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微 难 点 4　PCR相关问题分析
核 心 提 炼
1．PCR的几个基础问题
(1)PCR中文名称是“聚合酶链式反应”，其最大的特点是体外大量扩增目的DNA，便于后续的基因表达载体构建或DNA电泳分析等。
(2)主要原理是DNA半保留复制(和DNA热变性)，其特异性主要取决于引物设计和扩增条件控制(如退火温度、Mg2+浓度等)。
(3)基本程序：高温变性→低温复性(退火)→中温延伸。
(4)基本反应体系为：模板(一般为提取的总DNA或总RNA)、dNTP(原料和能量)、耐高温的DNA聚合酶、特异性引物、缓冲液(含Mg2+)等。
(5)PCR可以用如下反应式表示：
dNTP＋模板＋引物2nDNA片段
? 概 念 辨 析
PCR与细胞内DNA复制的主要区别
项目 PCR 细胞内DNA复制
解旋方式 高温 解旋酶(ATP供能)
解旋结果 模板全部解旋 局部解旋
场所 体外(微量离心管) 细胞内(如细胞核、线粒体、叶绿体等)
酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等
引物成分 DNA短链 一般为RNA短链
原料 4种脱氧核苷酸 脱氧核苷酸(实际为dCTP、dATP、dGTP、dTTP)
能量 电加热、dNTP ATP和dNTP
子链合成连续性 两条子链均连续合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续
主要过程 变性→复性→延伸 解旋→引物合成→子链延伸→恢复螺旋
产物数量 a×2n(a为起始模板数) 一个DNA复制产生2个DNA
温度条件 高温→低温→中温 温和条件(生物的体温)
复制起点的决定 引物 复制原点(≥1)
产物的长度 两引物之间的长度 整个DNA
突变率 较高 较低(存在检验点和复杂的纠错机制等)
2．PCR过程模型
图形显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，大概率在第三轮循环时，会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA，即第n轮循环，合成等长的DNA分子数为2n－2n。(最终30轮循环后大部分是等长的。)
PCR引物
1．PCR需要引物
(1)引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。
(2)原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′-羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合(即只能催化子链的延伸，而不是让DNA链从无到有)。
(3)细胞内DNA复制一般以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的，且最终还要被去除。
(4)PCR反应一般以DNA作引物(主要因为RNA不稳定，易降解)。一般通过化学合成法获得。
2．设计引物的主要原则
(1)引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合。
(2)引物与靶序列间的Tm(DNA熔解温度)不应过低。
(3)引物内部不应有发夹结构(局部碱基互补)，即不能有4 bp以上的回文序列，否则会失效或特异性降低。
(4)2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。
(5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
(6)引物的5′端要设计合适的酶切位点或同源序列，以便构建基因表达载体。
(7)在实时荧光定量PCR时，引物还要避免与探针的互补，因为探针需要与目的DNA内部序列互补。
3．引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。
4．引物的选择和互补链的判断
DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物开始由5′端向3′端延伸。
举 题 固 法
考向1　PCR的过程与引物设计
为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有　模板、引物　，扩增程序中最主要的不同是　退火温度　。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用　CD　。
EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC…GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG…CCAAAACCACAACCA3′
图2
A．ATGGTG…CAACCA
B．TGGTTG…CACCAT
C．GACGAG…CTGCAG
D．CTGCAG…CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有　限制酶、DNA连接酶　。
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有　P3、P4　。
图3
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是　电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列　。
解析：(1)PCR反应进行的条件包括引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR过程包括变性、复性和延伸三个阶段，通过温度的变化进行控制，由于引物和模板存在差异，扩增程序中最主要的不同是退火温度。(2)据图分析可知，PCR扩增片段F1与片段F2后，需要通过重叠延伸的方式构建融合基因。引物F2-F的部分序列与引物F1-R的部分序列可互补，且引物F2-F的部分序列与F1片段(EGFP)靠近右侧(3′端)的序列一致；引物F1-R的部分序列与F2片段(AnB1)靠近左侧(5′端)的序列互补配对，因此引物F2-F和引物F1-R的序列分别与C和D对应。(3)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下发生同源重组形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 110 bp，用引物F1-F和F2-R 进行了PCR扩增，P1、P2的扩增产物与电泳结果符合，可以舍弃的质粒有P3、P4。(5)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
考向2　PCR技术中的数量关系
(多选)(2025·南京六校联考)蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度。下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1～4表示DNA上引物可能结合的位置，下列叙述正确的有(　AC　)
A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能
B．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏2个磷酸二酯键
C．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
D．选择图中适宜引物进行PCR扩增，经过5次循环可获得32个等长的蛛丝蛋白基因
解析：大肠杆菌为原核生物，没有高尔基体和内质网，若受体细胞为大肠杆菌，蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能，A正确。若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，DNA每条链上会破坏2个磷酸二酯键，共破坏4个磷酸二酯键，B错误。由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，图中的磷酸基团为5′端，羟基为3′端，由于引物要延伸子链，子链和模板链反向平行，因此根据引物的延伸方向可知图中与引物结合的部位是2、3，C正确。PCR扩增过程如下图所示：
图1 图2
经过n次循环得到的等长的蛛丝蛋白基因数为2n－2n，当n＝5时，可得到22个等长的蛛丝蛋白基因，D错误。

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