资源简介

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课题：血红蛋白的提取和分离
教学目标：
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
教学重点：凝胶色谱法的原理和方法
教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
教学过程：
（一）引入新课
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？
（二）进行新课
1．基础知识
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：（见课件图） 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
[来源:21世纪教育网]
21世纪教育网
（3）分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。21世纪教育网
［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：
决定运动方向 形成库仑力 形成阻力 决定运动速率[来源:21世纪教育网]
电荷性质 √
电荷量 √ √
分子形状 √ √
分子大小 √ √
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2．实验设计
2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。
2.2选择实验材料
（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。
（2）请阅读投影资料，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：
血液由 和 两部分组成。
血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。
该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。
2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？
除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。
红细胞的洗涤过程为
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。
补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白
2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。
透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。
在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。
思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。
总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。
2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。
根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：
色谱柱的装填过程。
步骤 操作要求
① 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上
② 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量
③21世纪教育网 配制悬浮液 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入；轻轻敲打
⑤ 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
样品加入和洗脱。其基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：
（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）
A.相对分子质量大的
B.溶解度高的
C.相对分子量小的
D.所代电荷多的
解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
答案：A
例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）
A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术
答案：C
☆综合应用
例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
答案：D
（五）巩固练习
1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ）
A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度
C. 所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小
2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）
A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸
3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ）
A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核
C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞DNA含量高
4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）
A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀
5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色
A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素
6. 下列操作正确的是（ ）
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心
B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h
7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ）
A. 先加入1ml透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出
C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功
D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水
8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）
A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
9. 凝胶色谱法操作正确的是（ ）
A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B. 将橡皮塞下部切出凹穴
C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）
A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
★教后小记
本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。
血
红
蛋
白
的
取
和
分
离
凝胶色谱法
原
理
分离过程
凝胶电泳法
缓冲溶液
组
成
作
用
蛋白质的
提取分离
样品处理
粗
分
离
纯
化
纯度鉴定
血
红
蛋
白
的
提
取
和
离
蛋白质分子的差异性
蛋白质分子的差异性
凝胶色谱法
原
理
分离过程
凝胶电泳法
凝胶色谱法
原
理
分离过程
凝胶电泳法
缓冲溶液
组
成
作
用
缓冲溶液
组
成
作
用
蛋白质的
提取分离
样品处理
粗
分
离
纯
化
纯度鉴定
蛋白质的
提取分离
样品处理
粗
分
离
纯
化
纯度鉴定
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