资源简介

课题2
多聚酶链式反应扩增DNA片段
教学准备
1.??
教学目标
1、了解PCR技术的基本操作
2、理解PCR的原理
3、讨论PCR的应用
2.??
教学重点/难点
教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作
教学难点：PCR的原理
3.??
教学用具
教学课件
4.??
标签
教学过程
（一）引入新课
回忆DNA分子的结构
1、组成元素：C、H、O、N、P
2、基本单位:
脱氧核苷酸
3、脱氧核苷酸结构
（二）、细胞内的DNA复制
1、概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
2、时期：有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期
3、场所：细胞核（主）、线粒体、叶绿体
4、模板：DNA母链
5、原材料：脱氧核苷酸
6、基本条件:酶、ATP、原料、模板
7、复制过程:
①
DNA的解旋????
②
RNA引物的合成
③
DNA的生成????
④切掉引物生成冈崎片断???
⑤
DNA片断的连接
8、复制特点:
边解旋边复制(过程）、半保留复制（结果）
9、遵循原则：碱基互补配对原则
10、精确复制的原因：
①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
（三）、聚合酶链式反应
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。
1．PCR原理
PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：
1．1细胞内DNA复制条件分析：
1．2细胞内DNA复制过程
（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
DNA双螺旋结构的反向平行结构：
（2）DNA的复制过程:
解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。
引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。
DNA聚合酶结合：
子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。
［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？
DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。
1．3?
DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。
反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）
2．PCR的反应过程
变性：在95℃时DNA解旋
复性：在50℃时引物与DNA单链结合
延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）
3．实验操作
3．1
PCR反应体系：
缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水
3．2
实验操作步骤
3．3
按照PCR反应体系配方配制反应液；
（1）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；
（2）将微量离心管放到PCR仪中；
（3）设置PCR仪的工作参数。
（4）DNA在PCR仪中大量扩增。
3．4
水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
4．实验注意事项
（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
5．结果分析与评价
（1）反应液稀释：取2?LPCR反应液，添加98?L蒸馏水；2．分光光度计调零：将100?L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
（2）将100?L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
（3）计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数
（四）、PCR产物鉴定：
琼脂糖凝胶电泳技术
1、实验原理
在外加电场的作用下，带电粒子发生迁移的现象叫电泳。在电场中，带电分子向着与其所带电荷相反的电极移动。
在施以一定强度的电场中，带负电荷的DNA在琼脂糖凝胶中可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，利用这一性质可以分离不同长琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物：
（1）制胶???
（2）点样???????
（3）电泳
（4）紫外投射分析仪观察并照相
2、两种染料：
6×上样buffer：维持反应体系的pH不变，而且上样buffer常以溴酚蓝为指示剂，稀释成1×后比重仍然较大，上样时极易下沉，且颜色清晰可见。
DNA荧光染料：由于DNA不能直接观察到，所以利用一种核酸的荧光染料与PCR的产物DNA结合后再电泳，电泳结束后，可用紫外透射分析仪观察电泳结果。
3、可以用已知长度的DNA
“Marker”作为参照，对电泳图谱进行比对，估算未知DNA分子的长度，同时根据带的宽度，估算未知DNA分子的数目。
（五）、PCR的应用
PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。
课堂小结
?PCR的技术，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。掌握PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。这部分内容的应以读图识图为主。在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。今天我们来学习研究了DNA分子的扩增技术――PCR技术。希望大家能够掌握和理解。
板书
专题五???
第2节??
多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、细胞内的DNA复制
二、聚合酶链式反应
1、PCR扩增的原理
2、PCR扩增的过程
三、PCR产物鉴定
琼脂糖凝胶电泳技术
四、PCR的应用

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