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专题35　微生物的培养与应用
真题回放
1．（2016年江苏卷，10）定量分析是科学研究的重要方法。下列能用血细胞计数板直接计数的是（　　）
A．海拉细胞悬液
B．浓缩培养的噬菌体
C．自来水中大肠杆菌
D．蛙卵
【答案】A
2．（2016年江苏卷，25）漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（　　）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，在通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
【答案】BC
【解析】生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选生活污水中含有大量微生物，B正确；在涂布平板上长出的菌落，在通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
3．（2015年江苏卷，19）做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（　　）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
【答案】D
4．（2017年江苏卷，31）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有___________。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐____________。以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_____________。
（3）下图为连续划线法示意图，在图中_____________
（填图中序号）区域更易获得单菌落。
　　　　　　　　　　
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1
~5号比色管的苯酚浓度应分别为_____________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度（mg/
L）
1
如果废水为50
mg/
L
苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释___________（填序号：①5
②10
③20）倍后，再进行比色。
【答案】（1）蛋白胨、苯酚
（2）增加　　稀释涂布　　凝固剂
（3）③
（4）
0、0.2、0.4、0.6、0.8　　③
【解析】（1）碳源是微生物生长的一类营养物，是含碳化合物，其中可作为碳源的有蛋白胨和苯酚。
（2）将采集到的样品接种培养的目的是富集酚降解菌，则苯酚用量应随转接次数增加而逐渐增加。平板中菌落过于密集，说明菌种密度过大，应进一步稀释。平板培养基呈固态，应向其中添加凝固剂。
（3）下一次划线的起始端是上次划线的末端，随着划线的进行，菌种的密度越来越小，更易形成单菌落，故③区域更易获得菌落。
（4）1号管为空白对照管，不加苯酚，6号管中苯酚浓度为1
mg/L，2~6号管苯酚浓为0~1
mg/L，可判断浓度梯度为0.2
mg/L，则2~5号管中苯酚浓度分别是0.2、0.4、0.6、0.8mg/L。废水中苯酚溶液浓度为50
mg/
L，降解后约有21%的苯酚残留，则苯酚溶液浓度为10.5
mg/L，由于制作的比色管中苯酚浓度介于0~1
mg/L间，则残留液需稀释20倍后，再进行比色。
5．（2016年新课标Ⅰ卷，39）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题:
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。
（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。
【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
（3）污染不正确
（2）依题意可知，该实验的目的是：用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。所以步骤③中，实验组的操作是：将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间，以收集教室不同高度空气中的微生物。
（3）设置的空白对照组，在整个实验过程中没有用来收集空气中的微生物，若空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，说明培养基的配制是不成功的，在此次调查中出现了污染现象，所以若将30（即36－6）/平板作为本组菌落的平板值，该做法不正确。
6．（2016年四川卷，10）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以＿＿＿＿＿＿＿＿为唯一氮源；鉴别培养基还需添加＿＿＿＿＿作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成＿＿＿＿＿色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是＿＿＿＿＿，每克土壤样品中的细菌数量为＿＿＿＿＿×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较＿＿＿＿＿。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为＿＿＿＿＿，突变基因表达的蛋白质含＿＿＿＿＿个氨基酸。
【答案】（1）尿素　　酚红　　红
（2）稀释涂布平板法　　1.75　　少
（3）UGA　　115
7．（2015年江苏卷，31）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题:
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是＿＿＿＿＿＿（填序号）。
①酒精灯②培养皿③显微镜④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见下图）。图中降解圈大小与纤维素酶的＿＿＿＿＿有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是＿＿＿＿＿＿＿（填图中序号）。
　　　　　　　　　　　
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株
J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株＿＿＿＿＿更适合用于人工瘤胃发酵，理由是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
【答案】（1）③
（2）培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果
（3）避免培养基污染棉塞
（4）量与活性①
（5）J4发酵过程中会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
模拟演练
1．（甘肃省高台县第一中学2016-2017学年高三上学期期末考试生物试题）下列关于微生物的分离和培养的有关叙述，错误的是（　　）
A．微生物培养前，需对培养基进行消毒
B．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
C．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
【答案】A
【解析】消毒只能杀死部分微生物，不能杀死芽孢和孢子，所以微生物培养前，需对培养基进行灭菌，消灭所有的微生物以及芽孢和孢子，A错误；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度，将微生物分离开来，使形成的菌落来自一个微生物，B正确；测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法，也可用显微镜直接计数法，C正确；分离能分解尿素的细菌，应用选择培养基，以尿素作为培养基中唯一的氮源，D正确。
2．（江苏省如皋市2018届高三上学期开学考试生物试题）微生物的实验室培养要用到基础培养基，但培养不同的微生物还需满足其生长、繁殖的特殊需求。下列有关说法正确的是（　　）
A．培养霉菌时需将培养基的pH值调至碱性
B．培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素
C．在基础培养基中添加纤维素用于筛选能分解纤维素的菌种
D．培养酵母菌时需要提供无氧的条件
【答案】B
3．（江苏省常州市田家炳中学2018届高三开学摸底调研生物试题）下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列有关叙述正确的是（　　）
　　　
A．步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止水蒸气落在培养基上造成污染
B．步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C．步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数
D．步骤④是将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌的菌落
【答案】B
4．（辽宁省辽河油田第二高级中学2016-2017学年高三上学期月考生物试题）实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板培养基上画3条等长的平行线（3条线均与链霉素带接触），将平板置于37
℃条件下恒温培养3天，结果如图所示，从实验结果看，以下关于链霉素的哪一项叙述是不正确的（　　）
A．它能抑制结核杆菌的生长
B．它对结核杆菌比对霍乱弧菌更有效
C．它对结核杆菌比对伤寒菌更有效
D．它可以用于治疗伤寒病人
【答案】D
【解析】抗生素是真菌（另外还有放线菌）产生的可杀死某些致病菌的物质，可以用来治疗相应的疾病．如图所示，实验结果表明，链霉菌产生的链霉素是一种抗生素类物质，它可以抑制某些细菌的繁殖．分析实验A的结果可以看出：链霉素对结核杆菌的抑制作用最强，对霍乱菌的抑制作用弱，对伤寒菌几乎无抑制作用，故选D。
5．（江苏省盐城中学2016-2017学年高三阶段性检测生物试题）烧伤病人容易感染绿脓杆菌，引起化脓性感染，比阿培南、美罗培南、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素都是非常经典的抗绿脓杆菌的药物。临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，从病人身上获取少量样本，按照一定的实验步骤操作，以确定该病人体内的绿脓杆菌对不同抗生素的敏感性。
（1）获取绿脓杆菌单菌落：
配制适于绿脓杆菌生长的培养基，培养基中的营养成分一般含有_______、氮源、生长因子、水和无机盐，调节pH至7，灭菌处理，待培养基冷却至50℃时，在__________附近倒平板。经过选择培养、鉴别等步骤获得单菌落。
（2）检测绿脓杆菌对不同抗生素的敏感性：
取该单菌落适当稀释，用____________法接种于固体培养基表面，使其均匀生长，布满平板。将分别含等剂量的比阿培南、美罗培南、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素的相同大小的小滤纸圆片均匀置于该平板上的不同位置，适宜条件培养一段时间，结果是含不同抗生素的滤纸片周围均出现透明圈，这说明绿脓杆菌对上述抗生素____________；含头孢菌素的滤纸片周围的透明圈比含美罗培南的小，这说明绿脓杆菌对头孢菌素的敏感性比美罗培南____________（填“强”或“弱”）；含比阿培南、碳青霉烯类的滤纸片周围的透明圈也比含美罗培南的小，且比阿培南透明圈中出现了一个菌落，请推测此菌落产生的可能原因：一是_____________________
，二是__________________________。
（3）根据上述实验结果，为达到抗绿脓杆菌的目的，对于该患者来说最好应选用抗生素____________。
【答案】（1）碳源　　酒精灯火焰
（2）涂布平板法　　敏感　　弱　　杂菌污染　　抗比阿培南的绿脓杆菌（或绿脓杆菌产生耐药性突变）形成的菌落
（3）美罗培南
（2）检测菌体对不同抗生素的敏感性：取该单菌落适当稀释，用涂布平板法法接种于固体培养基表面，使其均匀生长，布满平板。将分别含等剂量的比阿培南、美罗培南、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素的相同大小的小滤纸圆片均匀置于该平板上的不同位置，适宜条件培养一段时间，结果是含不同抗生素的滤纸片周围均出现透明圈，这说明绿脓杆菌对上述抗生素都敏感；含头孢菌素的滤纸片周围的透明圈比含美罗培南的小，这说明绿脓杆菌对头孢菌素的敏感性比美罗培南弱；含比阿培南、碳青霉烯类的滤纸片周围的透明圈也比含美罗培南的小，这说该杆菌对明美罗培南最为敏感，比阿培南透明圈中出现了一个菌落，此菌落的产生可能是杂菌污染，也可能是形成了耐药性的突变菌。
（3）根据上述实验结果，为达到抗绿脓杆菌的目的，而它对美罗培南最为敏感，那么对于该患者来说最好应选用抗生素是美罗培南。
创新预测
1．下列说法不正确的是（　　）
A．科学家从70～80
℃热泉中分离得到耐高温的TaqDNA聚合酶
B．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D．同其他环境中的生物相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多
【答案】B
2．下列有关微生物营养的说法正确的是（　　）
A．纤维素分解菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
B．在纤维素分解菌生长的培养基中只需碳源、氮源、水、无机盐即可正常生长
C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的生长越有利
D．生长因子是微生物生长必需的，而微生物本身合成这些物质的能力往往不足
【答案】D
【解析】纤维素分解菌是异养型微生物，其碳源为有机碳源，硝化细菌是自养型微生物，其碳源物质为CO2，A错误；在纤维素分解菌生长的培养基中除含有碳源、氮源、水和多种无机盐外，还应含有生长因子等，B错误；培养基中的营养物质浓度过高会导致微生物不能从培养基中吸水，而且还会出现失水过多而死亡的现象，对生长不利，C错误；微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物称为生长因子，D正确。
3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（　　）
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24-48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
【答案】D
4．某生物兴趣小组以带有落叶的表层土壤（深5cm左右）为实验材料，研究土壤微生物在适宜温度下的分解作用，对土壤处理情况见下表。与此有关的叙述不正确的是（　　）
1组
2组
3组
4组
土壤处理
灭菌
不灭菌
灭菌
不灭菌
干燥程度
湿润
湿润
较干燥
较干燥
A．探究的问题是不同土壤湿度条件下，土壤微生物对落叶的分解作用
B．该实验的自变量为土壤是否灭菌处理，实验中的对照组是1和3
C．为了控制实验中的无关变量，作为实验材料的落叶也应进行灭菌处理
D．预期结论是1、3组的落叶分解现象不明显，2、4组中的落叶被不同程度的分解
【答案】B
【解析】该实验的自变量为土壤是否灭菌处理，实验中的对照组是2和4，探究的问题是不同土壤湿度条件下，土壤微生物对落叶的分解作用，A正确，B错误；为了控制实验中的无关变量，作为实验材料的落叶也应进行灭菌处理，C正确；预期结论是1、3组的落叶分解现象不明显，2、4组中的落叶被不同程度的分解，D正确。
5．如表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题：
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
指示剂
琼脂
含量（g）
10.0
5.0
5.0
2.0
0.2
12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）若根据用途划分，该培养基属于__________（填“选择”或“鉴别”）培养基．若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？_____________，并用______________作为指示剂．
（2）图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：______________和_______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的菌落．图_________所用的接种方法可用来对活菌进行计数．某实验小组采用该方法检测水样中的细菌含量．在接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37．据此可得出每升水样中的活菌数为_______________。
　　　　　　　　　　　　　
（3）以下微生物发酵生产特定产物时，所利用的主要微生物的细胞结构与大肠杆菌较相似的有_______________。
A．制作果酒
B．由果酒制作果醋
C．制作泡菜
D．制作腐乳
【答案】（1）鉴别　　将蛋白胨改成尿素　　酚红
（2）释涂布平板法　　平板划线法　　1　　检测培养基平板灭菌是否合格　　3.8×107
（3）BC
（2）由图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是稀释涂布平板法和平板划线法。图1（稀释涂布平板法）所用的接种方法可用来对活菌进行计数。某实验小组采用该方法检测水样中的细菌含量。在接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37．据此可得出每升水样中的活菌数为（39+38+37）/3×1000×100×10=3.8×107。
（3）大肠杆菌属于原核生物，没有成形的细胞核。制备果酒使用的微生物是酵母菌，属于真核生物，A错误；制作果醋使用的微生物是醋酸菌，属于原核生物，B正确；制作泡菜使用的微生物是乳酸菌，属于原核生物，C正确；制作腐乳的微生物主要是毛霉，属于真核生物，D错误。专题35　微生物的培养与应用
讲考纲
考纲概要
考纲解读
高考真题
1．微生物的培养、分离与应用。
1．了解微生物的培养、分离与应用。
1．2017新课标Ⅰ卷（37）、2017江苏卷（31）、2016江苏卷（10）、2016江苏卷（25）、2016新课标Ⅰ卷（39）、2016四川卷（10）、2016新课标Ⅲ卷（39）、2015江苏卷（19）、2015江苏卷（31）
讲考点
考点一　微生物的培养与应用
1．微生物的实验室培养
（1）培养基
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
③种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。
（2）无菌技术
①含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
②关键：防止外来杂菌的入侵。
③不同对象的无菌操作方法
（3）大肠杆菌的纯化培养
2．微生物的筛选和计数
（1）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
②统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
③实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
（2）分解纤维素的微生物的分离
①纤维素分解菌的筛选
②实验流程
【例1】（2017年新课标Ⅰ卷，37）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_______________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择____________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________（答出两点即可）。
【答案】（1）脲酶
分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物
为细胞生物生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
【跟踪训练1】水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
成分
MgSO4
蛋白质
X物质
水
琼脂
用量
5g
10g
1000mL
7g
20g
（1）上表是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，从物理性质来看，该培养基为__________培养基，表中X物质最可能为_____________。实验中还应设置完全培养液对照组，将菌液稀释相同的倍数，选择培养基上生长的菌落数目应明显_________（填“多于”或“少于”）对照组培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
（2）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用___________计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释105倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100mL原菌液中有PVA分解菌_______个，该方法的测量值与实际值相比一般会_______（填“偏大”、“偏小”或“相等”），原因是____________。
（3）要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入_______________用于鉴别PVA分解菌。
【答案】（1）固体　　聚乙烯醇（或PVA）　　少于
（2）血细胞（血球）　　1.6×1010　　偏小　　当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落
（3）碘
（2）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用血细胞（血球）计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释105倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100mL原菌液中有PVA分解菌=160÷0.1×105×100=1.6×1010个；由于两个或多个细菌聚集在一起只能产生一个菌落，因此该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
（3）根据题意可知，“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”，因此要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中还需要加入碘用于鉴别PVA分解菌。
讲方法
1．培养基的配制原则
（1）目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
（3）pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．微生物对主要营养物质的需求特点
（1）自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
（2）异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
3．选择培养基的制作方法
（1）在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。
（2）通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。
（3）利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。
（4）通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。
讲易错
1．消毒和灭菌
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器的灭菌
2．两种纯化细菌方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌专题35　微生物的培养与应用
一、选择题（10小题，每小题5分，共50分）
1．下列有关培养基的叙述正确的是（　　）
A．培养基只能是天然物质
B．培养基只能培养细菌
C．固体培养基常用于菌种的鉴定和分离
D．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
【答案】C
【解析】培养基也可以是人工合成的，A错误。培养基有可以培养真菌，B错误。固体培养基上能观察到菌种的大小、形态，所以常用于菌种的鉴定和分离，C正确。微生物在固体培养基上生长时，形成的是肉眼可见的菌落，而不是单个细菌，D错误。
2．为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是（　　）
A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法
B．临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上
C．临时保藏的菌种容易被污染或产生变异
D．对于需要长期保存的菌种，可以采用－4
℃低温保藏的方法
【答案】D
3．稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法，下列相关叙述错误的是（　　）
A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
【答案】C
【解析】稀释涂布平板法，包括系列稀释和涂布平板两个过程，涂布平板之前需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，A正确；涂布平板时，需要将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，B正确；只有稀释度足够大的菌液才能在培养基表面形成单个的菌落，C错误；操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防止杂菌污染，D正确。
4．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为（　　）
A．伊红美蓝培养基、含青霉素培养基
B．含青霉素培养基、含氨的无机培养基
C．含氨的无机培养基、含青霉素培养基
D．含青霉素培养基、伊红美蓝培养基
【答案】B
【解析】酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。
5．微生物的实验室培养要进行严格的灭菌和消毒，以下理解不正确的是（　　）
A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．任何消毒方法一般都不能消灭微生物的孢子和芽孢
C．灼烧法灭菌主要对象是金属器具，也可以是玻璃器具
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌法、高压蒸汽灭菌法和紫外线灭菌法
【答案】D
6．下面是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是（　　）
　　　　　　　　　　　　　
A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌
B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上
C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的
D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
【答案】C
【解析】在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将培养皿的皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。
7．生物乙醇是化石汽油的良好替代品，美国主要以玉米为原料生产燃料乙醇。我国则坚持“不与人争粮，不与粮争地”原则，利用农作物废弃物——秸秆代替粮食作为原料，其主要技术流程为：酶解→酵母发酵→蒸馏→成品。下列分析不正确的是（　　）
A．使用秸秆作为原料使能量得到了更有效的利用
B．对秸秆进行“酶解”主要用的是纤维素酶
C．乳酸菌可以代替酵母菌用于生物乙醇的生产
D．“酵母发酵”环节需要严格控制发酵罐中的氧气供应
【答案】C
8．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A，原卷人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素等配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是（　　）
　　
A．培养基中加入化合物A作为唯一碳源，目的是为了筛选目的菌
B．将菌种接种到固体培养基培养的目的是获得大量菌种
C．实验培养过程中进行振荡培养，可使目的菌和培养液充分接触
D．实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌污染
【答案】B
9．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（）
　　　
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步计数
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
【答案】B
【解析】生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中只有稀释涂布平板化可用于计数微生物，C错误；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
10．下列有关生物技术实践的相关知识叙述中，错误的是（　　）
A．利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
B．制作腐乳所用的毛霉是一种耐高盐的微生物
C．在微生物的分离和培养实验中，对划线后或涂布好的平板应倒置培养
D．采用稀释涂布平板法时，每个稀释度涂布三个平板且总共涂布一个无菌水平板
【答案】B
二、非选择题（5小题，共50分）
11．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解，回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中葡萄糖苷酶可将分解成＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成＿＿＿＿＿色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养（成分见下表）：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，
“－”表示无。
据表判断，培养基甲＿＿＿＿（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是＿＿＿＿；培养基乙＿＿＿＿（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是＿＿＿＿＿＿＿＿。
【答案】（1）纤维二糖　　葡萄糖
（2）红　　透明圈
（3）不能　　液体培养基不能用于分离单菌落　　不能　　培养基中没有纤维素，不会形成CR纤维素红色复合物
【解析】（1）纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，C1酶、CX酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
（2）CR可与纤维素形成红色复合物，不能与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，故纤维素被分解后，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。
（3）培养基甲为液体培养基，不能用于分离单菌落；培养基乙培养基中没有纤维素，不会形成CR纤维素红色复合物，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌网
12．临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：
（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用___________法或__________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
（2）为统计样品中活菌的数目，取样品适当稀释，用涂布法接种于培养基表面，在37℃培养箱中培养适当时间后形成菌落，一般选择菌落数在________的平板进行计数
（3）为了检验该致病菌对于抗生素的敏感性，在该病菌菌落均匀生长的平板的不同位置，分别放置含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片，培养一段时间后，在四个滤纸片周围出现透明圈由大到小依次是A＞C＞D＞B，由此推断，该病人目前适合使用的抗生素是______。含C的滤纸片周围透明圈比含A的小，说明_____________；若抗生素B的滤纸片周围没有出现透明圈，最可能的原因是该病人长期服用抗生素B
导致的结果；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现一个菌落，这种菌落的出现可能是由于接种过程不严格导致的________，也可能是由于基因突变产生的抗生素D的耐药菌，这种变异的特点是____________。
（4）培养基的灭菌方法是_________灭菌法，接种环的灭菌方法是________灭菌法。接种过程应该在_____________进行。
【答案】（1）平板划线　　稀释涂布平板
（2）30－300
（3）A　　该致病菌对C的敏感性比对A的弱　　杂菌污染　　不定向性
（4）高压蒸汽　　灼烧　　点燃的酒精灯旁
（3）在抗药性检验过程中，如果在菌落周围出现透明的圆圈，说明此种抗生素可抑制该细菌；透明圈的大小表示着此种抗生素抗菌的强弱，由于四个滤纸片周围出现透明圈由大到小依次是A＞C＞D＞B，可以推断出抗生素A对该致病菌的效果最好；含C的滤纸片周围透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性较A的弱；若抗生素B的滤纸片周围没有出现透明圈，最可能的原因是该病人长期服用抗生素B导致致病菌产生了抗药性；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现一个菌落，这种菌落的出现可能是由于接种过程不严格导致的杂菌污染，也可能是由于基因突变产生的抗生素D的耐药菌，基因突变的特点是不定向的。
（4）微生物培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，接种环的灭菌方法是灼烧灭菌，接种过程应该在点燃的酒精灯旁进行，以防止杂菌污染。
13．为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。
（1）配制好的培养基灭菌通常可以使用_________________法。步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是_______________________________。
（2）同学甲进行过程④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是___________；推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是________________；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________________。
（3）同学乙也按照同学甲的接种方法进行了过程④的操作：将1mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为________________。
（4）步骤⑤需要震荡培养其目的是提高培养液溶氧量，同时使__________，提高营养物质利用率。
（5）步骤⑤后取样测定石油含量的目的是____________________。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌　　石油是唯一碳源
（2）稀释涂布平板法　　涂布不均匀　　检测培养基平板灭菌是否合格
（3）5.7×107　　
（4）菌体与培养液充分接触
（5）筛选出分解石油能力最好的细菌
（2）过程④是对分解石油的细菌进行分离，分析B图可知，分解石油的细菌在培养基表面分布较为均匀，说明同学甲进行过程④的操作中接种方法是稀释涂布平板法；图B中培养基表面左侧的菌落数目明显比右侧多，推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是接种时涂布不均匀；在接种前需随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
（3）同学乙也按照同学甲的接种方法进行了过程④的操作：将1mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为（56+58+57）÷
3÷0.1×100×1000=5.7×107。
（4）步骤⑤需要震荡培养其目的是提高培养液溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质利用率。
（5）步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油能力最好的细菌，其中石油剩余量最少的一组所含的细菌就是分解石油能力最好的细菌。
14．现已有近20个国家正在进行细菌堆浸冶金。全世界铜的总产量中约有15%是用细菌浸出法生产的。冶铜用的菌种主要是氧化亚铁硫杆菌，这种菌种能氧化辉铜矿（Cu2S）等各种硫化矿获得能量，并产生硫酸和硫酸铁，这两种化合物可作用于辉铜矿（Cu2S），把矿中的铜以硫酸铜形式溶解出来，再用铁置换出铜，生成的硫酸亚铁又可被细菌作为营养物氧化成硫酸铁，如此循环往复，最后从溶液中获取铜。研究人员已初步分离、筛选到能高效产铜的该菌种，实验大致步骤如下图所示，请分析回答问题。
（1）分离这种菌种，可在培养基中加入化合物______________。
（2）筛选高产菌株时，接种到____________培养基（按物理性质划分）进行培养，筛选高产菌株的方案是：
____________________________________________________________。
（3）将获得的高产菌株进行进一步纯化培养时，一般用固体培养基，常采用________法进行接种。
（4）实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理才能倒掉，操作时采用________灭菌方法，这样做的目的是___________________________________。
【答案】（1）Cu2S
（2）液体　　分装成若干瓶等量培养基，接种等量菌种，在相同条件下培养一定时间，测量各瓶中产铜量
（3）平板划线
（4）高压蒸汽　　防止环境污染
【解析】（1）根据以上分析已知，分离这种菌种，可在培养基中加入Cu2S。
（2）筛选此高产菌株，可在液体培养基上培养，测量产铜量，其设计思路为：分装成若干瓶等量培养基，接种等量菌种，在相同条件下培养一定时间，测量各瓶中产铜量。
（3）纯化菌种常用平板划线法，在固体培养基上进行。
（4）实验结束时，使用过的培养基需要经过高压蒸汽灭菌法进行灭菌处理，防止环境污染。
15．进入冬季，部分城市出现严重雾霾，与秸秆野外焚烧有一定关系。为破解秸秆处理瓶颈，微生物专家力图通过微生物降解技术使秸秆能尽快腐烂掉，增加土壤肥力。缓解环境污染。试分析并回答有关问题：
（1）专家研制的降解秸秆的催腐剂是十余种能分解纤维素的霉菌、细菌和酵母菌的组合。其中_________在细胞结构上与其他两者不同。
（2）纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将__________分解为______________。
（3）微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列______________，从而得到单个菌落，再采用_______________方法进行鉴定，得到右图的菌落。那么，图中降解纤维素能力最强的菌株是_________________（填图中序号）。
（4）图中所示培养基从物理状态上看，属于_____________培养基。
（5）为探究催腐剂在不同条件下对玉米秸秆的分解作用，将经过灭菌处理的秸秆平分成下表的甲、乙、丙三组，均放在无菌环境条件下进行培养，得到如下实验现象：
该实验还存在不完善之处，请你说出其中一点_________________________。
【答案】（1）细菌
（2）纤维二糖葡萄糖
（3）梯度稀释刚果红染色
1
（4）固体
（5）缺少35度无催腐剂的对照组
（4）图中所示培养基从物理状态上看，属于固体培养基。
（5）设计实验应遵循单一变量和对照性原则，分析实验表格可知，该实验还存在不完善之处，缺少35度无催腐剂的对照组。

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