于　紫外灯下　观察和照相。对于电泳结果符合预期的基因片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是　琼脂糖凝胶电泳仅能检测DNA分子的相对大小，无法测定其碱基序列　。
(4)检测转基因水稻是否成功表达，可从转基因水稻的　卵细胞　中提取蛋白质，并在其中加入　荧光素　，观察是否发出荧光。
(5)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将融合基因表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用B蛋白抗体进行杂交，显示的条带应是　C　(从图2的“A～D”中选填)。
图2
(6)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明　B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚　。
解析：(1)通过题干信息可知，水稻的体细胞或精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞或精子中提取总RNA，经RT-PCR技术获得大量的B基因编码序列。(2)B-Luc融合基因的形成需要DNA连接酶的催化，与传统重组质粒构建过程相比，这一过程无需使用限制性内切核酸酶。(3)在检测转基因水稻是否含有融合基因时，对融合基因扩增后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，为了防止目的基因片段跑出凝胶，需要注意观察，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，停止电泳，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。琼脂糖凝胶电泳仅能检测DNA分子的相对大小，无法测定其碱基序列，因此对于电泳结果符合预期的基因片段，通常还需进一步通过基因测序确认。(4)该实验的目的是研究B基因表达对卵细胞的影响，检测转基因水稻是否成功表达，可从转基因水稻的卵细胞中提取蛋白质，并在其中加入荧光素(荧光素酶能催化荧光素发出荧光)，观察是否发出荧光。(5)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，Luc基因为460 bp、水稻B基因编码蛋白的序列为740 bp，则形成的融合基因蛋白质大约含有(460＋740)÷3＝400个氨基酸，则融合基因蛋白相对分子质量为0.11×400＝44，故显示的条带应是C。(6)当从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含有一个染色体组，推断该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
融合基因与无缝克隆
1．融合基因
(1)基因工程中构建融合基因，可以实现两个或更多不同来源的DNA分子组合，置于同一套调控序列控制之下进行表达。表达产物为融合蛋白。
(2)可分为四大类：①由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因等，主要目的是对功能基因进行示踪；②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因，其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白；③功能基因与功能基因的融合，包括相同功能基因的融合(目的是增强基因的功能)和不同功能基因的融合；④报告基因与抗药性基因的融合，用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记。
2．无缝克隆
(1)原理：使载体末端和引物末端具有15～20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15～20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密地连在一起。
(2)优点：无缝克隆不需要限制性内切核酸酶，突破传统的双酶切后再连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。
考向2　蛋白质工程
(2025·扬州期中)T4溶菌酶耐热性差，将该酶的第3位氨基酸进行如图所示改造，可大大提高其耐热性。下列叙述错误的是(　D　)
A．T4溶菌酶耐热性改造设计思路与天然蛋白质的合成方向相反
B．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列
C．利用基因定点诱变技术对相关基因进行改造，至少需替换两个碱基对
D．T4溶菌酶耐热性提高的直接原因是其氨基酸的种类和数量发生改变
解析：天然蛋白质的合成方向是DNA→mRNA→蛋白质，而T4溶菌酶耐热性改造的设计思路是根据需要改变的蛋白质氨基酸序列确定mRNA上的碱基序列，再得出对应基因的碱基序列，说明T4溶菌酶耐热性改造设计思路与天然蛋白质的合成方向相反，A正确；据图所示，半胱氨酸有两种密码子，不同的密码子对应不同的脱氧核苷酸序列，因此根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列，B正确；根据异亮氨酸和半胱氨酸对应的密码子序列可知，两种氨基酸的密码子至少有两个碱基不同，那么利用基因定点诱变技术对相关基因进行改造，至少需替换两个碱基对，C正确；T4溶菌酶耐热性改造没有改变氨基酸的数量，仅是异亮氨酸替换为半胱氨酸，D错误。
情境剖析7　PCR技术在蛋白质工程中的一些应用
材料1　PCR定点突变技术
基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。
(1)第一轮PCR所用的引物有　诱变引物和侧翼引物　。
(2)第二轮PCR所用的引物除了侧翼引物外，还有大引物。该大引物是第一次PCR扩增产物中的①链还是②链？　②链　。
(3)与常规引物相比，大引物有何特点？　大引物特异性高　
材料2　重叠延伸PCR技术
1．利用重叠延伸PCR可以实现基因的定点突变
重叠延伸PCR是一种通过引物之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用此技术实现基因的定点突变的原理如图所示：
(1)PCR扩增DNA的过程中， PCR1应选择引物　F1和R1　，PCR2应选择引物　F2和R2　，第二步中延伸　不需要　(填“需要”或“不需要”)引物，通过PCR3大量扩增突变产物应选择引物　F1和R2　。
(2)重叠延伸PCR通过　在引物R1和F2上引入突变　实现定点突变。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是　引物R1和引物F2可以互补配对，导致引物失效　。
2．利用重叠延伸PCR构造融合基因
采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来，其过程如图所示。
(1)图中第一阶段中PCR至少进行　2　次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的　互补配对　关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计　8　种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有　6　种。
材料3　反向PCR
如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，这叫反向PCR。反向 PCR 在蛋白质工程中的核心作用是获取目的基因的未知部分序列，支撑基因完整克隆、载体改造及调控序列分析，是解决“已知部分序列、需扩增未知片段”的关键技术。其具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种　限制性内切核酸(或限制)　酶，它通过识别特定的　核苷酸序列　切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成　磷酸二酯键　；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得　DNA单链　；Taq DNA聚合酶的作用是催化　以DNA为模板的DNA链的延伸　。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　②④　(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
解析：DNA连接酶是在相邻的核苷酸之间形成磷酸二酯键。引物与对应的模板链能够碱基互补，且方向相反，步骤Ⅲ需要扩增出片段F的完整序列，需要包括已知序列两端的未知序列，所以需要引物②(其3′端与环状DNA内链已知序列的5′端互补)和④(其3′端与环状DNA外链已知序列的5′端互补)。
? 审 答 指 导
(1)一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5′端向3′端延伸。
(2)具体操作：①沿着引物的方向确定模板DNA；②确定引物延伸得到的目标DNA；③找到引物与模板DNA的结合位置；④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从5′端→3′端。
一、 单项选择题
1．(2025·泰州调研)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　D　)
A．可选用新鲜的香蕉、菠菜、猪肝等作为实验材料
B．研磨液中2 mol·L-1的NaCl溶液有利于溶解DNA和去除杂质
C．过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性
D．将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
解析：新鲜的香蕉、菠菜(植物细胞)含有细胞核，有DNA，猪肝(动物细胞)也含有细胞核，存在DNA，这些材料都能用于该实验，A正确；DNA在2 mol·L-1的NaCl溶液中DNA的溶解度较高，搅拌过滤后，DNA存在于滤液中，有利于去除杂质，B正确；酶活性的发挥需要适宜的温度等条件，将过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性，避免DNA被水解，C正确；将析出的丝状物溶于2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂后沸水浴加热5 min才可出现蓝色，D错误。
2．(2025·南京二模)关于“DNA粗提取与鉴定”“琼脂糖凝胶电泳”和“PCR扩增”实验，下列说法正确的是(　B　)
A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4 ℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解
B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变
C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×(220－2)个引物
解析：将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4 ℃冰箱中静置几分钟后，DNA主要存在于上清液中，应取上清液进行后续操作，A错误。在DNA鉴定实验中，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色，此过程中DNA双螺旋结构被破坏；在PCR扩增过程中，高温变性使DNA双螺旋结构解开，B正确。核酸染料是在制备凝胶时加入凝胶中的，C错误。PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则，a个双链DNA分子经过n次循环后得到a×2n个DNA分子，需要的引物数量为(2n+1－2)×a个，第n－1次循环共需引物(2n－2)×a个，第n次循环共需引物a×2n个，D错误。
3．(2025·福建卷)质粒P含有2个EcoR Ⅰ、1个Sac Ⅰ和1个BamH Ⅰ 的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是(　C　)
A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
解析：DNA分子含磷酸基团，在电泳缓冲液中带负电荷，在电场作用下，DNA分子由电源负极向电源正极移动，A错误；P质粒有两个EcoR Ⅰ限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知泳道③条带是EcoR Ⅰ限制酶单酶切产物，而泳道③只有一条条带，由此可以推出EcoR Ⅰ的两个酶切位点大致平分质粒P，泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物，B错误；泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物，BamH Ⅰ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，结合泳道③条带可推出，泳道⑦条带是EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的双酶切产物，泳道⑤条带是EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ的双酶切产物，泳道⑥条带为Sac Ⅰ和BamH Ⅰ的双酶切产物，C正确；限制酶只水解磷酸二酯键，单酶切后的质粒碱基数不会改变，泳道①②的不同主要是与酶切后DNA分子的构象发生改变有关，D错误。
4．(2025·苏北七市三调)琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是(　D　)
A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快
B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内
C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1～5 V
D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊
解析：单个核苷酸所带电荷相等，两个核苷酸数目相等的DNA所带电荷相等，但由于构象不同(环状、线性)，迁移速率不一样，A错误。用微量移液器将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合物缓慢注入凝胶的加样孔内，B错误。迁移速度快慢取决于凝胶浓度(配制凝胶需要考虑待分离DNA分子大小，待分离DNA分子越大，则配制的凝胶浓度应越小，否则DNA分子迁移很慢，无法分离)、DNA分子大小和构象、电场强度等。电压越高，迁移越快，但可能使条带模糊。电压的大小应根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定，一般为1～5 V·cm-1，C错误。PCR非特异性扩增产物相对分子质量差异很小，难以分离，会导致电泳条带模糊，样品上样量过多也会导致电泳条带模糊，D正确。
5．(2025·扬州考前调研)关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是(　A　)
A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集
B．PCR缓冲液中需保持较高浓度的Mg2+，以确保DNA聚合酶最佳活性
C．将白色丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化
D．DNA电泳指示剂需要加入稍冷却的琼脂糖溶液中
解析：DNA不溶于酒精溶液，粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物(DNA)后，用离心法可以将DNA收集起来，A正确；PCR缓冲液中需要保持一定浓度的Mg2+，Mg2+可以激活DNA聚合酶，Mg2+浓度过高可能会对反应产生不利影响，B错误；将白色丝状物(DNA)溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化，C错误；DNA电泳指示剂是在加样时与DNA样品混合加入凝胶加样孔中的，D错误。
6．(2025·苏州三模)蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是(　D　)
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数为95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
解析：细胞研磨能破坏细胞结构，使DNA释放，充分研磨可让更多DNA释放，A正确；DNA溶于水相，转移水相并重复酚、氯仿抽提步骤，可进一步去除杂质，纯化DNA，B正确；DNA不溶于乙醇，体积分数为95%的冷乙醇能使DNA析出，离心后DNA在沉淀物，C正确；二苯胺试剂检测DNA时需在沸水浴条件下才会呈现蓝色，仅复溶后加入二苯胺试剂不会显色，D错误。
7．(2025·扬州期末)为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是(　C　)
A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可充分破碎细胞，从而获得真菌粉末
B．NaOH的碱性条件可以进一步破坏细胞结构，使DNA从细胞中释放出来
C．缓冲液除了中和碱性物质外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能
D．提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性
解析：将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末，有利于提取DNA，A正确；NaOH呈碱性，碱溶液可能破坏细胞膜和细胞壁，进而可以快速提取DNA，B正确；缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有使DNA酶失活、抑制微生物生长等功能，C错误；高温可能会使DNA变性，光照可能加速DNA降解，故提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性，D正确。
8．(2025·盐城七校联考)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp(99)和Glu(156)改成Lys，使其在pH＝6时的活力提高了10倍。下列说法错误的是(　C　)
A．需要通过改造基因以实现对蛋白质中氨基酸的替换
B．改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可以遗传
C．蛋白质工程的最终目的是获取编码蛋白质的基因序列
D．该成果体现了蛋白质工程在培育新品种方面具有优势
解析：蛋白质工程通过修改基因中的碱基序列，从而改变蛋白质的氨基酸序列，实现对蛋白质的定向改造，A正确；经蛋白质工程改造后的酶是通过基因重组产生的，其性状由改变的基因控制，能够遗传给后代，B正确；蛋白质工程的最终目的是获得满足人类需求的蛋白质，获取基因序列是达成该目的的手段，而非最终目标，C错误；蛋白质工程可以改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，该成果体现了其在培育新品种方面具有优势，D正确。
9．(2026·南通期初)某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法正确的是(　D　)
A．可使用显微注射法将含有W蛋白基因的表达载体导入膀胱细胞中
B．制备的膀胱生物反应器，只有膀胱细胞中才含有W蛋白基因
C．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白使用的启动子相同
D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制
解析：显微注射法通常用于将目的基因导入受精卵，而非体细胞(如膀胱细胞)，将表达载体导入体细胞常采用电穿孔法或病毒载体等方法，A错误；转基因动物的所有体细胞均由受精卵分裂、分化而来，均含有W蛋白基因，但其仅在膀胱细胞中表达，B错误；乳腺生物反应器使用乳腺组织特异性启动子(如乳蛋白基因启动子)，而膀胱生物反应器需用膀胱上皮细胞特异性启动子，C错误；乳腺生物反应器需雌性个体且需泌乳期才能产生所需蛋白质，而膀胱生物反应器通过尿液持续分泌W蛋白，不受性别和年龄限制，D正确。
二、 多项选择题
10．(2025·苏锡常镇二调)下列与DNA相关的实验的叙述，正确的有(　BCD　)
A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA
B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定
解析：DNA不溶于酒精，但有些蛋白质溶于酒精，A错误；粗提取的DNA可能含有杂质，如蛋白质(未完全被酶分解或盐析去除)、脂质(细胞膜成分)等，B正确；在一定温度下，DNA与二苯胺试剂反应会呈现蓝色，C正确；PCR扩增产物通常利用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，因为DNA经核酸染料染色后，在紫外灯照射下会发出荧光，据此可判断扩增产物中是否存在相应DNA及DNA分子大小，D正确。
11．(2025·扬州期中)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列叙述正确的有(　BC　)
A．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取质粒DNA
B．将提取的DNA溶于2 mol·L-1 NaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定
C．凝胶中的DNA分子通过染色，可在紫外灯下被检测出来
D．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，有限制酶Ⅲ的切割位点
解析：蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，从而分离DNA和蛋白质，A错误；由于DNA在2 mol·L-1 NaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2 mol·L-1 NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，B正确；凝胶中的DNA分子通过染色，可在紫外灯下出现一定的颜色特征，从而被检测出来，C正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个酶切位点，也可能没有酶切位点，D错误。
12．(2025·如皋调研改编)抗凝血酶Ⅲ是抗凝系统中最重要的成分，它由肝脏合成，为一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制物，可抑制凝血酶生成，具有很强的抗凝活性，临床上可用抗凝血酶Ⅲ来治疗获得性和自发性的深静脉血栓。利用乳腺生物反应器和膀胱生物反应器来生产抗凝血酶Ⅲ使得该药物的价格低廉。下列叙述正确的有(　AB　)
A．肝脏有严重疾病的人，其血液中抗凝血酶Ⅲ的含量比正常人的低
B．可从人肝细胞获取相应的mRNA经逆转录得到抗凝血酶Ⅲ的cDNA
C．制备乳腺生物反应器和膀胱生物反应器均可向受精卵中导入目的基因
D．将乳腺细胞中能表达的任一基因的启动子与目的基因连接来制备乳腺生物反应器
解析：由题意可知，抗凝血酶Ⅲ由肝脏合成，因此肝脏有严重疾病的人，其血液中抗凝血酶Ⅲ的含量比正常人的低，A正确；制备乳腺生物反应器和膀胱生物反应器时均需要将目的基因与乳腺细胞或膀胱细胞中特异表达的基因的启动子等控制元件重组在一起，通过显微注射的方法导入受精卵中，C、D错误。
三、 非选择题
13．(2025·江苏卷节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①　上清液　，加入乙醇
②　溶解DNA　 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③　耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(2)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基　互补配对　。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是　丁　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有　丙和丁　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用　染色体DNA　的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基；“……”表示省略200个碱基。
解析：(1)释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，溶解DNA→扩增DNA：需要将4种dNTP、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入反应管中，进行PCR。(2)扩增的前提是引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对。因为植物甲、乙、丙的DNA长度一样，所以根据电泳条带分析能检出的样本是植物丁。图中的3种序列，因为甲、乙序列相同而无法区分，则可确定川金丝猴摄食的植物有丙、丁。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用染色体基因(细胞核基因)中保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
14．(2025·苏北四市一模)为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因(p30)与白喉毒素无毒突变基因(CRM197A)的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图，请回答下列问题：
图1
图2
(1)除图1中所示结构外，pET32a质粒上还具有的结构是　复制原点　，终止子的功能是　终止转录(或停止转录)　。
(2)引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和　p30(上游)末端序列　。通过PCR分别扩增p30基因和CRM197A基因时配制的两个反应体系中相同的物质有：缓冲液(含Mg2+)、无菌水、　耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、dNTP(写出一点即可)　等，缓冲液的功能是　维持适宜的pH(或为酶提供适宜的反应条件)　。
(3)筛选时科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切、电泳，结果如图2所示。可初步判断　2和4　菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。p30和CRM197A基因　不含　(填“含”或“不含”)BamHⅠ、Hind Ⅲ酶切位点，理由是　2和4中只有两个条带(或若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条，或没有出现长度小于1_100个碱基对的条带)　。
(4)为进一步确认质粒构建成功，科研人员检测上述菌落后，发现某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，可能的原因是　涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落(或一个细菌同时吸收了空载质粒和融合表达质粒)　。
(5)为验证融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注射到小鼠体内，检测抗体含量，结果如图3所示。据此可以判定融合蛋白疫苗效果更好，依据有　(诱发机体)短时间内产生更多抗体(或作用效果快)，长时间维持较高水平抗体(或持续时间长)　。深入研究表明某些抗原呈递细胞表面有　CRM197A受体(或特异性受体)　，识别、摄取CRM197A的同时也促进了p30的摄取，从而加强了疫苗效果。
图3
解析： (1)质粒上含有启动子、终止子、标记基因和复制原点等基本结构，图中所示结构还应该具有复制原点。终止子本身不转录，功能是终止转录。(2)由图可知，引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和p30上游的部分序列。PCR反应体系中含有的物质包括缓冲液(含Mg2+)、无菌水、耐高温的DNA聚合酶、dNTP、模板DNA等。缓冲液的功能是维持适宜的pH，其中Mg2+具有激活DNA聚合酶的作用。(3)由图1可知，构建成功的融合基因表达质粒经BamHⅠ、HindⅢ酶切应该含600＋500＝1 100个碱基对。结合图2可知，2、4号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。若p30和CRM197A基因含有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，2和4中条带数应多于两条，而2和4中只有两个条带，所以p30和CRM197A基因不含这两种酶切位点。(4)由图1可知，上述菌落是经稀释涂布平板法获得的，某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒的原因是涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落，或一个细菌同时吸收了空载质粒和融合表达质粒。(5)由图3可知，p30-CRM197A融合蛋白注入小鼠体内后，产生抗体快，维持高抗体含量时间长，说明其作为疫苗效果较p30蛋白更好。由题意可知，抗原呈递细胞能识别、摄取CRM197A，说明抗原呈递细胞上具有CRM197A受体。

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