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第十一单元　生物技术与工程
第47讲　微生物的培养技术及应用
【课标要求】 1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提； 2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术； 3．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物； 4．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法； 5．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点1　培养基和无菌技术
考 点 剖 析
知识1　微生物的培养基
1．概念：人们按照微生物对　营养物质　的不同需求，配制出供其　生长繁殖　的营养基质。
2．类型
划分标准 培养基类型 配制特点 主要应用
物理性质 　固体　培养基 加入凝固剂较多 菌种　分离、鉴定、计数　
　半固体　培养基 加入凝固剂　较少　 菌种　保存　
　液体　培养基 　不　加入凝固剂 工业生产，连续培养
化学组成 　合成　培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 菌种　分类、鉴定　
　天然　培养基 由天然成分配制而成，培养基成分不明确 工业生产，降低成本
目的用途 　鉴别　培养基 添加某种指示剂或化学药剂 菌种的　鉴别　
　选择　培养基 添加(或缺少)某种化学成分 菌种的　分离　
3．培养基的营养构成
(1)各种培养基一般都含有　水、碳源、氮源　和无机盐等营养物质。
营养物质 作用 主要来源
水 良好的溶剂、细胞结构的重要组成成分 培养基、空气、代谢产物
碳源 提供碳元素，有机碳源是异养生物的　能源　物质 葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素、牛肉膏、蛋白胨等
氮源 提供氮元素，合成　蛋白质、核酸　、磷脂以及含氮代谢产物 无机氮源，如铵盐、硝酸盐等；有机氮源，如酵母粉、　牛肉膏　、　蛋白胨　等
无机盐 组成细胞结构和许多化合物，调节生命活动；某些化能自养菌的能源 如磷酸盐等无机化合物
(2)培养基的其他条件：满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2等的需求。
培养微生物种类 特殊要求
乳酸杆菌 培养基中添加　维生素　
霉菌 培养基的pH调至　酸性　
细菌 培养基的pH调至　中性或弱碱性　
厌氧微生物 需要提供　无氧　的条件
? 深 度 指 津
不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。如，自养型微生物所需的营养物质主要是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源、氮源主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
知识2　无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是　防止杂菌污染　。无菌技术主要包括：　消毒　和　灭菌　。
1．消毒和灭菌
项目 消毒 灭菌
概念 使用较为　温和　的物理、化学或生物等方法杀死物体　表面　或内部一部分微生物 使用　强烈　的理化方法杀死物体内外　所有　的微生物，包括　芽孢和孢子　
常用 方法 　煮沸　消毒法、巴氏消毒法、　酒精　消毒法、紫外线消毒法 　湿热　灭菌(如高压蒸汽灭菌法)、干热灭菌、　灼烧　灭菌
区别 最大区别在于是否杀死芽孢和孢子
2．三种灭菌方法的比较
方法 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌
媒介 沸水、流通蒸汽或高压蒸汽 热空气 火焰的充分燃烧层
方法 高压蒸汽灭菌：100 kPa、121 ℃，维持15～30 min 160～170 ℃、1～2 h 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
对象 　培养基　等 耐高温的和需要保持干燥的物品，如　玻璃器皿　、　金属用具　等 　接种工具　、试管口、瓶口等
原理 高温或高温、高压使蛋白质　变性失活　，导致微生物活体以及芽孢和孢子全部死亡
3．操作对象或注意点
(1)对实验操作的　空间　、操作者的衣着和手进行清洁和　消毒　。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行　灭菌　。(但是不耐高温的培养基或成分可采用其他方法除菌，如血清可通过过滤除菌。)
(3)为了避免周围环境中微生物的污染，许多实验操作都应在超净工作台并在　酒精灯火焰　附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与　周围的物品　接触。
? 解 疑 释 惑
教材中的高压蒸汽灭菌锅利用的是湿热灭菌原理。关于手动式高压蒸汽灭菌锅的使用如下：
操作步骤 操作要领
① 加水 向外层锅内加水(蒸馏水或纯化水)，水面达到水位标记线即可(水量过少会烧干)
② 装锅 将待灭菌物品放在灭菌桶中(不要装得太满，至少留　1/3　空间)，加盖，　对称　旋紧固定螺栓
③ 加热排气 加热灭菌锅，打开排气阀，等冷空气　充分排出　后，关闭排气阀(否则压强达标时，温度上不去，蒸汽的穿透力低，影响灭菌效果)
④ 保温保压 100 kPa、121 ℃下，15～30 min(苏教版为103 kPa、121 ℃下15～20 min)
⑤ 出锅 压力表指针降至“0”点，温度下降后，再打开排气阀
思辨小练
判断下列说法的正误：
(1)液体培养基含有水，而固体培养基不含水。(　×　)
提示：液体培养基和固体培养基含量最多的物质均是水，它们的区别为是否含有凝固剂。
(2)(2024·江苏卷T9A)酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌。(　×　)
提示：酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌。
(3)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒。(　×　)
提示：平板涂布时，涂布器使用前必须进行灭菌处理，以防止外来杂菌的污染。
(4)不含氮源的平板不能用于微生物培养。(　×　)
提示：不含有氮源的平板可用来培养能利用空气中氮气的微生物。
(5)对接种环灼烧灭菌时，只需要在酒精灯火焰上烧红环状部分。(　×　)
提示：需要灼烧接种环的金属部分以及手柄，凡是能够深入试管的部分都需要灼烧灭菌。
(6)(2024·天津卷T8B)根据菌落外表特征可判断分离酵母菌的固体培养基是否被毛霉污染。(　√　)
提示：酵母菌是单细胞真菌。毛霉属于多细胞真菌，由细胞形成菌丝。可根据菌落外表特征判定固体培养基是否被毛霉污染。
典 题 精 析
考向1　微生物的培养基
(2025·连云港一调)“细菌喜荤，霉菌喜素”，一般来说，在培养细菌时，需添加动物性营养物质，如蛋白胨等；而在培养霉菌时，一般需要添加植物性营养成分，如豆芽汁等。下列相关叙述错误的是(　B　)
A．蛋白胨为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质
B．分别培养细菌和霉菌时，需将培养基调节至适宜的pH，并保持良好的通气
C．细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同
D．若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂等物质
解析：蛋白胨富含营养物质，为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质，A正确；细菌有的是需氧型，有的是厌氧性，所以在培养细菌和真菌时，要根据微生物的代谢类型，来确定是否保持良好的通气，B错误；酶具有专一性，细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同，C正确；在固体培养基上能形成菌落，若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂，D正确。
考向2　无菌技术
(2025·无锡期中)无菌操作是微生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　B　)
A．配制培养基、倒平板、接种均需在酒精灯火焰旁进行
B．玻璃器皿、金属用具可采用干热灭菌法进行灭菌
C．倒平板后敞开皿盖用吹风机冷风加速培养基凝固
D．配制好的培养基先分装到培养皿中再进行灭菌
解析：配制好的培养基需要灭菌，故配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行，A错误；干热灭菌法适用于耐高温且需保持干燥的玻璃器皿、金属用具等，B正确；倒平板后若敞开皿盖并用吹风机冷风吹，会增大杂菌污染的风险，正确操作应为倒平板后立即盖上皿盖，C错误；培养基配制后应先高压蒸汽灭菌，再趁热倒入培养皿中，若先分装再灭菌，可能导致灭菌不彻底或培养基受热不均，D错误。
考点2　微生物的基本培养技术
考 点 剖 析
知识1　微生物的纯培养
1．相关概念
培养物 接种于　培养基　内，在合适条件下形成的含　特定种类微生物　的群体
纯培养物 由　单一个体繁殖　所获得的微生物群体
纯培养 获得　纯培养物　的过程
2．酵母菌的纯培养
(1)菌落：分散的微生物在适宜的　固体培养基　表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的　子细胞群体　。
(2)获得单菌落的两种常用方法：　平板划线法　和　稀释涂布平板法　。
(3)酵母菌的纯培养步骤
? 解 疑 释 惑
平板倒置培养的目的主要有：既可以　防止皿盖上水珠落入培养基　造成污染，又可以　避免培养基中的水分过快地挥发　，等等。
知识2　分离纯化，获得单菌落的两种方法
1．纯化方法
A B
(1)图A可表示用　平板划线　法接种获得的平板，菌体的分离是通过　连续划线　操作实现的。
(2)图B可表示用　稀释涂布平板　法接种获得的平板，菌体的分散是通过一系列的　梯度(等比)稀释　操作实现的。
(3)获得图A用到的接种工具是接种环，而图B是　涂布器　。图A、B都可用于观察菌落特征。
2．平板划线的具体操作
①将接种环放在火焰(外焰)上灼烧，直到接种环的金属丝烧红
↓
②在火焰旁冷却接种环(防止　温度过高杀死菌种　)。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
↓
③将试管口通过火焰
↓
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
↓
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
↓
⑥在火焰附近将皿盖　打开一条缝隙　(不能完全打开，防止　杂菌污染　)，用接种环在培养基表面迅速划　三至五条平行线　，盖上皿盖
↓
⑦灼烧接种环，待其　冷却　后，从第一次划线的　末端　开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将　最后一次　的划线与第一次的划线相连
? 解 疑 释 惑
灼烧接种环的目的
①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染　培养物　；②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线　末端　；③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
思辨小练
1．判断下列说法的正误：
(1)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(　×　)
(2)转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线。(　√　)
(3)平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。(　√　)
(4)接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃。(　×　)
提示：接种后未长出菌落的培养基也可能有少量微生物，应灭菌后再丢弃。
2．如何判断在制备和培养过程中，培养基是否被污染？
提示：设置一组未接种微生物的空白培养基，与接种了微生物的平板放在相同的条件下培养，若空白培养基上未长出菌落，说明培养基未被污染。
典 题 精 析
考向　微生物的纯培养
(2025·江苏卷)从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是(　B　)
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
解析：制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，紫外线用于消毒，A错误；将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确；连续划线时，每次应从上次划线的末端开始，以逐步稀释菌体，若从起始端开始则无法有效分离单菌落，C错误；斜面培养基保存菌种应置于4 ℃短期保存，长期保存菌种应使用甘油管藏法(－20 ℃)，D错误。
(2025·泰州靖江期中)实验小组对酿酒酵母菌进行平板划线的纯培养操作，下列有关叙述正确的是(　D　)
A．将配制好的马铃薯琼脂培养基放入干热灭菌箱内灭菌
B．在酒精灯火焰附近，将培养皿盖完全打开后倒入培养基
C．从第一次划线的末端开始到第二次划线结束，即完成接种
D．将接种后的平板和未接种的平板倒置，放入恒温培养箱中培养
解析：将配制好的马铃薯琼脂培养基放入高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌，A错误；在酒精灯火焰附近，将培养皿的皿盖打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿，B错误；从第一次划线的末端开始第二次划线，重复该操作，一般再做第三、四、五次划线，以便于得到单菌落，C错误；将接种后的平板和一个未接种的空白平板倒置，放入恒温培养箱中进行培养，其中设置空白平板的目的是检验培养基灭菌是否合格，D正确。
考点3　微生物的选择培养和计数
知识1　微生物的选择培养
1．选择培养的作用原理：人为提供　有利于目的菌生长　的条件(包括营养、温度、pH等)，同时　抑制或阻止其他微生物的生长　。
2．稀释涂布平板法操作过程
取样，将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的瓶中，摇匀，取　1_mL上清液　加入盛有　9_mL无菌水　的试管中，依次　等比稀释　。从最后一支试管中取　0.1_mL　菌液滴加到培养基表面进行涂布。如下图所示：
(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液器枪头等均需　灭菌　；操作时，试管口和移液器应在离火焰 1～2 cm处。
(2)涂布平板时：①　涂布器　用体积分数为70%的酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上　灼烧　；②不要将　过热　的涂布器放入盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液器枪头不要接触任何物体；④培养皿盖不能完全打开，应只打开一条缝隙。
? 概 念 辨 析
分离纯化菌种的两种方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种用具 接种环 涂布器
分离结果
单菌落的获得 单菌落从后划线的区域挑取 只有达到合适的稀释度才能得到单菌落
应用 都会在培养基表面形成单菌落，达到分离纯化微生物的目的；都可用于观察菌落特征
不能用于微生物的计数 可对微生物进行计数
其他共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可以在培养基上形成由单个微生物繁殖而来的纯培养物——单菌落
知识2　微生物的计数
1．测定微生物数量常用的方法
方法 间接计数法(　稀释涂布平板　法、活菌计数法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的　菌落数　，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的血细胞计数板(常用于较大的真核细胞，如酵母菌、霉菌孢子等，及某些较大的原核细胞)或　细菌计数板　(常用于相对较小的细菌等)，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌体数：C×M÷V C：某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数；M：稀释倍数；V：涂布所用的稀释液体积数(mL) 每毫升原液所含细菌数：①每小格平均细菌数×400×10 000×　稀释倍数　；②5(或4)个中方格的菌体数×5(或4)×10 000×稀释倍数
结果 比实际值偏　小　，因为　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落　(因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示) 比实际值偏　大　，因为此法　不能区分活菌和死菌　
注：稀释涂布平板法计数中，为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板(平行重复原则，增强实验的说服力和准确性)，计算菌落平均数。另外，为了保证结果准确，一般选择同一稀释度的、菌落数在　30～300　的平板进行计数。
? 深 度 指 津
(1)微生物的计数方法非常多样，应根据实际情况选择合适的方法。涉及一些新的微生物计数方法，应根据具体情境，弄清其背后的原理。列举两个其他计数方法：
①比浊法：随着微生物的繁殖，液体培养基的浑浊程度会增加，因此可根据液体培养物的浑浊程度来估计微生物的数量，通常使用分光光度计测定光的透过率。
②实时荧光定量PCR (qPCR)：通过定量PCR技术检测特定微生物的DNA，可以精确测定微生物的数量。
(2)稀释涂布平板法用于微生物分离时不需要平板上菌落数在30～300；稀释涂布平板法用于筛选基因工程转化的细胞时，不一定需要再次平板划线处理，可以直接PCR扩增以获得阳性克隆的细胞；如果平板划线法用于纯化微生物时，需要多次平板划线操作，以减少一个菌落是由2个或多个连在一起的微生物细胞繁殖而来的概率。
2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成　脲酶　，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到　催化　作用。
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
(2)分离方法：利用以　尿素　为唯一氮源的选择培养基进行选择培养。
(3)鉴定方法：在培养基中加入　酚红　指示剂，指示剂变红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌。
(4)统计菌落数目：统计样品中的活菌数一般用　稀释涂布平板　法。
(5)实验流程：土壤取样→　样品的稀释　→微生物的培养与观察→细菌的　计数　。
3．分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
? 概 念 辨 析
选择培养基和鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 人为提供目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品，产生特定的颜色或其他变化
用途 从众多微生物中分离所需微生物(目的菌) 鉴别不同种类的微生物
举例 ①加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌； ②以尿素为唯一氮源，分离出分解尿素的微生物 ①以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂； ②利用刚果红染色法筛选分解纤维素的微生物(出现以纤维素分解菌为中心的透明圈)； ③用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色，并有金属光泽)
注：鉴定微生物，除了利用表中的鉴别培养基进行如指示剂鉴别、染色鉴别等方法，还可以根据菌落特征鉴别，即根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
思辨小练
判断下列说法的正误：
(1)(2024·江苏卷T9C)可用稀释涂布平板法对酵母菌计数。(　√　)
(2)同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值。(　√　)
(3)利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。(　√　)
(4)“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中，土壤取样时需要对纸袋和铁铲都预先灭菌。(　√　)
(5)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(　×　)
(6)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(　×　)
典 题 精 析
考向1　微生物的选择培养和计数
(2026·海安开学考)环丙沙星是一类高效的广谱抗菌药物，某科研团队通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解环丙沙星能力强的菌株。相关叙述错误的是(　C　)
A．逐步提高培养基中环丙沙星的浓度有助于获得高耐受的菌株
B．用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面
C．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
D．使用过的培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃
解析：逐步提高环丙沙星浓度可对菌株施加选择压力，保留高耐受的突变菌株，符合选择培养的原理，A正确；稀释涂布平板法的操作中，需用灭菌后的涂布器将菌液均匀涂布于培养基表面，B正确；筛选特定微生物时，涂布后的平板上的菌落数不一定要在30～300，C错误；实验后的培养基可能含有残留菌体，需高压蒸汽灭菌以防止污染环境，D正确。
(2025·湖南卷)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是(　B　)
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
解析：稀释涂布平板法可通过菌落数进行计数，而平板划线法仅用于分离纯化菌种，无法计数，A错误；平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照，以验证培养基灭菌是否彻底，B正确；醋酸菌为严格好氧菌，进行有氧呼吸，C错误；筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源，蛋白胨中也含有氮元素，可作为氮源，则无法筛选目标菌，D错误。
考向2　微生物培养的应用
(2025·山东卷)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是(　D　)
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 － ＋ －
② 常压 ＋ － －
③ 高压 － ＋ －
④ 高压 ＋ － ＋
注： “＋”表示有，“－”表示无。
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
解析：平板划线法可用来分离和纯化微生物，不可用于计数，A错误；制备培养基过程中，先灭菌，再倒平板，B错误；②组为常压＋纤维素，结果无菌落，而④组为高压＋纤维素，结果有菌落，说明在以纤维素为碳源的条件下，该菌不能在常压下生长，而能在高压下生长，C错误；③④组形成了一个对照实验，自变量是碳源种类，实验结果表明，在高压条件下，该细菌可以利用纤维素生长(组④)，但不能利用淀粉生长(组③)，D正确。
? 深 度 指 津
选择培养基——4种常见制备方法或实例
一、 单项选择题
1．(2025·镇江开学考)关于培养基的配制和使用，下列叙述正确的是(　D　)
A．固体培养基配制后，需采用干热灭菌法以便杀灭所有微生物
B．倒平板时，需将培养皿盖完全打开，以便将培养基快速倒入培养皿
C．平板划线时，需将菌种埋入培养基内以便其充分吸收营养物质
D．涂布平板后，需待菌液被培养基吸收后再倒置培养，以防止菌液滴落
解析：常采用高压蒸汽灭菌法对配制的固体培养基进行灭菌，以便杀灭所有微生物，A错误；倒平板时，不能将灭过菌的培养皿盖完全打开，而是将培养皿盖打开一条缝隙，待倒入培养基后将培养皿盖盖上，B错误；平板划线时，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，不能将菌种埋入培养基内，C错误。
2．(2025·苏锡常镇一调)关于微生物培养中的无菌操作，下列叙述正确的是(　A　)
A．倒平板时，可将培养皿打开稍大于瓶口的缝隙倒入培养基
B．平板凝固后，可将其置于干热灭菌箱中继续灭菌1～2 h
C．接种室使用前，应在对其进行紫外线照射同时适量喷洒苯酚
D．接种时，接种环灼烧后立即在平板表面快速划线
解析：倒平板时，在酒精灯火焰附近打开培养皿，形成稍大于瓶口的缝隙，可确保培养基顺利倒入并减少杂菌污染，A正确；培养基需在倒平板前灭菌(如高压蒸汽灭菌)，凝固后的平板不能再进行干热灭菌，否则会破坏培养基成分，B错误；紫外线消毒可用于物体表面或接种室、接种箱内空气消毒，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果，C错误；灼烧后的接种环需冷却后再接触菌种，否则高温会杀死微生物，D错误。
3．(2026·徐州期中)关于土壤中分解尿素的细菌分离、计数的实验，下列叙述正确的是(　D　)
A．配制以尿素为唯一氮源的鉴别培养基分离细菌
B．灭菌后的培养基需冷却至室温后在超净台内倒平板
C．接种环经火焰灼烧灭菌冷却后，在平板上涂布菌液
D．显微镜计数法比稀释涂布平板法计数更快速、直观
解析：配制以尿素为唯一氮源的培养基属于选择培养基，用于筛选能分解尿素的细菌，A错误；灭菌后的培养基需冷却至约50 ℃时倒平板，若冷却至室温会导致琼脂凝固无法倾倒，B错误；涂布法使用无菌涂布器将菌液均匀涂布于培养基表面，而接种环用于平板划线法，C错误；显微镜计数法(如血细胞计数板)直接观察计数，比稀释涂布平板法更快速、直观，D正确。
4．(2026·南京期初)某研究小组通过实验来探究某种病原微生物对四种抗生素的敏感程度。图1为部分实验器材；图2中的Ⅰ～Ⅳ是将浸有相同浓度但不同种类抗生素的四个大小相同的滤纸片，分别贴在均匀涂布了测试菌的平板上培养一段时间后的结果。下列叙述正确的是(　D　)
,①　,②　,③　,④
图1
图2
A．接种测试菌的过程中，需要使用图1中器材①②③
B．图2结果Ⅱ中抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C．图2结果Ⅳ中离滤纸片越近的菌落对该抗生素的抗性越强
D．不同抗生素在平板上的扩散速度属于实验的无关变量
解析：接种测试菌的过程中，使用的是涂布法，使用图1中的①酒精灯、③培养皿、④涂布器，②接种环用于平板划线法，不需要②，A错误；图2结果中Ⅱ抑菌圈较小，说明病原微生物对该抗生素的敏感性较低，B错误；抑菌圈中的菌落是涂布接种时的菌体形成的，菌落离滤纸片的距离与对该抗生素的抗性之间并无必然联系，C错误；应等各滤纸片上的抗生素不再扩散后再观察实验结果，故不同抗生素在平板上的扩散速度属于实验的无关变量，D正确。
5．(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是(　D　)
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
解析：以金霉素为唯一碳源的选择培养基，仅允许能利用金霉素的微生物生长，其他无法利用金霉素的微生物被抑制，符合选择培养基的设计原理，A正确；逐步提高金霉素浓度可模拟环境胁迫，筛选出耐受性更强的菌株(类似“驯化”过程)，B正确；培养基的pH需根据目标微生物的生长需求调整(如细菌通常中性偏碱，真菌偏酸性)，是配制培养基的基本要求，C正确；稀释涂布平板法需用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，而接种环用于平板划线法(分离单菌落)，用接种环涂布无法保证菌液均匀，D错误。
6．(2025·南京六校联考)筛选具有优良性状菌种的一般步骤为样品采集→富集培养→分离纯化→性能测定，如图a、b是采用两种接种方法接种后纯化培养的效果图。下列叙述错误的是(　B　)
a b
A．对采集的样品进行富集培养时，应选择液体培养基
B．获得图a所示结果的接种过程中，每次划线前接种环都需蘸取菌液
C．图a、b接种方法都可用于分离微生物，但并不是都能用于微生物计数
D．若图b培养基以尿素为唯一氮源，则可用于分离能合成脲酶的细菌
解析：在液体培养基中微生物可与营养物质充分接触，所以对采集的样品进行富集培养时应选用液体培养基，A正确；图a为采用平板划线法分离微生物获得单菌落的结果图，接种环只需在第一个区域划线前蘸取一次菌液，其后的划线都从前一次的末端开始，B错误；图b采用的接种方法是稀释涂布平板法，平板划线法和稀释涂布平板法都可用于分离微生物，但平板划线法不能用于微生物的计数，C正确；能分解尿素的细菌(能合成脲酶)能够在以尿素为唯一氮源的培养基上生长和繁殖，D正确。
7．(2025·南通一模)解钾菌能将土壤中难溶性含钾化合物分解，转变为可溶性化合物。下表是研究人员从餐厨垃圾废液中筛选解钾细菌的培养基配方，相关叙述正确的是(　C　)
成分 钾长石粉 蔗糖 Na2HPO4 CaCO3
含量/(g·L-1) 10 10 2.0 1.0
成分 (NH4)2SO4 NaCl 酵母膏 MgSO4·7H2O
含量/(g·L-1) 1.0 0.1 0.5 0.5
A．培养基中的钾长石粉属于可溶性钾，为目的菌提供无机盐
B．按表中配方配制好的培养基应先灭菌再将pH调至弱碱性
C．餐厨垃圾废液梯度稀释后涂布于选择培养基表面倒置培养
D．应选择透明圈直径与菌落直径比值较小的菌落进一步进行纯化
解析：根据题表信息可知，培养基中的钾长石粉属于难溶性钾，A错误；配制好的培养基应先调pH再灭菌，B错误；选择溶钾圈(透明圈)直径与菌落直径比值较大的菌落进一步进行纯化，D错误。
8．下列关于细菌和酵母菌实验的叙述，正确的是(　A　)
A．通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比
B．通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大
C．通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌
D．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定
解析：通常细菌的生长速度比酵母菌快，酵母菌菌落比细菌菌落大而厚，B错误；培养基含有丰富的营养物质，易被杂菌污染，酵母菌和细菌培养基都可以用高压蒸汽灭菌法灭菌，而过滤除菌法是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，一般用于不耐高温的物体的除菌，C错误；血细胞计数板可用于酵母菌的数量测定，细菌计数板可用于细菌等较小的细胞的计数，D错误。
9．(2025·贵州卷)金龟子绿僵菌(Ma)是一种昆虫病原真菌，可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子(单细胞后代)萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素，导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是(　D　)
A．可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B．为分离Ma，可从研磨的僵虫组织中取样
C．稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D．接种培养Ma时使用的器具需消毒
解析：金龟子绿僵菌(Ma)作为昆虫病原真菌，可通过寄生导致害虫死亡，符合微生物杀虫剂的特点，可用于生物防治，A正确；僵化死亡的昆虫体内含有大量Ma菌体，因此从研磨的僵虫组织取样是分离Ma的合理方法，B正确；稀释涂布平板法可通过梯度稀释和菌落形成来分离纯化微生物，适用于分离样品中的Ma，C正确；微生物培养中，接种环等直接接触菌种的器具需严格灭菌(如灼烧灭菌)，消毒无法彻底杀灭微生物的芽孢或孢子，D错误。
10．(2025·如皋2.5适应考)研究人员用刚果红培养基从蔗渣堆肥中筛选、分离出4株具有降解纤维素能力的真菌(图示①～④)。下列说法正确的是(　A　)
A．不宜通过接种蒸馏水检测所配制的固体培养基是否被污染
B．图示结果为采用平板划线法接种后倒置于恒温箱中静置培养的结果
C．④号真菌的红色圈与菌落的直径比值最大，降解纤维素的能力最强
D．采用稀释涂布平板法对①～④菌株分离培养24 h后进行计数
解析：检测所配制的固体培养基是否被污染，应接种无菌水，A正确；图示结果中菌落分布均匀，应为采用稀释涂布平板法接种后倒置于恒温箱中静置培养的结果，B错误；刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，在菌落周围会出现透明圈(即红色圈消失)，透明圈与菌落的直径比值越大，说明该菌降解纤维素的能力越强，C错误；可采用稀释涂布平板法对微生物进行分离培养，真菌需要培养较长时间，等菌落充分生长后再进行计数，24 h可能时间过短，菌落生长不充分，导致计数不准确，D错误。
二、 多项选择题
11．(2025·徐州期中改编)下列关于消毒与灭菌的方法和原理的叙述，正确的有(　BD　)
A．牛奶、啤酒一般采用巴氏消毒法，即在80～90 ℃处理30 min
B．对培养皿进行灭菌处理既可用高压蒸汽灭菌法，也可用干热灭菌法
C．高压蒸汽灭菌锅内残留少量冷空气有助于提高蒸汽温度，增强灭菌效果
D．干热灭菌通过破坏核酸与蛋白质的氢键导致微生物的死亡
解析：对于牛奶这些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法，即在63～65 ℃消毒30 min或72～76 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s，不仅可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，还基本上不会破坏牛奶的营养成分，A错误；用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌时，开始阶段需打开排气阀排尽锅内冷空气，否则灭菌的温度可能达不到要求，C错误。
12．(2025·河北卷)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻，可用于DHA的发酵生产。下列叙述正确的有(　ACD　 )
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量
解析：根据题目信息“隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖”可知，隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源，A正确；采集海水中腐烂的叶片进行湿热灭菌后，会杀死所有的微生物，包括隐甲藻，此时接种到固体培养基上无法获得隐甲藻，B错误；根据题目信息可知，隐甲藻为真核生物，抗生素可通过抑制细菌细胞壁合成或影响代谢过程来抑制细菌生长，不会影响真核生物的生命活动，因此在筛选或培养隐甲藻时，加入抗生素可有效抑制细菌等杂菌生长，提高隐甲藻的纯度和生长效率，C正确；根据题目信息可知，隐甲藻为好氧生物，因此利用隐甲藻进行DHA发酵生产时，适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量，D正确。
13．(2026·南通期初)为从酸笋发酵液中筛选出能降解胆固醇的乳酸菌，研究人员进行了如下实验，其中乳酸能溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈。相关叙述正确的有(　BC　)
A．过程②通常需要轻微振荡，其目的是增加培养液中的溶解氧
B．过程③将适当温度的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养
C．与过程②相比，过程④培养基中特有的成分有琼脂、碳酸钙等
D．可根据D/d比值筛选出降解胆固醇能力强的菌种以进行后续研究
解析：过程②为富集培养，目的是增加菌体数量，所用培养基为液体培养基，培养过程轻微振荡有利于菌体与培养基的充分接触，乳酸菌为厌氧菌，代谢不需要氧气，A错误；过程③平板倾注分离时，应先取合适稀释度的少量菌液加至无菌培养皿中，再将已降至适宜温度的培养基倒入培养皿并轻轻混匀，凝固后需要倒置培养，以避免皿盖上水滴滴落对菌落生长产生影响，B正确；过程④需要观察菌落，所用培养基为固体培养基，因此需添加凝固剂琼脂，且需要出现透明圈，已知乳酸能溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，故培养基上还需要添加碳酸钙，C正确；乳酸菌发酵产生的乳酸能与碳酸钙发生反应，使菌落周围出现透明圈，因此可根据D/d比值筛选出产生乳酸能力强的菌种，D错误。

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