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微专题7　PCR技术与电泳相关问题
一、PCR技术及应用
1．PCR扩增过程中的循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物 1(或2) 的DNA 分子数 1 3 7 2n－1
同时含 引物1、 2的DNA 分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
3．重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5．融合PCR技术与融合蛋白
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。
1．(2025·湖北武汉期末)重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。过程如下图，下列叙述不正确的是(　　)
A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多
B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中
C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行一次PCR，共产生4种DNA
D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制
C　[G与C间形成三个氢键，引物中G、C的含量越高，与模板链形成的氢键越多，复性温度设置得越高；当设置温度过低时，会造成引物与模板链的结合位点增加，导致非特异性条带增多，A正确。由图可知，引物2和引物3分别与目的基因两条链的对应位置结合，因此二者之间存在互补配对片段，为防止扩增时引物2与引物3之间进行配对，需将其置于不同反应系统中，B正确。引物1和2位于一个反应系统中，引物3和4位于另一个反应系统中，这两个反应系统均进行1次复制，由引物1扩增的DNA与引物4扩增的DNA相同，因此只能产生3种双链DNA分子，即引物1(或4)扩增的双链DNA，引物2扩增的双链DNA，引物3扩增的双链DNA，C错误。引物2与目的基因的相应模板链结合后延伸，可形成一个双链不等长的DNA分子，该DNA分子中引物2所在的那条链再与引物1结合即可扩增获得同时含有引物1和引物2的双链等长的DNA分子，如图中所示，因此至少需要经过2次复制，D正确。]
2．(2025·安徽芜湖模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B．设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降
C．PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
C　[DNA子链合成的方向为5′端到3′端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降，B正确；PCR产物是链状DNA分子，扩增产物还需要经过限制酶切割后再用DNA连接酶连接才能形成环状，C错误；整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶，D正确。]
3．(2025·山东潍坊模拟)融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来(如图)。下列说法错误的是(　　)
A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA
B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系
C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物
D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4
D　[经过n次复制后，不符合要求的(就是两条链不等长的DNA)共有2n个，而总的DNA为2n，所有经过n轮循环后，等长的DNA为2n－2n＞0，即n≥3，所以基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA，A正确。在融合PCR 技术里，基因甲扩增依赖引物 P1、P2，基因乙扩增依赖引物 P3、P4。不同基因扩增所需引物特异性结合各自模板链，且反应条件(如引物与模板的适配性等)有差异，若放入同一反应体系，引物间易相互干扰(P2和P3存在互补序列)，无法精准、高效完成基因甲、乙的各自扩增，所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系，B正确。结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，C正确。若融合PCR获得了64个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，那么该过程消耗引物P1和P4共64×2－2＝126个，即该过程消耗了126÷2＝63个引物P4，但在融合PCR的第一步前还进行了一次利用引物P4扩增DNA链的过程，所以该过程共消耗63＋1＝64个引物P4，D错误。]
二、电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率与核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等有关。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同核苷酸数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同的切割位点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同的切割位点，每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
4．(2025·全国课标卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
D　[配制琼脂糖凝胶时选用适当的缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确。电泳时，样品向＋极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确。电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、构象等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确。甲只有限制酶R的一个酶切点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段(2个条带)，这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。]
5．(不定项)(2025·河北邯郸模拟)肾上腺脑白质营养不良(ALD)是一种伴X染色体的隐性遗传病(致病基因用a表示)，女性杂合子中有5%的个体会患病。图1为某ALD患者家族系谱图，提取该家族中三名女性与此病有关的基因进行PCR，产物酶切后电泳结果如图2所示(正常基因含一个限制酶切点，突变基因增加了一个酶切位点)。下列叙述正确的是(　　)
A．若不考虑基因突变，Ⅱ-4的基因型只能是XAXa
B．a基因比A基因多一个酶切位点是因为发生了碱基的缺失
C．Ⅱ-3患病的原因可能是两条X染色体中的一条失活，导致A基因不能表达
D．若Ⅱ-1基因型与Ⅱ-5相同，则Ⅱ-1与Ⅱ-2后代患ALD的概率为2.5%
ACD　[根据题意，Ⅰ-1基因型为XAXa，Ⅰ-2基因型为XAY，由于Ⅱ-4患病，若不考虑基因突变，Ⅱ-4的基因型只能是XAXa，A正确；结合题干信息，分析图2可知，正常基因酶切后可形成长度为310 bp和118 bp的两种DNA片段，而突变基因酶切后可形成长度为217 bp、118 bp和93 bp的三种DNA片段，217 bp和93 bp之和为310 bp，正常基因与突变基因碱基对数一样，所以a基因比A基因多一个酶切位点是因为发生了碱基的替换，B错误；由图2可知，Ⅱ-3基因型为XAXa，所以患病的原因可能是两条X染色体中的一条失活，即含有A基因的X染色体失活，导致A基因不能表达而患病，C正确；若Ⅱ-1基因型与Ⅱ-5相同，为XAXA，则Ⅱ-1与Ⅱ-2所生女孩的基因型为XAXa，男孩的基因型为XAY，由于女性杂合子中有5%的个体会患病，因此后代患ALD的概率为1/2×5%＝2.5%，D正确。]
1 / 8微专题7　PCR技术与电泳相关问题
一、PCR技术及应用
1．PCR扩增过程中的循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物 1(或2) 的DNA 分子数 1 3 7 2n－1
同时含引 物1、2的 DNA分子数　　　 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
3．重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5．融合PCR技术与融合蛋白
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。
1．(2025·湖北武汉期末)重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。过程如下图，下列叙述不正确的是(　　)
A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多
B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中
C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行一次PCR，共产生4种DNA
D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制
2．(2025·安徽芜湖模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B．设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降
C．PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
3．(2025·山东潍坊模拟)融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来(如图)。下列说法错误的是(　　)
A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA
B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系
C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物
D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4
二、电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率与核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等有关。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同核苷酸数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同的切割位点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同的切割位点，每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
4．(2025·全国课标卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
5．(不定项)(2025·河北邯郸模拟)肾上腺脑白质营养不良(ALD)是一种伴X染色体的隐性遗传病(致病基因用a表示)，女性杂合子中有5%的个体会患病。图1为某ALD患者家族系谱图，提取该家族中三名女性与此病有关的基因进行PCR，产物酶切后电泳结果如图2所示(正常基因含一个限制酶切点，突变基因增加了一个酶切位点)。下列叙述正确的是(　　)
A．若不考虑基因突变，Ⅱ-4的基因型只能是XAXa
B．a基因比A基因多一个酶切位点是因为发生了碱基的缺失
C．Ⅱ-3患病的原因可能是两条X染色体中的一条失活，导致A基因不能表达
D．若Ⅱ-1基因型与Ⅱ-5相同，则Ⅱ-1与Ⅱ-2后代患ALD的概率为2.5%

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