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基因工程与细胞工程
考点分析
1.近五年的全国卷高考试题中对于基因工程的考查频度较高，侧重考查操作工具的种类、功能以及操作基本程序的应用等。动物细胞工程技术中的核移植技术及单克隆抗体的制备也有所考查。
2．题目常借助简洁的文字材料或模式图等考查有关基因工程、动物细胞工程的原理、技术手段等，尤为注重对教材中一些关键词的填充及对结论性语句的准确表述等。
3．备考时，应从以下四个方面入手复习：
(1)列表比较法掌握限制酶、DNA连接酶和载体的作用。
(2)实例分析法理解基因工程的原理和过程。
(3)列表比较法理解两个不同，即植物组织培养和动物细胞培养的不同、植物体细胞杂交与动物细胞融合的不同。
(4)图解法分析并掌握单克隆抗体制备过程。
知识网络
一、基因工程
1．基因工程的基本工具
限制酶
DNA连接酶
(运)载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段形成 重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键
------------------
作用特点 (条件)
①识别特定的核苷酸序列
②在特定位点上切割
①E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端
②T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平(口)末端
①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制
②有一个或多个限制酶切割位点
③具有特殊的标记基因
2．基因工程的操作步骤
(1) 目的基因的获取：
①从基因文库中获取。
②利用PCR技术扩增。
③用化学方法直接人工合成。
(2) 基因表达载体的构建：
①基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。
②基因表达载体的构建方法：
(3)将目的基因导入受体细胞：
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用
方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法(用Ca2＋处理)
受体
细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(4) 目的基因的检测与鉴定：
①目的基因插入检测：DNA分子杂交。
②目的基因转录检测：(核酸)分子杂交。
③目的基因翻译检测：抗原—抗体杂交。
④个体生物学水平检测：根据目的基因表达出的性状判断。
二、细胞工程
1．动物细胞培养与植物组织培养的比较
项目
动物细胞培养
植物组织培养
培养前处理
无菌、用胰蛋白酶处理，使组织细胞相互分散开
无菌、离体
培养基成分
葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物血清等
矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素等
培养基状态
液体培养基
固体培养基
项目
动物细胞培养
植物组织培养
过程
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织→原代培养→传代培养→细胞群
离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽―→植物体
能否培养成个体
不能
能
应用
举例
大规模生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；皮肤移植；检测有毒物质的毒性等
快速繁殖、培育无病毒植株；生产药物；制造人工种子；培育转基因作物等
2．植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合(单克隆抗体的制备)
理论基础(原理)
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性、细胞增殖
融合前处理
酶解法去除细胞壁(纤维素酶、果胶酶等)
注射特定抗原，免疫小鼠，获取(效应)B淋巴细胞
促融
①物理法：离心、振动、电激等；②化学法：聚乙二醇(PEG)
①物化法：与植物细胞融合相同；②生物法：灭活的仙台病毒
过程
第一步：原生质体的制备；第二步：原生质体的融合；第三步：杂种细胞的筛选与培养；第四步：杂种植株的诱导与鉴定
第一步：正常小鼠免疫处理；第二步：动物细胞融合；第三步：杂交瘤细胞筛选与培养；第四步：单克隆抗体的提纯
用途
①克服远缘杂交不亲和的障碍，大大扩展杂交亲本的组合范围；②克服有性杂交的母系遗传，获得细胞质基因的杂合子，研究细胞质遗传
①制备单克隆抗体；②诊断、治疗疾病，如生物导弹
3．动物细胞核移植和单克隆抗体
(1)动物细胞核移植：
供体体细胞→细胞培养→体细胞(核)
　　　　　　　　　　↓注入
卵母细胞→减Ⅱ中期去核→无核卵母细胞→重组细胞→
重组胚胎→代孕母牛→生出与供体遗传性状相同的个体。
(2)单克隆抗体：
①单克隆抗体的制备过程：
多种杂交细胞→在具有筛选作用的培养基上培养→克隆筛选出的杂交细胞→将不同种杂交细胞分开，并克隆专一抗体，检验阳性细胞→注射到小鼠体内或体外培养→获得单克隆抗体。
②杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一性抗体。
③单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产量大。
高频考点一　基因工程
例1．(2017·高考全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：[来源:Zxxk.Com]
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有______________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
________________________________________________________________________________________。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养
(4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
【变式探究】（2017年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
　　　　　
下列操作与实验目的不符的是（　　）
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒[来源:学#科#网]
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
【变式探究】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________________________；并且________和________的细胞也是不能区分的，其原因是________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞
【变式探究】图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是__________________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是______________________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________和________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
答案：(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E.coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶
【举一反三】HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在______的作用下合成________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是________________________。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
解析：(1)HIV的遗传物质是RNA，所以要想获得相应的目的基因，应以HIV的RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA(或DNA)。(2)目的蛋白注入机体后相当于抗原。在抗原的刺激下，机体进行体液免疫，由浆细胞产生相应抗体(分泌蛋白)，由于该抗体能与目的蛋白(抗原)发生特异性结合，所以可通过抗体检测出有无目的蛋白，从而确定体内有无HIV。(3)HIV主要攻击人体的T(或T淋巴)细胞，从而降低机体免疫系统的防卫功能。(4)癌细胞在机体中属于抗原，人体的免疫系统能够监控和清除癌细胞。
答案：(1)RNA　逆转录酶　cDNA(或DNA)　(2)抗体　抗原抗体特异性结合　(3)T(或T淋巴)　(4)监控和清除
高频考点二　细胞工程
例2、（2017年江苏卷，11）牛雄性胚胎中存在特异性H-Y 抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y 单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是（　　）
A．H-Y 单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌 B．应选用原肠胚做雌雄鉴别[来源:Z*xx*k.Com]
C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植 D．用H-Y 抗原免疫母牛可获得相应抗体
【答案】D
【变式探究】某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。
回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过____________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是___________________
_____________________________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有
_________________________________________________________________________，
体系中出现多种类型细胞的原因是______________________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。
(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是__________________。
解析：(1)分析题图可知，经4次免疫后，小鼠Y的血清抗体效价就可达到16 000以上。由于4次免疫后的Y小鼠的血清抗体效价最高，故最适合用于制备B淋巴细胞。(2)细胞融合实验中，由于细胞融合是随机的，而且诱导融合率不可能达到100%，所以会有未融合的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞、融合的具有同种核的细胞和杂交瘤细胞三种类型。(3)杂交瘤细胞同时具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的核物质，但细胞核只有一个。由于杂交瘤细胞在分裂过程中染色体会丢失，故细胞核中染色体数目最多是40＋60＝100(条)。(4)B淋巴细胞已经分化，没有无限增殖的潜能。
答案：(1)4　Y　Y小鼠的血清抗体效价最高
(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞　细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
(3)1　100
(4)不能无限增殖
【变式探究】科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了番茄—马铃薯杂种植株，为了便于杂种细胞的筛选和鉴定，科学家利用红色荧光和绿色荧光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质，其培育过程如图所示：
(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理有______________________________。
(2)过程①常用的酶是____________，细胞融合完成的标志是________________。
(3)植物原生质体融合过程常利用化学试剂________诱导融合，在鉴定杂种原生质体时可用显微镜观察，根据细胞膜表面荧光的不同可观察到________种不同的原生质体，当观察到______________________时可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。
(4)过程③和过程④依次为______________________，过程④中的培养基常添加的植物激素是________________。
(5)若番茄细胞内含m条染色体，马铃薯细胞中含n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞在有丝分裂后期含________条染色体。若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于________植株。
答案：(1)细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
(2)纤维素酶和果胶酶　形成了新的细胞壁
(3)聚乙二醇(或PEG)　3　融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光
(4)脱分化和再分化　生长素和细胞分裂素
(5)2(m＋n)　单倍体

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