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中华微生物学和免疫学杂志 2003年 8月第 23卷第 8期 Chin J Microbiol lmmmol
．免 疫 检 测 ．
利用生物信息学确定质粒中所含
HIV基因片段相应特性
张涛 端义坤 余模松
【摘要 】 目的 确定质粒中所含 HIV基因片段的来源以及相应表达产物的特性。方法 将质
粒中的该段基因克隆到载体pUC19上进行测序后，利用生物信息学相关技术对该基因序列进行分析，
并对其表达产物的基本特性作初步预测。结果 分析表明，该段基因与 HIV．m B的同源性高达 99％，
属于HIV env基因的序列，表达的产物含有 HIV gp41和 gpl20的部分结构。结论 利用生物信息学的
有关方法能迅速地对序列进行准确分析，有利于生物学、医学的迅速发展。
【关键词 】 生物信息学；}Ⅱv；跨膜蛋白；序列分析
U商唱 II~mfom laifes toid删 the ullknowll dm c ofHIV seq呦 ce in a 蹯mⅪ ZHANG Tao，DUAN
Y~kun，YUMo-song，Wulmn Institute ofBiological Products，Wu&tn 430060，China
a 啊曲 蟹 author：ZHANG Tao，E-mail：tdmng@21cn．conr
【Abstract】 Objective To study the character of human immunodeficience virus(哪 )sequence con-
rained in a plasmid．Methods The fragment fo HIV was constructed into the plasmid pUC19 and sequenced；US—
ing bioinformatics to analyze the sequence and predicating the products expressed．Results This fragment belongs
to HIV-ll B env，the expressed results contained the part of gpl20 and sp41．Conclusion Bioinformatics has
nOW become atoolto study genomic，whichmakes our research quickly，accurate and canwil promotehte devel-
opment of biology and medicine．
【Key words】 Bioinformatics；HIV；Trans-membrane protein；Sequence analysis
生物信息学(bioinformatics)一词出现在上世纪 JM109由本室保存。
90年代，随着人类基因组计划以及计算机科学、国际 试剂：限制性核酸内切酶 EcoR I、Sal I，T4 DNA
互联网的迅速发展而产生，它是综合运用生物学、数 连接酶均购 自Promega公司。
学、物理学、信息科学以及计算机科学等诸多学科的 分析软件：序列分析软件 Vector NTI Suite 6、
理论方法的崭新交叉学科。其内涵非常丰富，核心 Primer Premier 5以及 Anthewin均从生物软件 网
是基因组信息学，包括基因组信息的获取、处理、存 (htp：／www．bio-sfot．com)下载。
储、分配和解释。基因组信息学的关键是”读懂”基 克隆 env基因：质粒 pCW-X和 pUC19用限制性
因组的核苷酸顺序，即全部基因在染色体上的确切 核酸内切酶 EcoR I、Sal I进行双酶切，然后用 T4
位置以及各 DNA片段的功能；同时在发现了新基因 DNA连接酶将 pcw-x切下的小片段克隆到 pUC19
信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测，然后依 上，转化到JM109，利用氨卞青霉素抗性筛选标志得
据特定蛋白质的功能进行药物设计 。 到质粒 pUC19．x(引。
我们利用生物信息学的基本方法对一质粒中所 测序鉴定：选择阳性克隆送大连宝生物公司进
含的 HIV基因进行分析，确定该基因在 HIV全序列 行测序，测序引物为通用引物。
中的具体区段，以及它所表达的蛋 白的基本结构特 测序结果分析：将测序所得结果通过 Intemet发
点 ，有利于以后 HIV的诊断研究 以及抗 HIV的药物 送到 GenBank进行序列比较。
筛选。 蛋白质序列分析：利用软件 Primer Premier将测
材料和方法 序的核酸序列翻译成氨基酸序列 ，将结果录入到
f Vector NTI Suite 6数据库，与核酸同源性相近的序列
质粒 和菌 种：质粒 pCW-X、pUC19，大肠 杆菌 进行氨基酸序列比较。
作者单位：430060武汉生物制品研究所免疫研究室 蛋白质二级结构分析：将翻译的氨基酸序列发
通讯作者：张涛(B ail：tzhang@21 ．corn) 、送到SAP进行二级结构中a螺旋、p折叠以及p转角
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中华微生物学和免疫学杂志2003年8月第 23卷第 8期 Chin J Microbiol immunol，Au~st 2003，Vol 23，No。8
的分析，并用 Anthewin软件分析该段氨基酸序列的 Querv：3
相对分子质量和等电点。 t 76*3
~Jery：63
结 果 sbIct 7柏
1．env基因克隆结果：EcoR工、Sal工进行双酶切
的片段克隆到 pUC19，转化到 JM109后提取质粒 ，用
EcoR工、Sal工进行双酶切，电泳鉴定(图 1)。
Sbjct：7923 t
0‘Jery：303 ■
Sbjct：8'03
0ucry：483
图 1 ∞v鉴定
Fig 1．Idenitifcation of env $obuejc ：． ：。
1．M)NA／EcoR I +Hind Il marker；2。3：plasmid of pUC19一X；
4，5：dige~ed by EcoRI，Sail 8鲫283
2．X基因测序结果：X基因通过5 和3 正反两个
方向的测序后进行拼接得到全长为 1 182bp的核苷
酸序列。序列与 GenBank、EMBL、DDBJ和 PDB数据
库比较 ，通过 Blast算法发现 X基因序列与 150个
HIV序列有同源性，其中与 HIV一1ⅢB TH4—7—5株的
同源性高达 99％(图 2)。 Sbjct：8523●ctt‘
0uery。903 Ictct
3．氨基酸序列分析结果：利用 Prilner Premier软
lJlII
件将 x基因的核苷酸序列翻译为氨基酸序列 。然后 Sbjct 8583 Ictct
0ue ry：962
与 NCBI数据库进行 比较发现该基因属于 HIV一1包
Sbjct：8643
膜糖蛋白中 gpl20与 go41中的一段(图 3)。 0uery 1022
1 50 100 150 200 250 300 333
Sbjct 8703
···___l ~Jery：1082
■■■
Sbjct：8783·-"—ctt·t·p—ct
图 3 X基因在 HIV序列中的位置 Ouery 1142 tttgat|tml ，152
lllJllllllI
rig 3．1k l~ iion of X gene on the HIV sequence
sbjct 8823 tttlctltllg $833
利用 Vector NTI Suite 6软件与 [ntemet上 SAP进 图2 X基因序列与 IUV-IⅢB删 ．5序列同豫性比较
行交流，得出该肽段的相对分子质量( )为 33．8× 2。Comp=~ of the sequence betwem X and ]BIV-1
1o3。a螺旋、p折叠以及 p转角的预测图见图4。 ⅢB TH4-7-5 k~kae
对氨基酸组成和排列进行分析后得出该肽段的
讨 论
膜内和膜外的分布情况 ，可能存在 5个从 内向外 的
螺旋以及 3个从外向内的螺旋。氨基酸的具体位置 根据研究获得的信息，可以知道 pcw—X中含有
见表 1。预测的跨膜图形见图 5。 H1V一1 env基因中部分 gpl20和部分 1编码序列，
利用 Anthwin计算出 x基因所表达的氨基酸序 并且对该基因所表达的氨基酸序列在二级结构上的
列的 为 38 251．464，其等电点为 9．865，滴定曲线 a螺旋、p转角和 p片层进行预测，在该段 1氨基
见图 6。 酸序列中至少含有三进两出的5段跨膜序列。根据
i I il阻Ⅲ 1
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中华微生物学和免疫学杂志2003年8月第 23卷第 8期 Chin JMicrobiolImmtmol，August 2OO3，Vol 23，No．8
ProtScale output lbr usel seqeu nce TMpred outpulforW HS509
图5 跨膜区预测图
rag 5．Prediction of trans-membnme recem
_
＼、＼
2 4 5 6 7 8 9
pH ＼
如如∞ 专： 渤枷加
∞∞ ∞ O ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞
ProtScale output lbr user sequence
图 6 pI的滴定 曲线
rag 6．The titration curve of pI
用的方法，借用生物信息学的有关方法可以方便、迅
速地从外部资源中获得相关的信息，便于对基因进
行操作以及疫苗的研究b 。目前提出逆向疫苗学实
际上就是借助生物信息学的方法来进行疫苗的研
究：从基因组到疫苗，即在硅材上预测，体内进行证
实 。了解基因表达的调控机理也是生物信息学的
重要内容，根据生物分子在基因调控中的作用 ，描述
图 4 X肽段的二级结构预测图
rag 4．Prediction ofthe second structures fo X pepade 人类疾病的诊断、治疗内在规律。生物信息学已成
为整个生命科学发展的重要组成部分，成为生命科
表 1 跨膜蛋白的氨基酸位置
学研究的前沿。但必须看到的是，生物信息学的应
'llhle 1．"lhe antra add l~aaon oftrans．nlmtmme ln te~
用是建立在大量的生物信息的基础上，需要海量的
数据库作为支撑，与此相匹配的是还必须要有能快
速处理大量数据的巨型计算机和对生物结构的更为
科学的算法。
参 考 文 献
1 郝柏林 ．生物信息学．中国科学院院刊，2OO0，4：260-264．
2 金冬雁 ，黎孟枫 ，译．分子克隆实验指南．第二版．北京：科学出
版社，1992．
3 Zagursky IL1．Russell D．Bioinfonnatics：Use in bacterial vaccine discov．
分析得到的各段跨膜序列 的氨基酸位置，可以在
ery．Biotechniques，2001，3l(3)：1-14．
HIV基因治疗中选择相应的部位进行阻断等方法或 4 张涛。徐葛林，译．逆向疫苗学 ：研制疫苗的基因组方法．国外医
在 HIV诊断时选择表达相应的序列来制备抗原。 学预防诊断治疗用生物制品分册，2O02，25(2)：59-61．
对基因组的研究，生物信息学现已成为一个常 (收稿 日期：2002．12．16)o1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/
o1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/
o1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/中国医科大学
硕士学位论文
中国东北地区HIV/AIDS患者tat第一外显子基因变异特点及其二
级结构变化与疾病进展关系的研究
姓名：张岩
申请学位级别：硕士
专业：临床检验诊断学
指导教师：尚红
20050401
中国医科大学研究生学位论文独创性声明
本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及
取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论
文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或
其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研
究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．
论文作者签名： j盗盏 甘期：d=￡羔：。；
中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书
本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在
攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离
校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师
为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国
家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学
校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩
印或其他手段保存论文。
论文作者签名： i重垄
指导教师签名： !塑互竺
中国东北地区HIV／AIDS患者tat第一外显子基因
变异特点及其二级结构变化与疾病进展关系的研究
目 的
了解中国东北地区HIV／AIDS患者tat第一外显子的基因序列及其二
级结构的特征和变异特点，探讨其与HIV一1感染者疾病进展之间的关系。
方 法
收集我国东北地区HIV感染者的流行病学资料，临床资料及全血标本
一80℃保存。HIV一1 tat基因第一外显子基因序列测定：Qiaquick Spin kit
从全血标本中提取基因组DNA(含有整合的HIV一1前病毒DNA)，提取的
DNA以tat调节基因区特异性引物NP7／ENV一1为外侧引物进行第一轮
PCR扩增，以tat—B／NPll为内侧引物进行nested—PCR扩增。1％琼脂糖
凝胶电泳检测目的扩增片断，与分子量Marker对比无误后切取该片断。
QIAquick Gel Extraction Kit回收目的DNA片断。LI—COR Global IR2 Sys．
tem测序仪进行基因序列测定。不同疾病进展阶段的HIV—l感染者体内
HIV—l核苷酸及氨基酸序列特征分析：按不同疾病进展阶段对我国HIV一
1感染者进行分组。使用BIOEDIT软件包中CLASTAL W程序进行序列排
列比对、生成共享序列，并在核苷酸序列中人工引入gaps以保持翻译完整
性。以NNPRIDICT程序(http：／／ncbi．nlm．nih．gov)预测我们测得的Tat区
第一外显子氨基酸序列的二级结构，并进行分组比对。以PHYLIP软件包
中NEIGHBOR程序生成系统进化树(neighbor—joining algorithm)。统计tat
调节基因区第一外显子核苷酸及氨基酸突变位置和种类，并检索HIV Se．
quenee Database，与国内外HIV流行株序列进行比较，结合CIM计数资料分
析HIV一1基因突变与疾病进展程度之间的关系。
结 果
1．LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白氨基酸序列的比较
由env和gag—RT区分型确定的33例B’亚型，与国际流行株HXB2
序列比较，发现：①LTNP组中19位出现R取代K；21位出现S取代A；58
位出现S取代A；65位出现N取代H；67位出现V取代A；69位出现V取
代L。无症状感染组及AIDS组未发现此变异。②无症状感染组及AIDS
组17位出现L取代Q；19位出现N取代K；20位出现P取代T；58位出现T
取代A；70位出现P取代S。LTNP组未发现此变异。③AIDS组中21位出
现L、R取代A；26位出现F、C取代A；39位出现T取代I；58位出现P取
代A；64位出现N取代T；67位出现G、D取代A；71位出现E取代K。无症
状感染组及LTNP组未发现此变异。
由ellV和gag—RT区分型确定的7例B’／C重组亚型中，与流行株
07BC．CN．97．97CN00 L比较，在无症状感染组发现：60位出现P取代R；67
位出现D取代N。在AIDS组发现：58位出现T取代A；62位出现R取代
S。LTNP组未发现上述变异。
LTNP组、无症状感染组和AIDS组Tat蛋白氨基酸序列和流行株序列
有较高同源性，没有发现移码突变和提前出现的中止密码子，对Tat蛋白功
能非常重要的7个半胱氨酸残基和基础区都显示出了极大的保守性。
2．LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白二级结构预测结果
的比较
三组患者Tat蛋白的二级结构预测结果未发现显著差异。结果显示三
组患者中大多数在ta【蛋白的核心区和基础区，尤其是基础区，出现了较多
的d一螺旋(5—6个)，56位存在B一片层结构。
3．LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者HIV—l￡at基因的系统树分
析
在系统进化树上各HIV一1亚型毒株分别与其相对应亚型的国际流行
株序列接近，同亚型内LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者呈混合分布，
无明显集中分布的倾向性。
·2·
结 论
1．我国AIDS人群中，B’和B’C重组亚型HIV一1tat基因第一外显子
氨基酸序列变异与国外对B亚型毒株的研究结果一致，LTNP组中未见22，
28，4l，SO位的基因突变；无症状感染组及AIDS组中均发现发生了58位T
取代A，而LTNP组未见此取代变异，提示其与疾病进展相关。
2．中国AIDS患者在tat基因第一外显子的一些取代变异与疾病进展
有关。
3．HIV感染后的疾病进展与tat蛋白二级结构无明显关系。
关键词
人类免疫缺陷病毒l型；tat基因；变异；亚型
·3·
Study on the gene sequences variations and the second
structure of HIV—l Tat exonl and the relationship
、以th disease progression
Objective
Our study is going to amplify，detect and analyze the gene sequences of the
Tat exonl in the HIV一1 provirus which is integrated in the genome of 40 cases
of HIV一1 infected individuals confirmed by HIV／AIDS confirming lab in our
hospital．The nucleotides and amino acid variations and the second structure are
characterized and the relationship between the variation of HIV—I Tat exonl
and disease progression iS discussed．
Materials and methods
Epidemiological and clinical data and whole blood sample reserved at一
80℃of China HIV infected iudividuals are coliected．HIV—l Tat exonl gene
sequencing：Qiaquick Spin kit is used to extract genome DNA including inte—
grated HIV一1 provirus DNA from whole blood samples．Tat gene specific prim—
ers NP7／ENV——1 is used as outer primers to process the first round nested——
PCR and tat—B／NPl l is used as inner primers to process the second round nes·
ted—PCR on the extracted DNA．1％agarose gel eleetrophoresis is used to de—
tect target amplified DNA fragment，then excise the gel with the target amplified
DNA fragment compared with the marker．Then QIAquiek Gel Extraction Kit is
used to puffy the PCR product within the gel．LI—COR Global IR2 System
DNA analyzer is used to detect the gene sequences．Analyzing sequences of HIV
——1 tat gene nucleotides and amino acid in the HIV——1 infected individuals with
different disease progression：HIV一1 infected individuals are grouped by differ一
．4．
ent disease progression stage．CLUSTAL W program in the BIOEDIT software is
used to do the alignment to produce consensus sequences and the gaps are in—
duced into the sequences to keep complete translation．NNPRIDICT program
(http：／／ncbi．nlm．nih．gov)predict and compare the second structure of Tat
protein．NEIGHBOR(nei#bor—joining algorithm)program is used to produce
phelogenetic tree．Position and type of the HIV一1 tat exonl variations are ana-
lyzed and compared with foreign HIV-·1 searched from HIV Sequence Data--
base．The relationship between HIV一1 tat gene variation and disease progres—
sion is discussed based on comparing the variations and number of CD4+T
PellS
Results
1．Comparing Tat amino acid sequences among LTNPs，asymptomatic HIV
—l infected individuals and AIDS patients：
7
33 cases of B subtype compared with their according international consen—
SUS sequences HXB2：(!)LTNPs：position 19 R substitutes K：position 21 S sub．
stitutes A；position 58 S substitutes A；position 65 N substitutes H；position 67
V substitutes A；position 69 V substitutes L．②asymptomatic HIV一1 infected
individuals and AIDS patients：position 17 L substitutes Q：position 19 N substi—
tutes K；position 20 P substitutes T；position 58 T substitutes A；position 70 P
substitutes S．These variations don’t appear in LTNP group．③AIDS group：po-
sition 2 1 L or R substitutes A；position 26 F or C substitutes A；position 39 T
substitutes I；position 58 P substitutes A；position 64 N substitutes T；position
67 G or D substitutes A；position 7 1 E substitutes K．These variations appear
only in AIDS group．
7 cases of BC subtype compared with their according international consen—
SUS sequences 07 BC．CN．97．97CN001：(．童)asymptomatic HIV一1 infected indi—
viduals：position 60 P substitutes R；position 67 D substitutes N．②AIDS pa—
tients：position58 T substitutes A；position 62 R substitutes S．
2．Comparing the second structure of Tat protein among LTNPs，asympto—
matic HIV一1 infected individuals and AIDS patients：There is not big differ-
·气·
ence in the second structure of Tat protein among three groups．
3．Analyzing phelogenetic tree based on tat gene among LTNPs，asympto—
matic HIV一1 infected individuals and AIDS patients：AⅡtlle HIV—l subtypes
cluster with their according international consensus sequences，but within the
same subtype AIDS patients and asymptomatic HIV——1 infected individuals dis-
tribute together．
Conclusion
I．Same as foreign report，we didnt find the position 22，28，41 and 50 vail—
afions in long term non—progressor B subtype cases；tat exonl position 58 T
substitutes A iS found in China asymptomatic HIV—l infected individuals and
AIDS cases which indicates t}lat these variations correlate witll the disease pro—
gression．
2．It§wonh to mention that we find some other new variations may correlate
with the disease progression．
3．we find the second structure of Tat protein may have no correlate with t}le
disease progression．
Key words
Human Immunodeficiency Virus—l(HIV一1)；tat gene；variation；sub一
·6·
·7·
，、．i 一‘’论 文 ／、}
中国东北地区HIV／AIDS患者tat第一外显子基因
变异特点及其二级结构变化与疾病进展关系的研究
前 言
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是引起获得
性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，
HIV感染／AIDS目前尚无法治愈，也无有效的疫苗预防，其中一个主要原因
就是HIV基因具有高度的变异性。
在HIV的复制过程中，HIV不仅编码了结构蛋白和酶蛋白，而且编码
了一些辅助调节蛋白，其中包括一段由86—130个氨基酸组成的能够调节
HIV转录的反式激活蛋白Tat(Trans—activator protein)。有文献指出，Tat
蛋白在三个方面对HIV的转录进行调节：①促进转录的起始；②作用于
RNA聚合酶II促进转录的延伸；③在不依赖反式激活反应区TAR RNA的
情况下促进NF—KB的转换 。另外，病毒颗粒本身可携带Tat蛋白旧j，提
示该蛋白在病毒复制早期即发挥作用。Tat通过转录反应因子与某些细胞
因子作用形成蛋白一RNA复合物，活化转录启动因子，加强RNA多聚酶IJ
的活性，从而明显促进病毒转录¨1。Tat和长末端重复序列LTR上的反式
激活反应区TAR之间的相互作用不仅包含Tat结合到TAR RNA上，而且
和蛋白激酶复合物TAK相关，Tat／TAR／TAK的三合体的结构对于Tat发挥
反式激活作用很重要。Tat蛋白的高水平表达可以促进大量病毒的产
生H1，而Tat缺失或突变则可能使病毒完全不复制。
国外研究表明HIV一1感染者体内的病毒复制水平决定疾病的进
程口1。快速进展期患者体内的HIV—l复制水平很高，致使CD4+．T淋巴
细胞数量迅速下降，最终进入AIDS期冲1。但无症状感染者体内的病毒载
量通常不高，病毒复制效率也低¨o。由此看来AIDS进展的先决条件是高
水平的HIV—I复制。反式激活因子Tat和TAR的相互作用能够提高病毒
复制水平，作为编码Tat蛋白的tat基因，其变异是否会影响Tat蛋白的二级
·8·
结构和功能，从而改变病毒的复制并影响疾病的进展，国内外尚未见相关报
道。
人们发现只有极少数感染者至少十年内仍保持健康状态，并且CIM+
细胞计数维持正常，学者们称之为长期不进展者(Long—term nonprogressors
；LTNP)隅]。HⅣ感染后长期不进展的原因可能是多方面因素的影响，诸
如病毒的基因突变和毒力，病人血中病毒载量，感染者机体的免疫能力等。
国外学者通过比较HIV一1感染的长期不进展者、无症状的HIV—l感染者
和AIDS病患者体内病毒的tat基因第一外显子发现：长期不进展者体内的
病毒未出现22，28，4l，50位的基因突变，而AIDS患者体内的病毒却发生了
58位和65位的基因突变，提示此突变可能与疾病进展有关¨1。目前，国外
这方面的研究资料主要来自HIV一1 B亚型感染的欧美人群，与我国HIV
病毒流行的情况与人群的免疫状况有一定的差异。
本研究通过我院艾滋病确认实验室几年来收集的40例中国长期不进
展者、HIV感染者及AIDS患者外周血单个核细胞(PBMC)，通过对基因组
中整合的HIV一1前病毒DNA反式激活蛋白Tat第一外显子的基因序列扩
增、测定和分析，初步明确我国HIV一1感染者病毒基因组中tat区第一外
显子基因序列的特征；病毒核苷酸和氨基酸突变的种类及变化；tat蛋白二
级结构预测的特征；探讨HIV一1 tat区第一外显子基因突变及二级结构变
化与AIDS疾病进展的相关性。
实验材料和方法
一、实验材料
l、研究对象：
病例选择：
选取2000—2004年辽宁、吉林两省40例HIV感染者／AIDS患者的流
行病学资料和临床资料。男性患者28例、女性12例，平均年龄37．9岁，感
染时间6—14年。通过献血途径感染的26例(65％)、静脉吸毒途径2例
(5％)、性传播9例(22．5％，其中5例性伴为献血途径感染者)、静脉吸毒
并多性伴3例(7．5％)。根据《2001年中华人民共和国HIV／AIDS诊断标
准》进行疾病分组：无症状感染组19铡：CIM+细胞>1200×106几；AIDS病
组12例：CIM+细胞<200×106／L(表1)。长期不进展者9例(LTNP组)：
．q．
感染期超过10年，未接受抗病毒治疗，CD4+细胞，>500 X 106／LHl。采集
全血标本共40份，EDTA抗凝一80％冻存。
2、主要仪器
紫外分光光度计：(日立，日本)
凝胶成像分析系统：Ultra—Violet Product(UVP，英国)
PCR仪：GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER，美国)
电泳仪：POWER PAC 300(BIORAD，美国)
测序仪：LI—COR Global IR2 System(LI—COR，美国)
3、试剂
1)全血细胞DNA提取试剂盒：QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAgen，
德国)
2)PCR试剂盒：TaKaRa Taq“DR001AM(宝生物工程有限公司，日
本)
3)DNA分子量标准：lOObp DNA ladder(GIBCOBRL，美国)
4)PCR产物回收试剂盒：QIAquick Gel Extraction Kit(QIAgen，德国)
5)测序底物：IRDye TM800 Terminator Mixes(LICOR，美国)
6)测序反应试剂盒：Themo Sequenase Cycle Sequencing Kit(USB coco—
ration，美国)
二、实验方法
1．标本收集：所有血清、血浆标本在采血后4小时内分装冻存于一
80qC。
2．HIV—l Tat蛋白第一外显子基因序列测定
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit按操作说明从EDTA抗凝全血标本
提取基因组DNA(含有整合的HIV一1前病毒DNA)，l％琼脂糖凝胶电泳
检测提取DNA质量，紫外分光光度计定量。
2)提取的DNA以tat调节基因区特异性引物NP7(5’一CAGGTA．
AGAGATCAGGCrGAACA一3’)和ENV—l(5’一TI℃CACACAGCTACCCCA
一3’)为外侧引物进行第一轮PCR扩增，同时设阴性对照和阳性对照；以
tat—B(5’一AATGGAGCCAGTAGATC一3’)和NPll(5’一CCCATAATA．
GACTGTGACCCACA一3’)为内侧引物进行第二轮PCR扩增。首轮反应体
系和反应条件为：总体积30ul，dNTP浓度200 U mol／l，DNA聚合酶0．75U，
引物浓度0．8 U moL／1，核酸样品5ul，及相应的缓冲液。反应条件：94℃
·10·
3min，530C lmin，720C 2．5rain，5个循环；94℃30s，55℃30s，720C 2．5
min，30个循环；72。C 10rain。第二轮反应体系和反应条件：总体积50ul，取
首轮扩增产物5ul，引物浓度0．8u mol／1，dNTP浓度200 u mol／1，DNA聚合
酶1．25U，及相应的缓冲液。反应条件：940C 5min；94℃30s，56'E 30s，
72℃45s，30个循环；72℃10min。
3)取50ul PCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳检测目的扩增片断，与分子
量标准物Marker对比元误后切取该片断。
4)QIAquick Gel Extraction Kit按操作说明回收目的DNA片断。l％琼
脂糖凝胶电泳检测回收质量，并用紫外分光光度计定量。
5)取50fmoles PCR扩增片断为模板，tat—B为测序引物，IRDyeTM800
Terminator Mixes为底物，Themo Sequenase Cycle Sequencing Kit双脱氧终止
法进行测序反应，醋酸钠乙醇沉淀法回收反应产物，LI—COR Global IR2
System测序仪进行基因序列测定。
3．HIV／AIDS Tat区第一外显子核苷酸、氨基酸序列及其二级结构特征
分析
1)下载HIV Sequence Database(http：／／hiv—web．1ard．gov)中HIV—l
各亚型流行株参考序列，用BIOEDIT软件包中CLUSTAL W程序对下载序
列及我们测得的Tat区第一外显子序列进行序列排列比对，并在核苷酸序
列中人工引入gag以保持翻译完整性。
2)以TREEVIEW程序邻位相连法(neighbor—joining algorithm)生成系
统进化树。
3)统计我们测得的Tat区第一外显子核苷酸及氨基酸突变位置和种
类，并检索HIV Sequence Database，与国内外HIV—l‘流行株序列进行比较。
4)以NNPRIDICT程序(http：／／nebi．nlm．nih．gov)预测我们测得的Tat
区第一外显子氨基酸序列的二级结构，并进行分组比对。
结 果
1．LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白序列的比较
由图1可见由caw和gag—RT区分型确定的33例B’亚型，与国际流
行株HXB2序列比较，发现：①LTNP组中19位出现R取代K；21位出现s
取代A；58位出现S取代A；65位出现N取代H；67位出现V取代A；69位
·ll·
出现V取代L。无症状感染组及AIDS组未发现此变异。②无症状感染组
及AIDS组17位出现L取代Q；19位出现N取代K；20位出现P取代T；58
位出现T取代A；70位出现P取代S。LTNP组未发现此变异。③AIDS组
中21位出现L、R取代A；26位出现F、C取代A；39位出现T取代I；58位
出现P取代A；64位出现N取代T；67位出现G、D取代A；71位出现E取
代K。无症状感染组及LTNP组未发现此变异。
由图2可见由env和gag—RT区分型确定的7例B’／C重组亚型中，与
流行株07BC．CN．97．97CN00l比较，在无症状感染组发现：60位出现P取
代R；67位出现D取代N。在AIDS组发现：58位出现T取代A；62位出现
R取代S。LTNP组未发现上述变异。
LT|NP组、无症状感染组和AIDS组Tat蛋白氨基酸序列和流行株序列
有较高同源性，没有发现移码突变和提前出现的中止密码子，对Tat蛋白功
能非常重要的7个半胱氨酸残基和基础区都显示出了极大的保守性。
2，LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白二级结构预测结果
的比较
由图3和图4可见，三组患者Tat蛋白的二级结构预测结果未发现显
著差异。结果显示三组患者中大多数在tat蛋白的核心区和基础区，尤其是
基础区，出现了较多的o【一螺旋(5—6个)，56位存在B一片层结构。
4．LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者HIV—l tat基因的系统树分
析
由图5可见，在系统进化树上各HIV一1亚型毒株分别与其相对应亚
型的国际流行株序列接近，同亚型内LTNP组、无症状感染组与AIDS组患
者呈混合分布，无明显集中分布的倾向性。
·12·
10 20 30 40 50 60 70
△ △ △ △ △ △
B．FR．83．HX MEPVDPRLEP IC褂iPGSQPKT AcTNCYCKKC CFHCqvCFIT KALGISYGRK KRR口RRRAHQ NSQTHQASLS K
Ltnp组
LNl2 Gt· 瓤．G
Jc03 一一．L*S．A Tt ●● 弧．G．
K12 目．K． MK．G
JCl4 ——一一X．． N． MK G．
Jcl7 一一XLDRA ．K，G．
几4 —一X．．．． 眦G．
n12 一一Y*SX ^．．．．． MK G
JL66 B MK．G
无症状感染纽
LN8 ． ． ．L．NP G ．．．．．P．D I(A．
INl6 ． N．．．．．NP G ．． ．．P．D A．
LN28 ．． N． G S．．． ．．D．．
啪0 ．． N． G ．．．．．P D．，
L船7 ．G ．．．P D．．
LN50 ．． ．P
Jcll G．G TP D．．A．．．．．P
R13 K．．．R． 6 ．P D．．． ．．
Jcl6 —-X． G
Jc20 A． ．． G P SN．．．．．
Jc25 G P D．．I． ．．
几35 ～一一．YYS． G
m0 ～～)【I{SR^ S●．．．． G XX．．．P D，．A．．．．，
几179 XLE，． 姒雌眦眦蚍瓤眦儿“眦舭眦眦雠 G ．．．．P D ．．．T．．
AIDS组
LNl0 L．NP G D
I尉19 N． ． G D
LN21 ’， G D
Lw25 N． F G O E
LN26 N． ．L，L C L． I G D N．．．
LN29 N． ．P．．． 一一一叩陋 R 』一～眦一 L．．．． G㈨ D N．．G．．P
●‘ ●● D ．．，D．．，
“48 L．．．．
几25 ～一X．．．．．．．R． L．．． G．G D ￡Jcl5 L．．． G D
Jc26 一HI．0． ．．． 雠蚍眦豫“崃H姒跚畎埔 G 凸：t～一一～一一限作!| D
B．FR．83．HX是B亚型流行株；国外资料报道的氨基酸所在位置用△标出；只存在于
LTNP组的氨基酸变异用方框表示；无症状感染组和AIDS组共有的氨基酸变异用黑体
字母表示；只存在于AIDS组的氨基酸变异用阴影表示；．表示与B．FR．83．HX的氨基
酸～致。
图l B’亚型LTNP组、无症状感染组与AIDS维患者Tat蛋白序列的比较
·13·
10 20 30 40 50 80 70
△ △ △ △ △ △
07_BC．CN．9 WEPVNHKLEP WEHPGSQPKT ACNSCYCKKC CFHCOVCFTK KGLGIFYGRK KRRQRRSAHR SSEDHQNPIS K
1tnp组
LNI ．．．．．N．．．．．．．．． ，．．．．．．．．．．．．．．．M．． ．． ．．P．． L．．
无症状感染组
LN4
．．，． ．，．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．P．．．．．．．L．．
LN23 ．．．N． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M． ．．．．．．，．．．．．．P．．．．．．L．．
LN41 IG．-．．．．．．．．．．．． ．．．．
．．．．．．．．．．．．．． ．．PP．．．．D．．．．
LN43 ．G．．．．N． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．R．．P．．．PP．．．．．L．．N
LN51 ．．．．，N．，．．．．．．．．．，．．．． ．． ，M．．．．S．． ．． P． ．．．．L．
Aids组
LN45 昏．回 ．L，
07一BC．CN．97．97CN001是BVC亚型流行株；国外资料报道的氨基酸所在位置用△标
出；无症状感染组的氨基酸变异用黑体字母表示；AIDS组的氨基酸变异用方框表示；．
表示与07一BC．cN．97．97CN001的氨基酸一致。
图2 BYC重组亚型LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白序列的比较
·14·
LTNP组
HHHHH E，～ H ～ 一 LN
HHHHHH 一E一 一．HE 一 ．LNl 2一 一一 一 ～HHHHH——．．E 一二一 一 一一一JC03
—— 一 一一HHHHHHHHHH ．EEH 一一 ～ 一 ．JCl4 一 一一HHHHHH H EE-HE 一 ～ HHHHH 一E 一
一一
一 一 ．
JJlCl2JL：l 2
HHHHH E 一一一 一 一 JL66
HHHHH E 一 一一一 一一 *．JC】7
无症状感染纽：
～ 一一 ～一 一 一 一HHHHHHHHHHHHHH HH～ ．EEEE～ H 一一 一 ～ 一～ 一一 一 一 JJJCCCll36
一 一～～ 一一- 一．一．H-HHHHHHHHHHHH HH 一一EE—E一— ～～ —一 —一一 一一 一 一一 ．JJCC225079
— —一 — — 一 -一-HHHHHlH{HHHH ￡-E一 一一 ～ 一 一 E EE EH一 H H 一 ～
JLl
～一一一 一 一JL35
～ ～E 一EE 一HH ～

～ 一

．
JL50
．LLNN3208
一 一 HHHHH -EEH—— 一——H 一 HH一．LN43
一 一 一 一 — ～— 一 —— ——一—一一— -H— HHHHHH删HH—H 一EEEEHH 一一一 一 H 一 ～一 一一 H H ～LLNN45l0 一 一 一 一—一— — —HH一HHHHH
HHH HH H —～—E ．一HE LN37
～一一一H ·E 一
H—．—H —一— 一 一一一一一 一．．LLNN58
—— 一 — — HHHHHHHHHHHH -E· H ～～ 一LN23HHH EEH E ～ ---HH E～ ～一 一 ～ H H ～ 一LLNNl46
AIDS组：
一 — — 一 — — HH H·HH一H一HH一 E EH — — 一 ～．一．一 一一一LN2 —— 一 -～ ——· —·一 - —— 一HHHHH一 H ．LN44 一———— ——HHHH—H· —E--一．．H．H．H．H．．
一．．E— ——— -．H—一—． ．．． 一一 一LN45
一 HH—E 一——HE一
．～． ． ．．一．．一．．一 ．L．N．2LN925
— ——— ～～ 一 — — · —H一H— H H HH一HHHH—EH —HH — 一 EE—E — 一～ E一 一 一 一 ．．一．LLLNNN4l2986
一 一～ 一 一 ———— —一—一 H H—HH—H—H — -E — —-HH一 —．—一 H E ～ 一一． H ． 一．一LINCl206
—— ～ 一HHHHHHHHH～ --E 一 一 一 — — 一 ～ ．～一JCL258
H表示螺旋，E表示折叠，．表示无规卷曲
图3 B‘亚型LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白二级结构预测的比较
L TN一P组 ： 一 ———·HHHHH ．E—— ．H LN
无 症 状 感染～
组 ：
一 一
一 HHHHHHHHH一H—一—EE·H EE H 一～H． 一～H 一 H H HH． ．．LLNN44t3
一— — ～ 一 —— —— H—HH—HH删HHHHH～H一HH一～ E·EE HE— — 一 -一 --HHm H ～～～ — 一— H～H一～LLNLNN2543
AID S组 ： —— ——一一HHHHH E ———H LN45
H表示螺旋．E表示折叠，．表示无规卷曲
圈4 B’／C重组亚型LTNP组、无症状感染组与AIDS组患者Tat蛋白二级结构预测的比较
L1INP组患者感染HⅣ一1毒株所在位置用阴影表示
图5 HIV感染／AIDS患者感染的HIV一1毒株系统进化树
·16·
讨 论
HIV一1的基因组呈现出高度的变异性，这些基因水平的差异当被翻译
成有功能的蛋白质后，表现出了生物学性质的差异。Tat蛋白通过调节病毒
转录，来影响病毒的复制，如Tat区发生变异，能够影响病毒的复制。有国
外文献显示从艾滋病患者的体内分离到的HIV一1毒株其复制能力和复制
水平要高于无症状感染者体内的毒株一1
Tat区第一外显子特定位置的氨基酸变异可以影响病毒的复制能力，国
外学者分析感染HIV B亚型的长期不进展者、无症状感染者和AIDS患者
体内病毒的tat基因第一外显子发现，长期不进展者体内的病毒未出现22，
28，4l，50位的基因突变，而AIDS患者体内的病毒却发生了58位T取代
A，65位D取代H的基因突变，提示此突变可能与疾病进展有关¨1。我们
的实验结果与国外报道一致：①LTNP组中未见22，28，4l，50位的基因突
变，但在B’亚型LTNP组中我们发现19位出现R取代K；21位出现S取代
A；58位出现S取代A；65位出现N取代H；67位出现V取代A；69位出现
V取代L，在无症状感染组及AIDS组中未发现此变异。国外学者报告，Tat
区第一外显子22位G取代C，28位R、Q取代K，41位A取代K，50位R、Q
取代K等基因突变会极大的降低病毒的复制能力¨””。。我们发现的上述
位点的基因突变是否会降低病毒的复制能力，还有待进一步研究。②在B’
亚型无症状感染组及AIDS组中均发现17位出现L取代Q；19位出现N取
代K；20位出现P取代T；58位出现T取代A；70位出现P取代S，在LTNP
组未发现上述变异。在B’C重组亚型无症状感染组中发现：60位出现P
取代R；67位出现D取代N，LTNP组未发现此变异。提示这些位点的变异
可能会加快病毒的复制和疾病的进展。③另外，我国B’亚型AIDS患者
LNl9和B’／C重组的AIDS患者LN45都存在tat基因第一外显子58位T
取代A的基因突变，与国外报道一致，并且他们的CIM+T细胞数都非常的
低，但未发现有65位D取代H的基因突变。值得重视的是，我们还发现了
一些新的突变：B’亚型AIDS组中21位出现L、R取代A；26位出现F、C取
代A；39位出现T取代I；58位出现P取代A；64位出现N取代T；67位出
现G、D取代A；71位出现E取代K。B’／C亚型AIDS组中62位出现R取
代S，在各自亚型的无症状感染组及LTNP组中均未发现此变异。提示这些
·17·
位点的突变可能导致Tat调节病毒转录能力的增强，从而提高了病毒的复
制能力，生成大量病毒破坏病人的免疫系统，使病人进入AIDS期。
Tat和TAR RNA结合后才能活化转录启动因子，Tat通过其活化结构
域与cyclinTl的亚单位相结合，这一结合改变了Tat的构象，从而大大提高
了其与TAR RNA结合的亲和力和特异性¨4。 。从而增强RNA多聚酶的
活性，促进HIV的转录口1。Dingwall等人的研究结果表明，所有能降低TAR
RNA和Tat结合能力的变异都会阻断反式激活ⅢJ。Tat蛋白的晶体还未获
得，关于其结构的数据来自核磁共振技术。但由于分辨率低，对其构象的细
节情况的了解，还有待借助更先进的技术。我们试图了解tat蛋白的构象变
化对其调节病毒转录能力的影响。通过对LTNP组、无症状感染组与AIDS
组患者tat蛋白二级结构预测结果的比较，未发现规律性差异。提示我们虽
然三组患者cac蛋白的氨基酸序列存在各自的变异特点，但并未影响其二级
结构的改变，HIV感染后的疾病进展可能与tat蛋白二级结构无明显关系。
结 论
1．我国AIDS人群中，B’和B’C重组亚型HIV—ltat基因第一外显子
氨基酸序列变异与国外对B亚型毒株的研究结果～致，LTNP组中未见22，
28，4l，50位的基因突变；无症状感染组及AIDS组中均发现发生了58位T
取代A，而LTNP组未见此取代变异，提示其与疾病进展相关。
2．中国AIDS患者在tat基因第一外显子的一些取代变异与疾病进展
有关。
3．HIV感染后的疾病进展与tat蛋白二级结构无明显关系。
本研究创新性的自我评价
B’亚型LTNP组中我们发现的一些位点的基因突变会降低病毒的复制
能力，无症状感染组及AIDS组中发现的一些变异与疾病进展有关。
首次研究Tat蛋8--级结构与HIV感染疾病进展之间的关系。
·18·
参考文献
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4】53．
·20·
，- 一—一、
{ 综 述 i
、-，．．．．．．．．．．．—一一_．．．-．．．．一，
HIV转录的重要调控因子：反式激活蛋白Tat
人类免疫缺陷病毒I型(Human immunodeficiency virus，HIV—I)是
一种可引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired immtmodeficiency syndrome，
AIDS)的病原体，HIV感染／AIDS目前尚无法治愈，也无有效的疫苗预防。
随着现代分子生物学的进展，对于HIV生活周期在分子水平上的认识也不
断深入。HIV—I是一种逆转录病毒，HIV在患者体内依赖其表面糖蛋白
gpl20特异性地与含有CD4表面受体的细胞结合，一旦HIV与宿主细胞融
合，病毒的核心部分就进入细胞，然后在逆转录酶的作用下将病毒RNA基
因组转变成双链DNA。某些DNA被转运到细胞核内，依赖整合酶，整合到
宿主的基因组上Hj，但大多数新合成的病毒DNA仍以游离、未整合的形式
保留在细胞浆内。病毒基因整合后，即开始小量的转录。此转录是在结合
在病毒长末端重复序列LTR上的细胞因子和病毒因子的作用下，以整合病
毒DNA为模板合成全长病毒mRNA。经多次剪接后，其中一段2．0kb长的
mRNA，翻译成调节蛋白Tat，Rev和Nef。反式激活蛋白(trans—activator
protein，Tat)通过反式激活启动子的作用影响转录过程。转录产物经过剪
切翻译合成相应的酶和蛋白，组装成病毒颗粒通过芽生从细胞中释放。
自从1985年首次对Hrv—I基因组进行分析后，人们对于感染细胞中
HIV基因组转录调控机制的了解愈来愈深入。HIV—I基因的转录调节过
程涉及到很多因素，包括细胞基本转录因子、病毒长末端重复序列(LTR)指
导的与转录效率有关的转录因子、Tat蛋白、HIV—I基因组5长末端重复序
列的顺式作用元件和反应激活应答元件序列，以及它们之间的相互作用，指
导组装一个稳定的转录复合物，活化转录启动因子，从而加强RNA多聚酶
Ⅱ的活性，促进病毒的转录。有研究表明Tat能够盟显促进病毒转录。Tat
蛋白的高水平表达可以促进大量病毒的产生∞1；另外，病毒颗粒本身可携
带Tat蛋白”1，提示该蛋白在病毒复制早期即发挥作用。由于降低病毒的
复制水平对于艾滋病的治疗非常重要，作为调控HIV转录的主要因子，Tat
蛋白已成为国内外科研工作者的研究热点，现将这方面的研究进展综述如
·21-
下：
1．Tat的发现
HIV病毒的转录、逆转录和翻译过程是由位于病毒的长末端重复序列
(LTR)以及一系列由细胞和病毒编码的调控因子和酶所控制的复杂的调控
网络，LTR是具有诱导病毒转录启动功能的启动子。Sodroski等人首先发
现在即往感染过HIV的细胞中，在LTR的下游引入一段基因后，其转录合
成水平增至未感染的细胞的200—300倍，推测这种转录合成能力的提高或
“反式激活”，是由于在郎往感染过HIV的细胞中病毒表达产生了能够促进
转录的蛋白质反式激活因子Tat作用的结果，而未感染的细胞中缺乏Tat使
得转录水平不高"o，他们在HIV病毒的基因组中定位了编码Tat的tat基
因。
2．Tat蛋白的结构
Tat蛋白的晶体还未获得，关于其结构的数据来自核磁共振技术。Tat
蛋白是由tat基因两个外显子编码的101个氨基酸所组成的，其中第一外显
子编码N一末端72个氨基酸残基，第二外显子编码73—101氨基酸残
基MJ。Tat序列按氨基酸的组成分成几个区域：N一末端激活区(1—19)半
胱氨酸丰富区(20～31)核心区(32—47)基础区(48—57)谷氨酰胺丰富区
(60一76)；每一区域对Tat的功能都很重要：核心区，基础区和谷氨酰胺丰
富区均和RNA结合有关，其中基础区可作为与RNA结合时的定位信号。
半胱氨酸丰富区的作用目前还不清楚，推测其可能与金属离子的结合有关。
3．Tat在HIV转录过程中的作用
有文献指出，Tat蛋白在三个方面对HIV的转录进行调节：①作用于
RNA聚合酶促进转录的延伸。②促进转录的起始。Tat蛋白通过与核因子
p300·CREB结合蛋白作用使染色体的结构发生改变，Tat蛋白对转录的起
始作用依赖8pl和NF—KB的存在Ⅲ。据报道spl结合位点对于HIV一1
LTR的基础转录和Tat介导的转录都是必需的。在Tat介导的转录过程中，
Tat与spl结合形成蛋白复合物，同时Tat可募集DNA依赖的蛋白激酶将
spl磷酸化。有证据表明只有磷酸化的spl在转录过程中才具有活性H1。
可见spl在活化转录时也要受到Tat蛋白介导的强有力的反式激活作用。
③在不依赖TAR RNA的情况下促进NF—KB的转换归o。
(1)Tat／TAR RNA的相互作用
Tat蛋白可以激活与HIV核心启动子结合的不稳定的RNA聚合酶，由
．22．
于转录复合物内在的不稳定性，在缺少病毒编码的反式激活蛋白Tat的情
况下，RNA聚合酶由于低磷酸化不能沿病毒基因组有效延伸，转录便会提
前终止。在此过程中只能合成一个不成熟的短转录产物，位于LTR上起始
位点的下游，转录+1一+59核苷酸¨0|。其5端有一个稳定的可抵抗核酶
的干环结构，称为反式激活反应区(transactivation—responsive region，
TAR)[11 J。而Tat蛋白在细胞周期素T1的协同作用下能结合TAR序列，并
募集细胞周期素依赖的蛋白激酶9(CDK9)至HIV一1的LTR。Tat蛋白、
TAR RNA和Tat相关激酶(Tat associated kinase，TAK)组成的三合体能使
RNA聚合酶解除阻遏，转录得以延伸。
对于Tat能够刺激HIV转录的最简单的解释是：Tat和TAR RNA结合
后才能活化转录启动因子，从而增强RNA多聚酶的活性，促进HIV的转
录¨“。Tat识别TAR需要在TAR RNA顶端附近有含尿嘧啶u丰富的突起
结构，并且G26：C39碱基对必须就连在凸起的上方。Aboul等人通过核磁
共振方法研究发现当Tat结合到TAR RNA的同时，干环样结构中突起结构
的U23被Tat蛋白基础结构域中的一个精氨酸侧链所替代，被替代的U23
残基和G26：C39碱基对形成了一个和精氨酸结合的“口袋结构¨31。这种
构象改变也发生在TAR RNA主干的磷酸盐上，借此它们可以和其他TAR
RNA结合区的基本残基相接触，从而保证了与Tat高亲和力的结合¨“。
虽然在体外研究表明Tat是一种高度特异的RNA结合蛋白，但这些研
究并没有证明Tat识别TAR RNA发生在细胞的生命周期中，为了表明这个
机制的真实性，还需要联系体外Tat对TAR的结合和体内的反式激活。
DingwaU等人的研究结果表明，所有能降低TAR RNA和Tat结合能力的变
异都会阻断反式激活¨“。说明体内Tat和TAR RNA的结合对于HIV的成
功转录具有十分重要的作用。
(2)TAK
CyclinTl：
Rice和他的同事们首先报道了蛋白激酶复合体，称为Tat相关激酶
(Tat associated kinase，TAK)¨“。TAK包括依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶
9(CDK9)和细胞周期蛋白Tl(eyelinTl)两个亚单位¨7。81。很多年前人们
就了解到TAR RNA顶部环的序列尽管对有效的反式激活很重要，但对Tat
结合并不需要¨ ，这种遗传学的特点说明环部是Tat辅助因子的结合位
点。Wej等人报道了第一个识别TAR RNA顶部环的细胞辅助因子，cy．
-23·
clinTl和Tat和TAR RNA形成的三合体可以从凝胶电泳中探测到。遗传
学很快确定cyclinTl是“环部因子”，Tat通过其活化结构域与cyclinTl的亚
单位相结合。游离的Tat蛋白结构松散，其基础区和半胱氨酸丰富区的结
构是高度易变的，这一结合改变了Tat的构象，从而大大提高了其与TAR
RNA的结合的亲和力和特异性¨8|。需要指出的是cyclinTl本身对RNA没
有亲和力。Tat与cyclinTl的结合需要有zn“离子的存在，并且与两者在
特定位置上的半胱氨酸残基有关。如果cyclinTl第261位的半胱氨酸残基
发生缺失，就只能与Tat形成一个松散的复合物，并且使得Tat与TAR RNA
的结合能力大大下降旧 。当cyclinTl与Tat连接并结合于TAR RNA后又
可招募Cdk9，形成正性转录延伸因子b(P—TEFb)。在此复合物内细胞周
期素cyclinTl起着连接Tat和Cdk9的作用，而后二者并不直接接触u 。
Tat／TAR／TAK的三合体的结构对于Tat发挥反式激活作用是十分重要的。
HIV一1的转录延伸之所以要通过cyclinTl作为中介，可能是HIV一1
可以根据细胞内的cyclinTl的水平调节转录活性，控制病毒蛋白的合成，以
便在适宜的时候发挥感染作用H“。也就是说cyclinTl是HIV一1转录的感
受器。
CDK9：
CDK9是一种依赖cyclinTl的蛋白激酶，它的底物是RNA多聚酶的羰
基末端结构域(CTD)中的丝氨酸和苏氨酸残基。CTD的磷酸化使RNA多
聚酶的延伸特性发生显著改变，使其能克服转录延伸的两大障碍。第一个
障碍是HIV一1 RNA形成的于环结构一TAR序列。它能使RNA多聚酶的
转录提前终止并释放转录产物。第二个障碍是HIV—l基因组携带的能够
使DNA发生弯曲的序列。此序列可导致转录终止，但不能诱导转录产物的
释放‘ 。
CDK9在促使RNA多聚酶的CTD磷酸化，使得转录延伸的同时，其自
身C末端的数个丝氨酸和苏氨酸残基也会发生自我磷酸化，这对于Tat—
TAK复合物能以高亲和力结合于TAR RNA是必须的。非磷酸化的CDK9
会强有力地阻断Tat与TAR RNA的结合旧’。
人们发现CDK7和CDK2同样可以使RNA多聚酶的CTD磷酸化，区别
在于它们作用予CTD上不同的氨基酸位点。不同的磷酸化位点对HIV—l
转录的影响还有待阐明，但是可以推测Tat可能使用不止一条途径促使
RNA多聚酶的CTD磷酸化ⅢJ。
·24·
遗传和生化的研究提供了TAK在反式激活机制中的作用。首先，依赖
Tat的转录能被蛋白激酶抑制剂如DRB抑制，并且一系列新的蛋白激酶抑
制剂能够抑制HIV复制∞]。其次，CDK9变异物的过度表达反而导致了
TAK活性的抑制，相应地抑制了Tat依赖的转录∞3。最后，抗CDK9的抗体
介导的Hela细胞核提取物免疫缺失，其产物对Tat不能起反应，但加入
TAK则可保留其反式激活作用哺o。以上实验间接地指出了TAK与Tat的
相互作用才能促进转录，TAK和Tat在转录中具体如何相互作用还有待进
一步的研究阐明。
(3)Tat相关的转录机制
Tat能够通过与LTR上的TAR RNA结合，激活一个不稳定的RNA多
聚酶，该RNA多聚酶具有内在的不稳定性，当Tat不在细胞中时，RNA多聚
酶或者停止，或者当转录经过TAR之后从模板上脱落。
反式激活过程中，RNA多聚酶CTD被不同的激酶相继磷酸化。负责起
始复合物前的磷酸化的是CDK7，一种和HIV LTR启动子TATA BOX相结
合的TFⅡD起始因子的重要成员¨ 。RNA多聚酶CTD的磷酸化是和启
动子的清除有关的早期限速步骤。清除启动子之后，磷酸化的多聚酶能够
转录通过TAR区，在TAR区的转录过程中，合成TAR RNA干环样的结构
就是Tat结合到转录复合物的信号，Tat和TAR之间的相互作用不仅包含
Tat结合到TAR RNA上，而且和蛋白激酶复合物TAK相关。
TAR RNA的干环结构为Tat，TAR RNA和cyclinTl形成三合体所必须
的，TAR RNA和cyclinTl的构象改变与Tat相结合，并改变CDK9的构象，
从而激活TAK中的CDK9，导致CTD的过磷酸化，产生更具延伸能力的
RNA多聚酶。使转录复合物变得更具延长性，除了Tat和TAK的RNA多
聚酶CTD的修饰外，可能还需要其它的蛋白的磷酸化。纯化的TAK能够
自动磷酸化导致CDK9和cyclinTl的修饰¨虬”西3，从而也促进了Tat和TAK
和TAR RNA之间的相互作用悼”。同时，TAK能够逆转DBR敏感的诱导因
子(DSIF)的早期转录的负效应。转录因子Spt5也是Tat激活转录的基本
辅助受体ⅢJ。所有这些磷酸化在转录中是如何协调的是现在需要研究的
课题。
4．细胞外的Tat
Tat除了扮演重要的转录调节因子的角色外，还有很多证据显示Tat作
为细胞外蛋白在HIV的致病过程也起作用。HIV感染的细胞能分泌
·25·
Tat【29J。而且，细胞外Tat通过与细胞表面受体相互作用，然后进入细胞核
中，激活一系列细胞基因，包括细胞因子IL一6、IL一2、TNF一仅L301及CX—
CR4、CCR5等细胞因子的受体¨“。外源性Tat的另一个重要的靶部位是血
管内皮，能够诱导血管发生和炎症口“，参与卡波济肉瘤的形成口31。外源性
Tat还具有细胞毒作用：Tat能够介导T细胞的凋亡和神经细胞的死亡。
绝大多数的细胞外Tat的作用是暴露于重组Tat的组织细胞来研究的。
不过，还不清楚在HIV感染时Tat的释放是否能够产生活体内相似的作用。
应用动物模型来研究细胞外Tat在HIV致病过程中所起的作用是科研工作
者面临的问题。
5．Tat对逆转录的作用
在逆转录过程中，Tat是在逆转录过程的早期，如病毒的安装或逆转录
起始过程中发挥作用的。可能仅参与了对激酶的激活，而对逆转录没有直
接作用ⅢJ。最近，Ulich C等人观察带有缺失tat基因的前病毒的一系列
293个细胞系，这些细胞中转染有稳定的野毒株tat或变异株tat的载体，这
些tat刺激HIV—l的转录和逆转录作用可以进行比较。氨基末端变异的
tat基因没能刺激病毒的转录和枷V—l的逆转录，而在启动区、核心区、和
基础区结构域变异的tat基因虽也没能刺激HIV—l转录，但是显著的刺激
了HIV—I的逆转录。两者的病毒基因组水平RNA或tRNA31ys并没有明
显区别，逆转录酶的水平也相似，这说明排除掉RNA水平和逆转录酶的水
平的影响，tat的启动区、核心区、基础区结构域和氨基末端对于HIV转录都
是必须的；但对于病毒的逆转录，只有氨基末端区是必须的，而启动区、核心
区和基础区结构域却是不必要的。而且，参与Tat激活HIV—l转录的
CDK7和CDK9的过表达并不能弥补由于缺乏tat基因造成的逆转录的缺
陷，这排除了并不是缺乏TAK而影响了Tat调节转录的作用。这些实验说
明Tat有调节逆转录的作用，并且调节HIV一1逆转录的机制和激活HIV—
l转录的机制并不相同¨“。
6．研究tat基因变异的意义
HIV的基因变异对于HIV流行病学、致病机制、诊断、治疗和疫苗设计
等方面都是至关重要的。①my的变异可以造成不同时间不同人群检测到
的HIV核苷酸序列有所差异，这为寻找某一种HIV毒株的来源、传播的时
间及传播的方式提供了分子水平的线索；②同一感染者的不同疾病阶段以
及同一疾病阶段不同组织中分离到的病毒株核苷酸序列存在多样性，病毒
·26·
基因序列的改变引起了病毒生物学表型和毒力的变化，相应的，宿主的临床
症状及疾病进程也发生了变化；③目前对HIV的检测方法主要是使用血清
学检查方法，但由于HIV的高度变异性，且各抗原决定簇产生的特异性的
抗体有一定的差异，因而产生不同的抗原抗体反应，导致漏检；④治疗中的
病人，HIV在抗病毒药物的作用下，药物作用靶位的氨基酸序列会发生选择
性的突变，产生耐药株从而使病毒载量反弹，导致药物治疗失败；⑤病毒可
以通过包膜蛋白氨基酸序列的改变逃脱免疫系统的监视，造成免疫无应答
状态，使针对单一亚型的疫苗失效。因此，HIV基因变异正日益成为HIV
研究领域的热点问题。由于Tat调节蛋白是HIV复制过程所必需的，编码
Tat的tat基因的变异必然影响到病毒的复制和HIV感染者疾病的进程 ，
有研究指出尽管绝大多数的HIV的进化都是发生在eriv区和gag区，但是
tat，作为一个相对保守的区域，同易变的env区相比是一个更好的建立流行
病学的研究对象p“。
自从1985年发现Tat以来，由于它在HIV复制中起的重要作用而倍受
人们的关注。Tat是真核细胞中首个调节转录延伸的蛋白，在Tat发现前，
转录延伸一直是转录调控中被忽视的领域，而转录延伸是保证转录的前提
条件，成功的转录才能确保HIV的复制，因此针对Tat的抗HIV药物或疫苗
将会抑制HIV的有效复制，从而达到治疗和预防AIDS的目的。细胞外Tat
的致病作用和Tat在逆转录中的作用最近才发现，但具体的机制还不十分
清楚，还有待于进一步的研究。
国内邵一呜等通过分析云南省HIV感染的长期不进展者tat基因的序
列，未发现长期不进展者与一般B亚型感染者的Tat蛋白序列的规律性差
异，认为HIV感染后的进展速率可能与HIV一1tat基因序列无明显关系∽o。
本室文小宁等研究发现我国的AIDS患者存在tat基因第一外显子58位T
取代A的基因突变，与国外报道一致，但未发现有65位D取代H的基因突
变，而是发现了一些新的突变，提示这些取代变异可能与疾病进展有关。但
上述研究由于样本例数较少，HIV亚型、分布地区及感染人群存在局限性。
另外，除了对不同疾病进展阶段HIV感染者tat基因变异的研究，Tat的一
级结构和二级结构变化是否能影响病毒的复制及疾病的进展是值得进一步
探讨的问题。
·27·
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·32·
{，、一 致 ～谢 ，、÷
本文从选题、实验设计、组织实施、整理总结以及论文的撰写始终得到
导师尚红教授的不倦指导与教诲。临床试验实施过程中，得到了P3实验室
及检验科全体老师和同学热情无私的帮助，在此一并表示诚挚的谢意!
·33·
{，‘一个人 简 介一、{
自然情况：
姓 名：张岩
性 别：男
出生年月：1973年3月2日
籍 贯：辽宁省铁岭市
民 族：汉族
简 历：
1991年9月一1996年7月 大连医科大学检验医学专业
1996年7月一至今 中国医科大学附属一院检验科
2002年9月一至今 中国医科大学附属一院临床检验诊断学专业
硕士研究生
·34·川农业大学
硕士学位论文
苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达
姓名:杨洲平
I请学位级别:硕
专业:生物化学与分子生物
导教师:黄乾明
2007060
论文独创性声明
本人郑重声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的
成果。尽我所知,除丁文中特别加以标注和致谢的地方外,学位论文中不包含其他个
人或柴体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四用农业大学或其它教育机
构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均
在论文中作了明确的说明并表示了谢意
研究生签名:扬州婀年月2日
关于论文使用授权的声明
本人完全了解农业大学有关保留、使用学位论文的
学校有权保留
并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以
呆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不
同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。论文所涉及的知识产权
属于四川农业大学,公开发表论文的第一作者单位和通讯作者单位必须是四川农业大
研丸生签名:书叫
ao7年b月z日
导师签名
轮啊m)年6月2日
四川农业大学硕士论文
苦瓜抗HV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达
专业:生物化学与分子生物学
研究生:杨洲平指导教师:黄乾明教投
摘要
I型核糖体失活蛋白MAP30,是从苦瓜种子和果实中分离纯化的一种病
毒抑制剂,具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌作用。本文根据已发表的MAP30基因的序列
比对结果,釆用PCR法从精选白皮苦瓜(X、穗农早优苦瓜(zY)、碧翠苦瓜(BC
银田长苦瓜(YT)和银田蓝山大白苦瓜(LAN5个品种中克隆得到5个长度均为
86Ibp的MAP3基因,即MAP30、ZFMP50、 LAN-MAP30, BC-MAP30( Genebank
accession No:DQ643967)和 YT-MAP3ODQ643968,其中除 BC-MAP3和 YTMAP30
基因与已报道的MAP30基因(A294541)不同,存在变异位点外,其余均相同。因此
本研究重点对 BC-MAP3和 YT-MAP30的核苷酸以及推测的氮基酸序列进行了分析
并利用生物信息学方法对其蛋白质二级结构作了预测。此外,还对 YT-MAP30基因
的完整编码区YT》和成熟蛋白编码区(YTm)片段同时进行了原核表达工程菌的构
建、表达条件的优化以及表达产物的 SDS-PAG检测、可溶性分析和蛋白质杂交分
析等研究工作。其主要结果如下
序列分析表明, BC-MAP30和 YT-MAP30的核苷酸序列与已报道的MAP30
基因分别存在2个和3个碱基的不同,但均编码
氨基酸残基组成的成熟蛋白
BC-MAP30和 YT-MP30基因的推导氨基酸序列与其他葫芦科植物的I型核
糖体失活蛋白以及天花粉毒蛋白、多花白树毒蛋台、肥皂草毒素蛋白的氨基酸序列
源性分别为6890%8275%、7125%和6645%且其第
0位氨基酸序列
较为保守。利用生物信息学进行的二级结构预测表明,在 BC-MAP3和 YT-MAP90
蛋白的整个二级结构中,无规则卷曲含量最高其次是e螺旋和β折叠。信号跃
富含c螺旋和无规则卷曲:N端区富含β折叠和无规则卷曲:高度螺旋区富含c螺
旋;C端则富含无规则卷曲
3.DNA测序结果表明,在重组表达质粒中, YTrMAP30和 YT MAP30的序
列和插入位点正确。 SDS-PAGE分析结果显示, pET-YTmMAP30B121工程菌在维普资讯 http://www.
中国性病艾越病防治 2001年 8月第7卷第 4期 Chin J STD／AIDS P v c。nt V0__8 N0 4 Aug 2001 241
·综述·
HIV基因结构及遗传信息传递研究
徐 小元
人类基因组计划接近完成，随后的基因组后计划 TATAbox，与 RNA转录密切相关。
足进一步寻找和确定大量致病基因并 『l解其功能，这 R区基因片段含有 98个核苷酸(454～551nt)，重
要求我们进一步研究像 HIV、HBV等病原体的基因 复出现于病毒RNA的5’和3’端，该区域含有 ILNA转
结构和特点，基因组的表达和调控，从基因序列构成， 录起始位点，在R区内有一个重要的正向调节序列即
染色体定位，基因组变异等方面入手，为抗 HIV治疗 反戎激活反应片段(TAR436—504nt)，它的起始部位于
开辟一条新途径。 U 区内，掏成HIV tat 基因激活 HIV基因表达所需的
HIV是 RNA病毒．属慢病毒科(Lentiviridae)， 人LTR一部分。在 R区近 3’端还存在一腺苷酸残基
分 HIV一1型 和 HIV一2型，病 毒基 因组长约 信号。R与 u 交界处是多腺苷化位点。
9．7KB，共由9个基因片段，3个结构基因编码病毒 u 区基因片段含有84个核苷酸(552～636nt)，
结构蛋白：gag基因编码核心蛋白 p17，024和 p13 这段基因相对稳定，较少变异，可在此区选择 PCR扩
等，env编码包膜蛋白gp120，gp41，pol编码病毒复制 增引物。有研究认为 u5区可调节 gag基因区的表
所必需的逆转录酶，内切核苷酸酶和蛋白合成酶。 达，用酶切除此区后，gag表达将受到影响 。
HIV还有 6个开放读码框架(open reading frames， LTR在 HIV复制中是非常重要的，合成 DNA
ORF)，编码功能不同的蛋白，其中 3个是调节基因， 第一条链的 tRNA引物结合位点(pbs)，在5’端 LTR
tat是反式正向调节基因．能增加所有基因表达， 的3’端一侧，DNA第二条链合成的起始位点即多聚
能增加 gag和 env基因表达，nef为反式负向调节基 嘌呤(ppt)在 3’端 I TR的 5’一侧。
因，另 3种基因与病毒的成熟，装配和释放有关，vif gag开放读码框架约位于 681～2254nt。有 80～
编码病毒传染因子．vpu基因编码病毒蛋白U，vpr编 170nt与 pol片断重叠，791～1184nt基 因片段编码
码病毒蛋白R。HIV一2与 HIV一1核苷酸序列差异 p17即基质蛋白，1187～1877nt基因片段编码核心蛋
较大．仅 40％～5O％相同，但基因结构基本相同，只 白024。D17和 204具有群的特异性，目前检测 HIV
是 HIV一2无 vpu基因．而存在 vpx基因。 使用 024。1922nt以后的基因片段编码 p7和 p9。
l HIV基因结构特征及调控 gag基因首先转录翻译一个 512个氨基酸的多聚蛋
长末端重复序~q(LTRs)：在 HIV5’端和 3’端各 白前体分子 p53，经过水解成为各区域编码的4个较
有一 LTR．它包含调控病毒基因表达的DNA序列， 小的产物，NH2一pl7—204一p7一p9一COOH9。在
每个 LTR约 636个 bp，在 PNL4—3为 1～636nt，分 羟基的gag蛋白质有一段富含半胱氨基酸序列，在病
成 U ，R，U 三个区域。 毒 RNA基因组的包装中起主要作用，p9在逆转录病
u 区基因片段，453nt，该片段中有许多序列在 毒核心结合到脂质膜上起一定作用。
病毒基因的转录调节方面起重要作用。NRE位于 Pol开放读码框架位于2084～5094nt，它的5’与
u 5’端 185～350nt处，具有负调节的作用，NRE缺 gag片段重叠，3’与 vif重叠，基因序列为 NH 一蛋白
失可导致 RNA转录增加，u 区还包含两个对病毒 酶一逆转录酶 (p66／p51)一内切 核酸酶 (p32)一
RNA转录有正效应的调节区，一个是 11个 bp组成 COOH。2254～2548nt编码蛋白酶。约 10KD大小，
的两份串联拷贝和一个核因子(NF—KB)结合．另一 负责 gag和 gag—p01前体分子的加工。p01基因和
个在 NF—KB 3’的下端，即转录因子 SP1，HIV SP1 5’的gag序列使用不同的读码框架．为使用一种允许
在体外转录系统及传染中，对 LTR引导 RNA合成 poI基因翻译的策略，gag和 poI片段相互重叠，使核
起重要作用。在 u 区25nt处有一段 DNA序列，称 糖体框架相互转换，gag读码框架进入 p01框架，形成
gag—pol融合蛋白并加工成 gag多肚产物的pol基因
作者单位：北京大学第一医院(100034)
产物。HⅣ 逆转录酶(HIV RT)是由2551nt开始的一
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242 中国性病艾港病防情 2伽1年 8月第'卷第4端 Chinj STI~AIDS prey(_航t Vol 8N仉4 ANg．瑚 1
段基因片段编码的，有两种形式：p51和 p66，它们的氡 促使已感染 HIV 1的胞膜与 HIV分离；从而加速
基端序列相同但羟基端不同，终止的区域不一样，推测 病毒的复制和宿主染色体的整合。研究发现 vpu还
由于这种羟基端的不同，也是导致 HIV活跃变异的原 参与env基因的变异。
因之一。在 3’端编码一个 31KD的蛋白质，具有内 vpx病毒蛋白分子量为 12KD，推测 vpx与 vpr有
切核酸酶活性即内切核酸酶，它能够把前病毒 DNA 相似作用，是病毒进行复制所必须的，研究表明 vpx与
(Drevious DNA)整合到宿主 DNA中，内切核酸酶能交 病毒致病力有关．有vpx片段存在的病毒致病力较弱，
错切开宿主染色体 DNA，将前病毒 DNA插入连接到 在 AIDS进展者和死亡的感染 SIV动物模型中发现均
宿主DNA中，在插入的过程中每个 LTR末端丢失2 缺失vpx增强片段存在。缺失vpx的变异病毒株毒力
个 bp，同时新插入的前病毒两侧产生重复序列。 大大增强，而缺失 vpr的变异毒株毒力减弱。
vif开放读码框架(5041～5619m)，vif 5’端与 pol env基因片段位于 6222～8781nt。编码 gp160，
基因的3’端重叠 53～86个核苷酸，vif区域的 3’端 大约 850氨基酸，gpl60经水解分解 成外 膜蛋白
有多个 3种读码框架的终止子，因此不能编码一个功 gp120(6306～7743m)和一个可能被糖基化的跨膜蛋
能性多肽，但它能转录为 5．0kb大小的 mRNA，翻译 白gp41，gpl20通过二硫键与 gp41结合，并附着在病
成 23KD大小的蛋白质，即病毒传染因子，与 HIV的 毒颗粒的表面。gpl20含有几个与病毒感染有关的
细胞毒性 密切相关。 重要区域，其中包括病毒附着到靶细胞过程中和 CD
vpr开放读码框架(5 560～5 847nt)编码 96个氨 分子相结合的区域，gp41除了有把 gp120固定在病
基酸的蛋白质，14KD大小．称病毒蛋 白 R，它能与 毒颗粒表面的作用外，在附着的病毒颗粒与靶细胞融
gag p6相互作用，vpr位于感染的细胞核酸内，它与 合方面也起一定作用。
病毒进入感染的细胞核，阻止受染细咆生长，细咆基 HIV膜基因env的一个重要特征是不同的病毒
因问转录和细咆损伤有关 J。 株间核苷酸序列显著不同，env包含高度保守区和高
tat基因由二个基 片段组成，编码的 14KD蛋 度可变区，它的高度变异性对疫苗研究产生很大的困
白质是 HIV基因表达的反式正向激活因子，由剪接 难。许多高度保守区存在对所有 HIV分离株env基
的1．8kb的 mRNA所编码，该 mRNA含两个编码外 因共有的特征．这些特征包括与 CD4分子的结合，病
显子，一个位于 5 830～6 046nt，另一个较小位于 8 毒的内在化，合胞体的形成及 gp120与 go41问的结
371～8 442nt，基因产物能够明显地激活由HIV LTR 合。不同的 HIV env表达蛋白质经比较，显著特征
启动的基因表达，并可作为抗终止子阻止 LTR R基 之一是半胱氨酸残基的极端保守。在外膜蛋白质中
因片段 HIV转录的终止，还有转录后的增强效应，当 所有 18个半胱氨酸残基是保守的，跨膜蛋白质中除
体内病毒复制能力低下时，借助 tat基因的调控l3 J， 了一个半胱氨酸残基外．所有的残基也是保守的。
H1V很快能达到一个高水平的复制状态。因此，tat nef基因以往曾称为 3’ORF(8788～9403nt)。
基因对高水平的病毒复制密切相关。 从2．0kb的 mRNA转录而来，表达27KD的蛋白质，
rev基因是 HIV表达的第 2个所必须的调节因 主要存在感染细胞的细胞质和胞膜上，是病毒复制的
子，两个开放读码框架均与 tat区相重叠，但采用的 反式负向调节子．但是在病毒扩散和疾病进展中它又
是不同的读码框架．分别为 5 970～6 044nt和 8 369 是必不可步的，新进研究发现 J，nef不但能抑制病
- 8 639nt．rev蛋白质是由 1、8kb的 mRNA翻译而 毒复制，降低 CD4分子活性，起调节作用；含有 pxxp
来，分子量 19KD．rev通过的 RILE的反式调节，提高 增强子的 nef因子还能促进 HIV生长，增强病毒的
核内的输出和含有 RRE的 mRNAs的利用，从而加 感染力，维持高病毒含量，在病毒复制中起重要作用。
速核咆质中病毒动态循环式复制，rev是慢病毒属共 2 HIV基因高度变异的特性和遗传信息的传递
有的调节蛋白，是 gag和 ∞v RNAs的加工和翻译过 通过对大量的 HIv毒株全基因序列分析：发现
程中需要的蛋白质。 gag和 pol基因区相对比较保守，env区变异较大．env
vpu基因编码病毒蛋白U，在 HIV一1和 HIV一2 区编码的膜蛋白gpl20和跨膜蛋白gp41与其它逆转
没有相似的基因区，在 HIV一1 vpu基因片段位于6 录病毒相比有它的独特之处，即病毒蛋白较大。大多
061～6 304nt，在 HIV一2替代为 vpx区。vpu是 数逆转录病毒的膜蛋白为 300～400个氨基酸，跨膜
16KD大小的蛋白质，主要由2种生物学功能(1)促 蛋白为 180～200个氨基酸，而 HIV的 gp120为 480
使进入细胞的 HIV与 CD4分子受体分离脱落。(2) 个氨基酸，gp41为 350个氨基酸，这样，在 gp120变
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中国性病艾滋病防浩 2001年 8月第 7卷第 4斯 Chin J STD／AIDSPr lv Cont Vd．8 No 4 Aug 2001 243
异区多了约 125个氨基酸 在gp~1多了约 150个氨 分子持续地处于封闭状态，HIV 1 gpl20与 c 分
基酸。env基因产物含有交替相间的保守区和高度 子处于分割状态，从而阻止 HIV 1进入靶细胞。
变异区，变异区的存在影响着氨基酸顺序的改变，以 CCR5一△32基因突变能影响 CCR2—64I基因突变
改变宿主本来有可能存在的中和抗体不能与病毒表 频率，主要原圉是 CCR2和 CCR5两者第3号染色体
面蛋白所结合，变异区成为病毒的保护伞，逃脱机体 紧靠在一起，CCR2 64I等位基因的突变可延缓
免疫反应的攻击 J。 HIV 1感染者发展成为AIDS，使感染者长期停留
env基因变异区高度变异的特性，推测可能通过 在进展状态，有利于个体的存活。CCR2 64I阻止
一
种或多种机制发生：(1)无校正功能的 RNA聚合 病情发展的机制可能是：(1)通过减少血浆中的病毒
酶是引起基因变异的主要原圉。(2)此区的 RNA较 含量和 CD 细胞破坏率。(2)CCR2的浓度和结构功
多的暴露于聚合酶。(3)由于免疫压力等因素发生强 能的变化间接地影响HIv一1结合靶细胞上的CCR5
的变异选择而显示高度的重组率。(4)缺乏对抗变异 辅助受体。CXCR4的变异常位于它的配基 SDF1 3’
的选择性，允许任何不阻碍翻译的顺序存在。常见的 的非编码区l6 J，变异后不同基因型对 HIv 1感染有
变异为缺失，插入、倒置、重复和点突变 不同的影响，一般认为 SDF1 3’端变异后具有保护作
HIv的变异特征可以通过遗传信息传递转移到 用。但也有研究认为 SDF1 3’端变异后促进了病情
子代，在传递过程中逆转录酶(也称 DNA聚合酶)先 的进展，更易发展为AIDS，特别是 SDF1 3’A／3’A
形成病毒RNA的单股 DNA拷贝，另一种相关的酶 纯合子基因型的感染者更易加快发病和死亡。辅助
一 核酸酶(即逆转录酶)破坏原来的 RNA，DNA聚合 受体基因突变是多种多样的，发生机制还未完全清
酶再以第一股 DNA为模板合成另一股 DNA，这时以 楚。CCR5突变在白人中发生率较高，亚洲人种以
双股 DNA形式存在的病毒遗传信息向细胞核移动， CCR2 64I突变为主，它们对人类的保护作用还有
在内切核苷酸酶的作用下，将HIv基因组(包括变异 待进一步研究。
遗传信息)拼接到宿主细胞 DNA(前病毒)。这种遗 近年来对 HIv基因的研究，为我们提供了弄清
传信息的传递受多种因素调控。tat(tat ，tat2和tat ) HIv感染宿主细胞，破坏宿主免疫功能，逃避免疫攻
编码的调节蛋白作用于病毒末端重复序列 LTR，通 击和抗病毒治疗。病情急剧进展等复杂的生物学框
过选择性调节变异株大量复制，使之适合于生存环 架，为人类最终战胜艾滋病奠定了基础。
境，变异抹的毒力可增强或减弱。在这种调节过程 (王勤环 斯祟丈 审柱)
中，未变异不适合生存环境的毒株受到抑制。tat 和 参 考 文 献
tat，主要是转录水平上的调节，tat 是转录水平后的
1 Kwong P D Wgatt R Kobi~ net a1．Structure of an HIV gpl20 eⅡ-
调节。研究表明：LTR单独也具有对 HIV的调节功 velope glympmtein in c~ plex with the CD4 ㈣ and neutraliz-
能。LTR的 NILE区为负调节因子，删除这一区段， hag h tlb3dy Nature．1998，393(6686)：648～659
2 Fortia J F， Pmtin R， L t ne G，et la Host derived ICAM·1
HIv基因表达增加了 3～6倍，LTR的 TAR为转录
g】y pro ns incorporated on human immunodeficie~y v type l
活化区，具有增强子效应，与 NRE相互作用，决定 are biok~ically active and即 haI e viral inf~tivity．J-Vim]．1997 ．71
HIV基因的表达强度。 (5)：3 588～3 5％
3 Ki~hhoff F．Gr~nough T C Brettler D B，er a1．Brief rq~ort：ab
3 HIV—l感染的相关基因
of intact nef sequen~ in a long tem sur~vor with nonpr。g—
HIV 1侵入宿主细胞需要 CDd分子和趋化因
fiveHIV 1 infection N Engl—J—Med，1995．332(4)：228～232
子受体作为进入细胞的门户。依其结合配体的不同 4 Wyatt R．K～ g P D．D aedi~ E et al T antigenic st[H~ure of
分 5类：CXC受体(CXCR1—5)；CC受体(CCR1— theHIV gp120 envelope glympmtdn．Nature．1998．393(6686)：705
～ 71l
10)；C受体(XCR1或 GPR5)；CX3C受体(CX3CR1)
5 Mu~ idi S，Ahuja S S Gomal~ E，et a1．Genealogy ofthe CCR5】o一
及 orphan受体(BOB、Bonzo等)。研究发现这些与 and chemokine syst~ gene vafi~m associated with altered ra
HIv一1感染有关的辅助受体其基因组可出现多种 of HIV一1 d— se pr0g一 [珈 Nat—Med 1998，4(7)：786-793
6 W ln Pr C，MM i W．Smith M W ，n al Genetic r nctI[珈 of AIDs
变化 J，CCR5和 CXCR4是 HIv一1进入靶细胞的
pathogen~is by aD SDF 1 eh~ oklne gene varlet ALIVE Study．
主要协同受体，CCR5等位基因型有：wt／wt、wt／&32 Hemophilia Growth and Development Study(HGD~)，Multicent~
和 &32／z~32。CCR5基因编码区第 185位氨基酸以 AIDS Cohort Study(MACS)．Muhi~ ter Hemophifia Cohort Study
(MHCS)，San Franci~o City Cohort(SFCC) Science．1998，279
后 32个碱基缺失时，即发生CCR5△32突变，使 HIV
(5349)：389～393
一 1的 gpl20不能与 CCR5 &32有效地结合，C (收稿 ：200l一3—22)维普资讯 http://www.
防医堂 年第32卷第6期 l~todern Preventivel~edicine，205，Vo1．32，No．6 639
【性病艾滋病监控及其健康教育】
HIV基因芯片在艾滋病母婴传播早期诊断中的应用
石向东 ，赵广录 ，王晓辉 ，陈琳
【摘要】 目的：建立适用于艾滋病母婴传播早期诊断的HIV基因芯片检测技术。方法：在产后180 d内，采集HIV抗体
阳性母亲所生婴幼儿的样本进行检测。从 HIV基因组Gag区选取3对适宜引物，经逆转录一聚合酶链反应 (RT-PCR)扩增 3
个HIV目的基因片断。扩增产物纯化后与载体连接，转化到JM109宿主菌，接种平板培养，提取质粒。将探针点于尼龙膜
上，制成基因芯片。样本提取DNA后与阳性对照质粒混合，地高辛标记显色观察结果，并和抗体检测结果相比较。结果：采
用 HIV基因芯片对 9位 HIV抗体阳性母亲所生婴幼儿进行检测，其中阳性 2名，阴性 7名，与抗体确认结果相比，敏感性和
特异性均为 100．O％。结论：该方法能够对婴幼儿进行早期诊断，判断HIV母婴传播的方式，便于干预和治疗。
【关键词】 HIV一1；母婴传播；RT-PCR；基因芯片
【中图分类号】1512．91 【文献标识码】A 【文章编号]1003．85ar7(2005)06-0639．03
EARLY DIAGNOSIS OF MO'IItER TO Ctm ,D TRANSMISSION BY tIIV-1 GENE CItlI'S．S／／／X／ang-dong， ZHAO I v r．1u ，
G Xiao-hui，et a1．Shenzhen Centerfor Disease control and Prevention，Shenzhen，518O2O
Ab ：Objective：To stuay the technology for establishing DNA microarrays for HIV-1 early diagn~ ofix~ r to child 1iltn~ $．
slon．Methods：The infants bom from 蛐Ⅳ．infective mothers were tested With DNA microarmys before 180 days． pairs of appropriate
pIimers which selected from Gag region of HIV-1 gene segments were amplifed to three HIV-1 target se 蛐 by method of RTo
PCR．The锄b陆ed production were connected with Vector after it had purifed，translated to JM109 ho6t bacteria，bl,ught up in plain agar
culture medium ． I1 plasmids~h'ere extracted from positive bacterial colony．The probes cli~pecl Oil the nylon~ ralrle to Imke DNA
microarrays．The DNA which extracted from the sample were mi xed th positive plasmids．The DNA microarmys were hybridized with Digoxi．
genin labeled probes。then ayed to show the results comparea with阱 Ab．Results：9 infants bom from Hrv'-infected ix~ r8~h'ere
t with DNA microarrays．Of them were 2 positive samples and 7 negative samples．Both sensitivity and the specifcity was 100．O％
． Clllt~ll；The DNA microarrays can be applied for e矗 diagnosis of HIV-1 M'I'CT．It is gooa at intervention l'Ii~asure to the infants
thro~h estimate mode of HIV-1 MTCT．
r words~蛐Ⅳ-1；MTCT；RT-PCR；DNA microarmys
随着艾滋病从高危人群向一般人群逐渐扩散，女性感 试剂与引物的合成均来自上海生工生物工程有限公司，标
染人数的增加，HIV经母婴传播途径感染人数逐年上升。 记用地高辛标购自瑞士 ROCHE公司。
据WHO估计，目前全球共有艾滋病感染儿童250万，2003 V&PMulit．Blotlteplieator芯片点样仪购自美国V&P．SCI．
年 70万儿童感染 HIV，其中绝大部分是通过母婴传播途径 ENTIFIC．INC公司，芯片杂交仪购 自美国 hgt~d公司，尼
感染。近年来我国艾滋病感染儿童人数逐渐上升，在感染 龙膜购自美国 PIERCE公司。
者中，HIV经母婴传播所占比例由 1997年的 0．1％上升到 1．2 HIV芯片的制备
2OO3年的 0．6％。研究表明，在未干预的情况下，艾滋病 1．2．1 探针的制备 在 HIV基因组 Gag区 (保守区)选取
母婴传播发生率为 15％．50％。如果采取孕期服用抗病毒 3对适宜的引物，RT-PCR扩增 3个 HIV目的基因片段；用
药物、择期剖官产和人工喂养等方式进行综合干预处理， 上述方法RT-PCR扩增小鼠6-磷酸脱氢酶 (GAPDH)基因片
可将母婴传播的发生率降低到10％以下。由于HIV抗体主 段作为阳性对照片段；PCR扩增辣椒红素 (COS)基因片段
要为 IgC，能够通过胎盘屏障进入胎儿体内，因此，HIV抗 作为阴性对照片段。上述 5个片断扩增产物经纯化后经连
体阳性母亲所生婴幼儿在早期的 HIV抗体检测均为阳性反 接、转化、挑取阳性克隆菌，PCR鉴定 ，从确认的阳性克
应，要等到 18个月以后才能确认婴幼儿是否感染 HIV，而 隆菌中提取质粒作为 PCR扩增模板。
采用基因芯片技术在婴儿出生48 h即可进行诊断。现将本 1．2．2 芯片的制作与制作后处理 将设定好的探针用 V&P
实验室从 2OO2年以来开展基因芯片诊断的情况报告如下： Mulit．Blot Replicator点样仪按照一定的浓度梯度有序的点样
于尼龙膜上，将点样后尼龙膜放置于80℃干烤1 h，置于紫
1 材料和方法
外交联仪于2．5 mj交联 20 min。将其真空干燥封闭好，放
1．1 材料 核酸提取均用德国 Qiagen试剂盒，Taq DNA聚 置于4qC冰箱待用。
合酶，PCR反应缓冲液购自MBI Fermentas公司。其他反应 1．3 样品的荧光标记 从 HIV-1感染者全血提取核酸
DNA，取其4 与阳性对照质粒 1 t．a混合做模板，然后加
[作者单位】1．深圳市疾病预防控制中心，深圳，518020；2．深圳
入自配好的PCR标记反应液及引物混合物。使其按设定好
华康医学工程有限公司
的 PCR程序，进行标记扩增。
[作者简介】石向东 (1966一)，男，本科，主管技师，从事艾滋
1．4 分子杂交与杂交后的清洗
病防制工作 ．
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现代预防医学 2005年第 32卷第6期 MMem Pr veMedicine。2005。Vo1．32。No．6
1．4．1 预杂交 将基因芯片装入杂交袋中，加入 2 ml预杂 色，如没有显色则说明该试验失败。H1中有显色则可判断
交液。尽可能将袋内空气挤压出来，加热封口，将其放入 该样本为阳性，H2和 H3必须同时显色才可判断为阳性。
芯片杂交仪中，42℃预杂交1 h。 每次检测中阴性对照均不应当显色，如有显色则说明该试
1．4．2 杂交 lOO~Jl热5 I由使扩增好的PCR产物变性，骤 验失败。H1、H2、H3的5个稀释度可以判断阳性的强弱。
冷后，将其加入杂交袋内。尽可能将袋内所有空气挤压出去，
1 2 3 4 5
加热封口。将杂交袋放入芯片杂交仪，42℃杂交过夜。
GP o o o o o
1．4．3 杂交后的清洗 取出杂交芯片先用洗液 I于室温洗涤4
次，每次 5-面。将其转移至洗液1中洗涤2次，每次30-面。 H1 o o o o o
1．4．4 结果的显色 将洗涤后芯片放入封闭液中封闭30
H2 o o o o o
min，然后加入2 ml抗地高辛
H3 o o o o o
抗体稀释液，抚育1 h，后用 lO 惝 hiIlg buyer洗涤2
次，每次15 nfin，转入2 ml检测缓冲液中洗涤5 min，取出 CCS o o o o o
杂交膜平铺于平整的塑料纸上，加入 1 ml NBT／BCIP底物显 图3 膜芯片上的探针排列
色液，避光 (勿晃动)，反应时间至阳性参照有清晰的斑点
出现为止，用水冲洗终止反应。
图4 阴阳性样本芯片杂交结果图
图1 阳性及阴性对照PCR扩增目的片段电泳图谱 图4，左侧为阴性样本杂交结果，只有第1排阳性内参
照出现明显的杂交阳性斑点，探针检测区和阴性对照区均
不出现斑点，结果为阴性；右侧为阳性样本杂交结果，阳
性内参照和探针检测区均出现杂交阳性的斑点，而阴性对
照区无斑点出现，说明无非特异性杂交，结果为阳性。
2．2 基因芯片的早期诊断 如表 1所示，SZ002号基因芯
片检测结果为阳性，新生儿血样是产后 7 d采集，后来该
婴儿出现腹泻、发烧和肺部感染等症状，产后54 d死于呼
吸衰竭，可诊断为宫内感染。SZ003号其基因芯片结果和抗
体检测结果均为阳性。其余样本基因芯片和抗体检测结果
均为阴性，其敏感性和特异性均为 100．0％。SZ001、SZ002、
SZ003、SZ005、SZ007、SZ008、SZ009等 7个 mV阳性孕产妇
为产后数天才发现其感染情况，因此，未能及时进行综合
’
图2 PCR扩增出的目的片段电泳图谱 干预。
， 结里 3 讨论
二 ：口 木
由于本方法应用 PcR标记扩增 mV一1 Pn>DNA的 Gag
2．1 HY~基因芯片的检测 目的片断电泳图谱提取 HIV-1
区多个核酸片断，可以降低因 HY~核酸变异而产生的假阴
RNA，RT-PCR扩增 3个目的基因片段，PCR扩增阳性、阴
性，提高检测的灵敏度。在操作过程中应严格控制实验条
性对照片段，图1为从阳性对照和阴性对照 2个克隆质粒
件，避免核酸污染，同时设置阴性、阳性对照，以保证检
PCR扩增出的目的片段电泳图谱。图2为从 3个目的 HY~
测结果的准确性。
目的片断克隆质粒上 PCR扩增出的目的片段电泳图谱 GP
对于非母乳喂养的婴儿，如果母亲妊娠时已感染HY~，
为阳性性对照 (254bp)、CCS为阴性对照 (296bp)、H1为
产后 1周内新生儿 HY~基因芯片检测结果为阳性，则认为
HY~目的片断 (111bp)、H2为 mV目的片断 (130bp)、H3
是宫内感染；婴儿出生第 1周后检测为阴性，而以后检测
为 mV目的片断 (154bp)。
转为阳性，则认为是分娩过程中感染。对于母乳喂养的婴
上排为阳性对照 (GP)探针，其中 1、2、3、4、5为 5
儿，产后 90 d内检测为阴性，90～180 d后转为阳性，则认
个不同的稀释度 H1、H2、H3为 3个不同的 gag区检测探
为是产后经母乳传播。
针，CCS为阴性对照。每次反应后阳性对照 GP均应当显
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窭 亟堕堡堂垫堕生箜墼鲞箜6— —Modem PreventiveMedicine，2(X)5。Vo1．32，No．6 64l
表 l 深圳市艾滋病感染孕产妇干预及婴幼儿早期诊断
由于目前样本数量有限，尤其是阳性样本数量较少，今 程中妇幼保健的工作质量。
后还需扩大样本量，以进一步验证该基因芯片检测的敏感性和
【参考文献]
特异性，使其更好地应用于艾滋病母婴传播的早期诊断。
当婴幼儿出现类似AIDS相关症状时，临床医生可以结 [1 J Magoni M。Bassani L，Okong P，et a1．Mode of infant feeding and
合实验室的早期诊断结果进行临床诊断，对症治疗。由于 HIVinfectice in children in a program for prevetice of mother-to-child
卡介苗是减毒活疫苗，对于免疫功能正常的婴幼儿是安全 transmisio[1 in Uganda【JJ．AIDS．2005Mar4；19 (4)：433-437．
的；但对于免疫功能已经降低的婴幼儿来说。是不安全的。 【2J Kartrelishvii A，IA~／IOI"A， I8r，M，et a1．Mica'oarmy analysis of
所以，H1V基因芯片诊断阳性的婴幼儿，如果出现艾滋病 diferentialy expressed genes in cels resistant to I-IV-1[J]．Invmnol
Let．2004Apr30；93(1)：79—86．
临床症状，则不能接种卡介苗，但其他疫苗可以照常接种；
[3]李凌，马文丽，毛向明，等．HIV基因芯片的初步研究 [J]．
对于H1V基因芯片诊断为阴性的婴幼儿，可以按正常程序
第一军医大学学报，2002；22(8)724-7．
接种包括卡介苗在内的所有疫苗。强化免疫功能。
[4]预防艾滋病母婴传播项目试点实施方案 (修订版)[M]卫生
H1V基因芯片在艾滋病母婴传播早期诊断中的应用， 部妇幼保健与设区卫生司，中国疾病预防控制中心妇幼保健中
可以帮助艾滋病感染产妇及时了解所生婴幼儿的感染状况， 心，2004；10．
避免因密切接触可能造成的感染，降低母婴传播的发生率。 [53冯铁建，陈琳。张丹。等 ．深圳市孕产妇人群中AIDS流行情
同时，为临床医生对婴幼儿的诊疗提供依据，正确进行免 况及母婴传播的预防与控制 [J]．中国艾滋病性病。2003；9
疫接种，有效提高产妇和婴幼儿的保健水平。增强随访过 (5)270-2．
[收稿日期]2005__o1—17
【感染性疾病的监控】
标本放置时问对 HBeAg抗 一HBe检测结果的影响
潘永刚，侯爱莲
【关键词] 放置时间；HB~As；抗一HBe；结果影响
【中图分类号]R512．62 【文献标识码]C 【文章编号]1003．85o7(2005)06-0641．01
日常检验工作中，特别是在为一些单位进行集体体检 (+)，有4份出现抗一me(+)，而静置60 min后
时，检测 I-BVM (乙肝病毒标志物)，有时会遇到单纯 检测的标本结果均为阴性。
I-IBcAs(+)或抗 一me(+)等少见情况，为慎重起见， 血液静置时间过短，血凝不完全即离心分离时，血清
进行第2次复检，又出现了与第 1次检测完全不同的结果， 中含大量纤维蛋白，加入试剂，反应孔中会出现凝固现象，
因两次检测均为同一试剂盒，排除了试剂质量影响，怀疑 而血球沉降不充分的血清中含有一些含过氧化物酶的细胞
为标本放置时间对检测结果有影响，做如下试验： 成分，会干扰检测方法中过氧化物酶的反应，这都会影响
取 2o份 I-IBcAs、抗 一m e均阴性的献血员的不抗凝血 及抗 一HBe的检测。
液标本，每份分为两管，在37℃水浴中分别静置30 min和 目前，一些实验室规定必须当天发出检验报告，特别
60 min后，以3 000 r／min离心 5 rain取血清，以EIA试剂盒 是大规模集体体检时，因抽血人员有限，采血样时间延长，
(jE京中生化控公司生产)进行 HBeAg、抗 一HBe的检测。 致使一些较晚采集的标本放置时间不充分即进行检测，产
结果，静置 30 min后检测的 20份标本中有 2份出现出 生了上述的一些少见情况，故在进行 I-BVM检测时除应保
证好检验试剂的质量外，应充分认识到血液标本放置时间
对检测结果的影响。 [收稿日期]2o04—0 0
[作者单位]山东青州荣军医院，青州，262500中国艾滋病性病 2005年 8月第 11卷第 4期 Chin J AIDS STD Vol111 No14 Aug. 2005 305
#综述#
HIV基因组感染性克隆的构建原理及应用
王铮,李敬云
(军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心,北京 100071)
中图分类号: R37319; R512191 文献标识码: A 文章编号: 1672- 5662( 2005) 04- 0305- 04
感染性克隆技术也称拯救病毒, 是将病毒的基因组 RNA 往往缺乏完整的长末端重复序列( LTR ) , 因此需要在构建出
逆转录成 cDNA ,对得到的 cDNA 进行修饰和改造, 进行克隆 的 cDNA 两端连接上前病毒的 5c和 3c端完整的 LT R片段, 才
后,利用体外转录技术或其他的方法, 将 cDNA 拷贝转回到 能使获得的全基因组克隆具有感染性。所以在科研工作中,
RNA 状态,成为改造后的病毒基因组。而感染性克隆就是指 人们更多的采用直接提取或扩增前病毒 DNA 的方法。
在细菌质粒中含有病毒全基因组的 cDNA 拷贝, 使得 cDNA 11112 噬菌体克隆前病毒 DNA 构建K噬菌体克隆文库是
本身或从 cDNA体外转录所得的 RNA 具有感染性。 获得前病毒基因组的一种传统方法。在抽提出整合有前病毒
1978 年 Taiguchi首次从 cDNA 克隆获得了 RNA 噬菌体 的细胞基因组后, 用特异性的限制酶进行消化, 再用密度梯度
QB[ 1] ; 1981 年 Racaniello 等人通过脊髓灰质炎病毒 cDNA 首 离心法收集 15~ 22kb 的片段进行噬菌体克隆, 与全长 HIV-1
次获得动物病毒的感染性克隆[ 2] ; 1986 年 Adachi通过噬菌体 基因组探针杂交, 收集阳性的克隆加以纯化, 并插入合适的载
克隆首次获得 HIV 的感染性克隆 pNL4-3 [ 3]。此后, 感染性 体[ 6, 7]。这种方法所获得的全基因组带有侧翼序列, 非常完
克隆技术被广泛运用于病毒致病的分子机制和免疫保护机理 整, 生物活性极佳。但是操作繁琐复杂, 产量也不高, 目前较
的研究,以及减毒疫苗的开发。该项技术的广泛应用极大地 多采用的是 PCR 扩增法。
推动了分子病毒学的发展。应用感染性克隆技术通过体外获 11113 PCR扩增法 从裂解的人外周血淋巴细胞( PBMC)
得病毒基因组来研究 HIV , 而不是脱离整体孤立地研究单个 中抽取细胞基因组 DNA, 采用 PCR 扩增获得前病毒序列。
基因或单个蛋白,在研究 HIV 复杂的基因组和蛋白质组方面 PCR扩增的方法和策略形式多样, 但大多是将全基因组分为
具有独特的优势。在感染性克隆的基础上可实现对 H IV 的 几个片段进行扩增, 再将它们连接起来构成全长的前病毒
反向遗传学研究,以探讨病毒的复制、组装和侵入机制, 深入 DNA[ 8- 10]。理论上说, 长片段 PCR 技术完全可以直接扩增
阐明病毒的致病机理,并可通过对全长基因组克隆进行缺失、 出全长基因组, 但分段扩增可能在引物设计、条件控制、保真
突变或嵌合等操作来构建减毒株,直接用于疫苗的研制开发。 性和对模板质量的要求方面要优于直接扩增。临床标本中前
目前,国外构建各种 HIV 亚型的感染性克隆技术已经相当成 病毒 DNA量均较低,直接进行体外扩增难以获得阳性结果,
熟,并广泛应用于 HIV 的各项研究。遗憾的是, 国内这方面 尤其是在目的片段过长时。Salminen 发现, PCR 反应体系中
的研究还是空白。 前病毒 DNA少于 300个拷贝时就无法获得 9kb 左右的目的
1 构建 HIV 基因组感染性克隆的方法和步骤 片段[ 11]。当H IV 在正常人淋巴细胞中增殖后, 再用培养细
111 构建 HIV全长基因组 构建全长基因组是成功获得感 胞提取前病毒 DNA 进行扩增,则比较容易得到较长的目的片
染性克隆的关键,实现这个步骤主要有以下几种方法。 段。PCR法直接扩增简便, 产物量大, 但突变率相对于噬菌体
11111 逆转录合成 cDNA 法 可直接从病人血浆中提取病 克隆为高。
毒RNA, 将全基因组分成几个相互重叠的小片段, 每个片段 112 选择合适的载体和菌株 HIV 全基因组克隆载体一般
单独进行逆转录和 PCR反应, 再将获得的各个小片段连接成 选择低拷贝数的质粒, 这是因为 HIV 全长 cDNA 两端具有同
完整的基因组 cDNA。有文献报道[ 4, 5] , 将 HIV-1 全长正链 向的长末端重复序列, 在复制过程中容易发生同源重组, 并导
RNA 分成两个长度相仿的部分进行逆转录 ( 5c半分子 cDNA 致内含子的缺失 ,外源片段的插入, 影响质粒的稳定性。为增
和 3c半分子 cDNA) , 最后将逆转录出的两个半分子 cDNA 进 加病毒基因组的稳定性, 减少在操作过程中出现重组的频率,
行连接。目前,高保真逆转录酶和 DNA聚合酶的应用极大地 [ 12]
有必要构建低拷贝数的感染性分子克隆 。此外 ,还应尽量
降低了逆转录 PCR( RT-PCR)过程中可能出现的差错。由于 采用缺失重组基因 [ recA ( - ) ]的宿主菌[ 13]。但值得注意的
逆转录病毒相当复杂的复制机制, 人工逆转录得到的 cDNA 是, 最早的感染性克隆 pNL4-3 即是用高拷贝的 pUC18 质粒
[ 3]
收稿日期: 2004- 10- 10; 修回日期: 2005- 01- 26 构建而成, 至今仍然被广泛使用 。
作者简介:王铮( 1982- ) , 男, 安徽省定远县人,军事医学科学院 113 感染性克隆的产生与鉴定方法 获得全基因组克隆质
微生物流行病研究所微生物学专业在读硕士研究生,从事 HIV 分子 粒后,接下来要做的就是用其转染细胞, 常用的细胞主要有
病毒学研究。 293T 细胞、HeLa 细胞、CEM ( 12D7 )细胞、BHK 细胞、MT4 细
306 中国艾滋病性病 2005年 8月第 11卷第 4期 Chin J AIDS STD Vol111 No14 Aug. 2005
胞等。有文献报道[ 3]使用人结肠癌细胞,此种细胞对转染极 序列, 因此往往有人将前病毒 5c和 3c端完整的 LTR 区域连接
其敏感, SW480 在转染后 24 小时即可获得理想的结果。 到构建体 5c和 3c末端[ 7, 8]。利用 PCR 进行扩增时, 在设计能
G1Dolcini等人用感染性克隆转染胎盘滋养层绒毛膜 Bew o细 完全扩增出 5cLTR 和 3cLT R全段的引物上有困难, 但 5c端
胞,转染成功后虽然产生具有感染性的病毒颗粒,但游离病毒 LTR的 U3 区缺失了 92bp 的碱基, 3cLTR U5 区碱基缺失不
无法感染 Bewo 细胞, 进入细胞内的病毒也不能发生基因整 超过 50bp, 获得的基因组仍然具有感染性[ 8]。
合, 即使 Bew o 细胞表面表达有 CD4、CXCR4 和 CCR5 受 214 HIV前病毒克隆的同源重组 HIV 前病毒克隆的同源
[ 14]
体 。 重组是一个令人头痛的问题 ,常常会导致前病毒序列中内含
转染的主要方法有原生质体直接融合法、磷酸钙共沉淀 子的缺失, 外源片段的插入, 从而致使前病毒克隆感染性丧
法、脂质转染法、微量注射法、电穿孔法等。其中磷酸钙共沉 失。因此, 推荐使用低拷贝的质粒 , 在较低的温度下进行培
淀法简便易行,被广泛采用, 但转染效率不高。微量注射法的 养, 以及采用 r ecA ( - ) 或 recA 缺陷的大肠杆菌菌株如
[ 19]
转染效率较高,注射入的 cDNA 应是线型的, 两端带有完整的 JC1090、AK101 等 。即使这样, 同源重组仍然难以避免。
LTR 序列,并直接注射入细胞核内, 这样做有利于 cDNA整合 推测这可能是由于一种未知的机制而不仅仅是 recA 的作用,
入细胞的基因组中[ 5]。Ann L1 Boyd 等采用此法将重组构建 与 HIV-1 携带的对宿主菌有害的毒性片段有关, 需要进一步
[ 13]
的H IV 前病毒克隆注射入人类胶质瘤细胞, 在 24 至 48 小时 加以证实 。但上述方法仍不失为一种降低同源重组频率
之间即发现 5% ~ 20%的细胞有低水平的 gp120 表达。但是 的好办法。
微量注射法对操作技术和仪器设备要求比较高。 3 感染性克隆的应用
转染后第三天,收集培养液上清过滤,采用 p24 或逆转录 311 基因和蛋白质功能的研究 早期对 HIV 的研究一直由
酶活性测定来检验有无病毒颗粒产生, 也可以用显微镜观察 于缺乏有效的手段而无法深入, 感染性克隆技术的发展使得
细胞病变或用电镜直接观察。转染时应设阳性和阴性对照, 从基因水平上揭示其生命本质成为可能。可以采取基因敲
阳性对照一般采用国际上广泛使用的感染性克隆 pNL432 或 除、插入、置换或构建嵌合病毒等方法对病毒基因功能进行研
pNL4-3。初步检测后还应该分析感染性克隆的一些生物学特 究。利用 HIV 感染性克隆, 通过密码子诱变, 将其衣壳蛋白
性,如其表达、复制情况以及致病性、宿主谱的一些变化, 要注 N 末端结构域的 T rp23或 Phe40诱变为 Ala。试验表明, 衣壳
意与亲代做比较。为将重构病毒与野生病毒区分开来, 还可 蛋白 N末端突变对病毒逆转录酶产量和病毒核心组装有很
以在基因组 cDNA上加入一定的遗传标记, 如在特定的部位 大的影响[ 20]。G1Dolcini等人发现, H IV-1 型 A 至 G 各亚型
改变一个碱基或一段碱基序列,引入一个报告基因等[ 16]。 的 LTR序列中启动子的功能存在较大差异
[ 21]。Lint C 发现,
2 影响 HIV 感染性克隆的主要因素 当 HIV启动子激活时, 位于第 465~ 610 位的核苷酸,即核小
211 转录物异质性的干扰 HIV 全基因组全长约 91 72kb, 体 nuc-1 迅速解体形成连续的开放染色体区域[ 23] , 以及近年
各亚型之间全基因组长度有一定的差异。而 10kb 左右的病 来研究颇热的 APOBEC3G 和 APOBEC3F 蛋白与 H IV vif 基
毒基因组无论在体内体外转录过程中都容易提前终止[ 17] ,导 因之间的相互作用[ 23, 24]。这些研究都离不开感染性克隆的
致在转录过程中出现许多不同长度的转录物分子, 这样就干 应用。
扰了真正的病毒分子的组装。 312 病毒耐药性研究和抗病毒药物的开发 目前,随着我国
212 构建全长基因组过程中出现的突变 在各个步骤中采 艾滋病病人数目的不断增加和部分病人的不规则用药, HIV
用的聚合酶的忠实性都会对最终产物的感染性产生影响 ,况 耐药性已经成为一个日趋严重的问题。感染性克隆为研究病
且病毒的逆转录酶本身就不具有很高的忠实性。有报道在长 毒的耐药性提供了一个理想的模型, 尤其是耐药性突变。对
的基因组构建过程中,点突变会导致感染性的丢失, 很可能产 病毒基因组编码蛋白酶、逆转录酶的区域进行密码子定点诱
[ 25- 27]
生不具有自我复制能力的全长基因组[ 18]。目前,高保真更加 变, 分析其耐药性与诱变后基因型及表型变化的关系 ,
耐热的 DNA 聚合酶的开发和研制, 长片段 PCR 技术的产生 这方面的应用日趋广泛和成熟。在感染性克隆的基础上还可
和应用,以及逆转录酶质量的提高, 使得合成全长基因组拷贝 以进一步了解病毒生命活动过程中的各种调控作用, 针对病
时突变因素大大降低。 毒基因组中的非编码区进行缺失、诱变、替换, 了解编码区以
213 获得完整的 LTR序列 这在成功获得感染性克隆的过 外的序列在病毒复制、结构和非结构蛋白翻译及加工、病毒包
程中至关重要, 决定着获得的全长基因组有无感染性。HIV 装、成熟和释放中起的作用, 可以有针对性的设计药物。
全长基因组借助 LT R可以整合入宿主细胞的基因组中, LTR 313 利用感染性克隆构建的重组载体 在对具有分裂能力
尤其是 5cLTR含有调节病毒基因表达的重要调控序列, 这些 的细胞进行基因转移所用的各种病毒载体中, 逆转录病毒载
序列同时也存在于宿主基因的转录调控区, 包括高水平的 体是最为成功的一个。然而, 目前所用的逆转录病毒载体无
RNA 合成所需的转录因子结合位点,如 CAAT 盒、TATA 盒、 法在间期细胞中实现整合, 而腺病毒载体可感染间期细胞却
SP-1 结合位点、NF-JB 结合位点等, 以及聚腺苷化信号。但是 无法整合, 影响了表达的稳定性。利用 HIV 感染性克隆构建
在获得全长基因组的过程中, LTR 经常有所缺失, 尤其是从 的 HIV重组载体, 不但具有逆转录病毒载体和腺病毒载体所
病毒 RNA 逆转录得来的 cDNA 基因组经常有不完整的 LTR 具备的优点, 也弥补了它们的不足。为了保证构建成的载体
中国艾滋病性病 2005年 8月第 11卷第 4期 Chin J AIDS STD Vol111 No14 Aug. 2005 307
不具有自我复制能力,病毒的 gag-pol区域、env区域和剩余用 [ 5] Fang G, Weiser B, Visosky A, et al1Molecular cloning of ful-l length
作载体的基因组被分别构建成 3 个质粒, 这 3 个区域互相之 HIV- 1 genomes directly from plasma viral RNA[ J]1 J AIDS, 1996, 12
( 4) , 352- 3571
间的重叠部分也应被尽量除去[ 28, 29]。也可以单独使用病毒
[ 6] Feng Gao, David L Robert son, Sander G M orisson, et al1The Hetero-
基因组载体, 但要先构建相应的包装细胞系 ,如 HeLa细胞或
sexual Human Immunodef iciency Virus T ype 1 Epidemic in T hailand
COS-1 细胞。将构建好的载体导入这些细胞中, 可以使载体 Is Caused by an Intersubtype ( A/ E) Recombinant of Af rican origin
的转录本得到包装, 产生假型病毒颗粒[ 30, 31]。Naldini 利用 [ J] . Journal of Virology, 1996, 70: 7013- 70291
HIV的重组载体系统使B-gal等报告基因,在人的 G 期 HeLa [ 7 ] M ika O Salminen, Philip K Ehrenberg, John R Mascola, et0
al1Construct ion and Biological Characterization of Infectious Molecular
细胞、鼠成纤维细胞及人的终末分化的神经元和原代巨噬细
Clones of HIV- 1 Subtypes B and E ( CRF01-AE) Generated by the
胞得到了稳定的表达。利用 HIV 感染性克隆构建的重组病
Polymerase Chain React ion[ J]1Virology, 2000, 278: 103- 1101
毒载体还能用于抗 HIV 的基因治疗, 用携带反义 RNA 和核 [ 8] Hiroaki T akeuchi, Youichi Suzuki, Masashi Tatsumi, et al. Isolat ion
酸酶编码序列的抗病毒基因载体来破坏 HIV 基因表达和病 and Characterizat ion of an Infect ious H IV Type 1 Molecular Clone
毒复制,起到治疗艾滋病的作用[ 32]。 f rom a Pat ient with Primary Infect ion[ J]1AIDS Resarch and Human
1 Retroviruses, 2002, 18( 15) , 1127- 113313 4 疫苗的开发研究 以 HIV 基因组感染性克隆为工具,
[ 9] Feng Gao, David L Robert son , Catherine D Carruther, et al1A Com-
通过缺失、替换、定点诱变等方法寻找出毒力关键基因或基因
prehensive Panel of Near-Ful-l Length Clon es and Reference Sequences
中的关键位点, 可以为开发新一代减毒疫苗提供理论支持。 f or Non-Subtype B Isolates of H uman Immunodeficiency Virus T ype 1
其中 nef缺失突变株的研究进展最为迅速, 已构建出相应的 [ J]1 Journal of Viology, 1998, 72: 5680- 56981
缺陷性病毒 ,但后来发现 HIV nef 缺失突变株在复制过程中 [ 10] Tetsu Mukai, Satoski Komoto, T akeshi Kurosu, et al1Const ruct ion
and Characterrizat ion of an Infect ious Molecular Clone Derived f rom
发生了回复突变。还可在基因组感染性克隆基础上, 向其他
the CRF01-AE Primary1 Isolate of H IV T ype 11AIDS Research And
病毒中插入H IV 基因,从而获得重组病毒疫苗。目前已在痘
Human Ret roviruses[ J]12002, 18( 8) : 585- 5891
苗病毒中成功地表达了H IV-1 的 gag、po l和 env基因, 产生了 [ 11] Salminen MO, Koch C, Eric SB, et al1Recovery of virtually ful-l
9 种蛋白并能组装成无感染性的颗粒, 可引起较强的细胞免 length HIV- 1 provirus of diverse subtypes from primary virus cul-
疫和相对较弱的体液免疫,已开始临床实验[ 33]。如对不感染 tures using the polymerase chain react ion [ J ] 1Virology, 1995, 213
( 1) : 80- 861
人类的其他动物慢病毒加以改造, 用 HIV 的某些蛋白取代其
[ 12] Peden KW1 Instability of HIV sequence in high copy number plas-
原有的蛋白成分,构建嵌合型病毒, 则可能获得更有前途的重
mids[ J]1 J AIDS, 1992, 5( 3) : 313- 3151
组疫苗[ 34- 36]。 [ 13] K Yamada, H Morozumi, T Okamoto1LT R- directed homologous re-
4 小结 combination of ful-l length HIV-1 provirus clone in recA( - ) bacteria
HIV感染性克隆是我们开展 HIV 分子致病机制研究的 [ J]1Arch Virol, 1995, 140: 1007- 10141
重要工具,但在使用和保存时需要注意以下几点: 前病毒基 [ 14] G Dolcini, M Derrien,G Chaouat, et al1Cel-l Free HIV Type 1 Infec-
t ion is Rest ricted in the Human Trophoblast Choriocarcinoma BeWo
因组对细菌宿主有毒性作用, 导致质粒 DNA 产量不高; 具
Cell Lin e, Even W ith Expression of CD4, CXCR4 and CCR5 [ J ] .
有感染性,在保存和使用时要注意安全; 前病毒 LTR 的同 AIDS Research and Human Retroviruses, 2003, 19( 10) : 857- 8641
源重组现象会导致很高几率的内含子缺失现象发生; 感染 [ 15] Ann L Boyd, Thomas G Wood, Andrea Buckly, et al1Microinject ion
性克隆所获得的病毒拷贝, 和野生株一样在复制周期中也会 and Expressin of an Infect ious Proviral Clone and Subgenomic Enve-
发生突变和重组。与其母本病毒一样具有感染性,甚至更强, lope Const ruct of a Human Imm unodef iciency Virus [ J] 1AIDS Re-
search an d Human Ret roviruses, 1988, 4( 1) : 31- 411
但是在宿主体内的演变不一定与其亲本一致, 变异的方向可
[ 16] Pot ter H, W Law rence, P L ender1Ehnancer dependent expression of
能不同,致病作用也未必相同。 human K immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lym-
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276 中国艾滋病性病 2005年 8月第 11卷第 4期 Chin J AIDS STD Vol111 No14 Aug. 2005
和观看绛县电视台节目等多种途径。不同形式的途 血,占被调查者的 1186%, 且教育前后无显著性差
径在受众、传播内容深浅等方面各有侧重和优缺点。 异。这与从当地疾病预防控制中心和村医处了解到
将多种形式的健康教育活动相结合,对目标人群进行 村民约 5% ~ 10%的卖血比例之间有较大差距。可
立体宣传, 既可扩大信息的有效到达率和暴露频率, 能的原因, 一是部分曾经卖血村民调查时期在外打
也可使相同信息反复传递, 起到正性强化作用, 以达 工;二是许多村民对艾滋病不甚了解,认为承认卖血
到更好的宣传效果[ 2]。 就会被怀疑得了艾滋病,以及当地对 HIV 感染者和
313 有效的健康教育可以大大减少社会歧视现象 艾滋病病人的严重歧视有关。艾滋病相关歧视涉及
基线调查结果显示, 当地居民中存在较为严重的对 到两类人群:歧视产生者和承受歧视者。营造一个宽
HIV 感染者及其家属的歧视现象, 主要是由于对艾 松的社会氛围,减少对卖血行为及卖血者的歧视, 有
滋病相关知识尤其是传播途径了解不够所致,一部分 利于发现既往卖血者, 有利于艾滋病自愿咨询检测。
村民甚至认为食物、空气、生活接触均会传播艾滋病 从本次研究可以看出,消除承受歧视者的担心远比消
等。健康教育后因恐惧造成的歧视现象有了明显改 除歧视产生者产生歧视要困难的多。今后我们应更
变,村民对HIV 感染者及其家属所持的负面态度均 加重视此方面的工作。
有显著性下降, 至少具有一种负面态度的比例由
参考文献:
58145%下降到 14192%。
有研究指出,在减少歧视方面需要注意可能存在 [ 1]王英,张永泽,杨运义,等 1 农村地区反对歧视艾滋病病毒感染者
[ 3] 和患者干预活动效果评价[ J]1 中国性病艾滋病防治, 2002, 8 ( 6) :的知识与行为相背离的现象 。即使居民掌握了相
175- 1771
关知识,甚至在回答问题时选择了关爱和不歧视的态
[ 2] M itchell K, Nakamanya S, Kamal i A, et al1Community-based HIV/
度,但在发生具体行为时往往可能还有歧视成分存 AIDS educat ion in rural Uganda: w hich channel is most effect ive
在。因此如何营造一个没有歧视、充满关爱的社会氛 [ J] . H ealth Educ Res, 2001, 16( 4) : 411- 4231
围仍是我们需要继续研究的课题。 [ 3]高建华,郑锡文,施小明,等1 农村既往有偿供血社区居民AIDS相
本项目的两次调查中, 仅有 11人次承认曾经卖 关歧视和耻辱调查[ J]1 中国艾滋病性病, 2004, 10( 3) : 175- 1771
(上接第 307 页)
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医学工程杂志 2007年第 l3卷第3期 Chin J Biomed Eng，June 2007，V0l 13 N0．3 · 187·
· 综 述 ·
HIV基因疫苗的研究进展
林剑萍 唐小平 高光坪
根据近来的报道，全世界有 5 000 000人感染人类免疫 疫苗正在被广泛的用于艾滋病疫苗的研究中。
缺陷病毒(HIV)，3 000 000人死于艾滋病(获得性免疫缺陷 1，DNA疫 苗：DNA疫苗作为一种简单和经济的疫苗策
综合征，AIDS)。HIV的广泛流行将给全人类 的健康带来严 略已被证实能够有效的引发针对表达的目的抗原的细胞介
重的危害。因此，研发 种安全而有效的 HIV疫苗是预防艾 导的免疫反应 。针对 HIV的 DNA疫苗已进入临床研究阶
滋病的有效且经济的方法。到目前为止，研究显示细胞介导 段。研究表明，与病毒载体疫苗相比，DNA疫苗在试验的猴
的免疫反应可以有效的控制 HIV复制并减慢 AIDS病程 ，因 子和人体内只能展示相当弱的免疫原性 ’ 。 此为提高
此成为疫苗研究的主要方向。但是，以重组蛋白为主的传统 DNA疫苗的免疫原性，佐剂和分子聚合物正应用于 DNA疫
疫苗不能够有效的诱发细胞介导的免疫反应，因此不能有效 苗的研究中。结果显示 DNA疫苗的佐剂使针对 HIV的T细
的控制 HIV一1的复制和传播。近来 ，一种被称为基因疫苗 胞免疫应答得到很大的提高 。此外，IL一2和 IL一15也被证
(genetic vaccine)的新技术平台给艾滋病疫苗的研究带来新 实是一种有效提高细胞介导的免疫反应的佐剂 。IL一15
的希望。这种以包括 DNA疫苗和重组病毒载体疫苗为主的 能够使 CD8 T细胞在缺乏辅助性 T细胞的作用下获得扩增
基因疫苗可以将目的基因转入细胞内并表达为内源性蛋白， 的能力。目前，以 IL一15为佐剂的 DNA HIV Gag疫苗已经进
并凭借 MHC Class I旁路提呈给免疫系统而诱发细胞介导的 入临床 I期的研究中，其安全性和免疫原性有待于检验。另
免疫反应。因此以基因疫苗为主的技术策略正被广泛应用 外，DNA疫苗近来被选择作为初次免疫的较为理想的候选疫
于抗 HIV疫苗的研究。 苗而应用于异源的初免_力口强的免疫策略中，并引起广泛关
～
、传统疫苗 注。在灵长类动物的实验中，由编码 HIV抗原的 DNA疫苗
研发一种有效的疫苗来预防艾滋病是控制 HIV传播 的 引起的抗原特异性 CD8 T细胞经重组病毒载体疫苗增效后
有效方法。综观 HIV疫苗的研究历程，尽管诸多的努力，包 得到较为明显的扩增 ，并能有效的控制 SIV的攻击 』。目
括亚单位蛋白或肽疫苗和活病毒疫苗为主的传统疫苗并没 前，国际艾滋病疫苗协会联合牛津大学正致力于 DNA 初免，
成功的控制 HIV的复制和减慢病程。例如，减毒 的活性 重组修饰的牛痘疫苗_力口强免疫的艾滋病联合疫苗的临床 I
HIV一1疫苗存在在体内恢复毒性的危险，因此安全性没有保 期的试验。与此同时，Merck公司也将 DNA-初免，重组腺病
障；研究证实，针对 HIV一1的包膜蛋白和核心蛋白的亚单位 毒5(rAd5)一加强免疫的联合疫苗推入临床 I期 。
疫苗被证实没有保护猴子感染灵长类免疫缺陷病毒(SIV)的 由于 DNA疫苗受较弱的免疫原性的限制，基于活性重
作用 ；重组 gp12O蛋白疫苗在临床Ⅲ期的试验中并没有产 组病毒载体的疫苗研究在艾滋病疫苗的研制中受到广泛关
生防止 HIV一1感染的中和抗体 ；另外 ，灭活的 SIV和 HIV 注。这种携带外源基因的病毒载体疫苗被证明能够有效的
疫苗只能引发不成熟的抗体反应，包括与包膜蛋白的弱反应 诱发针对 目的抗原的 T细胞免疫反应，尤其是在与 DNA疫
性 ，低亲和力，对 于猴子和人 的病毒攻击缺乏 中和保护作
苗联合应用的情况下。目前，几种 HIV病毒载体疫苗包括腺
用 。并且，这些疫苗并没有显示出有效诱发细胞介导的免 病毒(Ad)、腺相关病毒 (AAV)、修饰的痘病毒 (MVA)和金
疫应答的能力，而这种应答反应在清除 HIV感染的靶细胞和 丝雀痘病毒(Canarypox)正在大动物模型和早期临床中进行
减慢病毒复制及转播的过程中发挥重要的作用。因此，以上 试验 -2O]
研究表明传统疫苗并不能有效 的预防 HIV的感染发生。人
2．重组腺病毒载体疫苗 ：在所有的载体疫苗中腺病毒载
类迫切的需要新一代的疫苗提供更有效的保护作用。 体疫苗是最有希望成为预防艾滋病的候选疫苗，因此受到广
二、基因疫苗
泛的研究。腺病毒毒粒是 2O面体的无包膜双链线性 DNA
受传统疫苗的限制，研究者们正致力于开发新的免疫方
病毒，直径为7O～90 nm。他们可以在体内或体外有效的转
式，以期既可以诱发高效价的中和抗体又能够产生广泛的细
导哺乳动物细胞并可以感染各种高分化的组织，如骨骼肌 、
胞毒 T淋巴细胞(CTL)反应来有效的预防或清除 HIV的感
脑、心和肺。作为哺乳动物细胞表达载体 ，腺病毒载体系统
染 J。而基因疫苗正具有这种功能 ，因此被认为是最有发
应用于重组疫苗得到广泛关注和研究。它具有以下优点：
展前景的疫苗，包括 DNA疫苗和活的重组病毒疫苗的基因
(1)腺病毒颗粒比较稳定，病毒基因组较少发生重排，连续传
作者单位：19104美国费城，宾夕法尼亚大学基因治疗研究所 代中一般保持不变。(2)腺病毒基因组较易操作，制备大量
(林剑萍、高光坪)；中山大学附属第三医院中山大学疫苗研究所(高 的腺病毒较为容易。(3)外源基因表达水平较高。在实际应
光坪)；广州市第八人民医院内科(唐小平) 用中为安全考虑，将腺病毒载体中 E1区和(或)E3区缺失。
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· l88· 中华生物医学工程杂志2007年第 l3卷第3期 Chin J Biomed Eng．June 2007，Vol 13 No．3
由于 E1区的缺失，造成病毒复制缺陷，符合生物安全要求， 预存免疫的问题 ，因为研究发现高于 60％ 的人群中有针对
并且避免了 E1基因对细胞的转化作用。 AAV2的中和抗体。这种高度流行的抗体通过抗体介导的中
经研究发现 Ad5能够有效的感染并诱导未成熟的树突 和已被证明妨碍外源基因的表达，并可能因此而降低疫苗的
状细胞(DCs)成熟并可以在诱导成熟的 DCs内表达所携带 免疫原性 ”J。因此研究或选择一种新的 AAV疫苗载体 ，
的目的蛋 白，因此该蛋 白可以有效被 加工提呈，并 活化 而不能被抗病毒载体的抗体所中和是应用 AAV载体疫苗的
CTL 2]
。 在疫苗的研究过程中也发现，重组 Ad5载体能够 前提条件。为此目的，有两个策略正在尝试中：一个是从非
有效的引发抗 HIV病毒的 CTL反应。因此该载体被应用于 人类的宿主中发现新的AAV载体 ，如灵长类；另外就是采用
HIV疫苗的研究中ts]。Merck公司的研究显示 ，Ad5HIV疫 分子工程的方法构建新的AAV载体。通过这两种方法以期
苗在单独应用或与 DNA疫苗联合应用均能有效的引发免疫 望获得在人群中罕见的 AAV载体，以减少针对病毒载体 的
反应，在 HIV—SIV的病毒攻击实验 中，能够明显的减少感染 预存免疫。
病毒的复制，起到预防 HIV感染的作用 。并且这个疫苗 4．牛痘安卡拉载体疫苗：牛痘安卡拉载体疫苗(modified
的安全性在临床 I期的试验中得到证明。 vaccinia Ankara vaccines，MVA)经研究证实在人体中显示较
尽管 Ad5HIV疫苗显示出较好的安全性和较 高的免疫 好的安全性 ，其免疫原性研究的结果也令人鼓舞，因此重组
原性，在人群中广泛存在的抗 Ad载体的中和抗体(Nab)限 MVA载体也被考虑作为预防艾滋病的疫苗而得到研究。许
制了该疫苗的应用，尤其在发展中国家。早期研究结果发现 多结果表明 DNA HIV一初免和 rMVA HIV_力口强免疫的联合疫
预存的抗 Ad载体的中和抗体能够阻止 Ad感染细胞，因此减 苗应用能引发较强的免疫反应，其反应强度均高于 DNA或
弱了目的蛋白的表达，并减弱了疫苗 的免疫原性 J。各种
rMVA疫苗的单独应用 。该疫苗策略在猕猴和 HIV感
以克服预存免疫为 目的的措施正在研究之中。其中之一是 染的人群中证实能够有效的诱发针对 HIV的特异性免疫反
寻找一种在人群中缺乏流行性的新的 Ad血清型，例如来源 应和限制病毒复制的效应，并且在免疫猕猴动物模型后，该
于非人类的 Ad载体或低流行的人源的 Ad载体。近来我们
DNA—rMVA联合应用的疫苗不但能够产生高频的病毒特异
从黑猩猩体内分离到 C68和 c7腺病毒，经研究证实该病毒
的T细胞而且诱发特异性的记忆性免疫反应，该反应有效地
在人群中较少感染，中和效价低，在抗 Ad5免疫存在的情况
控制了黏膜 SIV病毒的攻击 。这个异原的联合免疫策略
下，仍然表现出较好的免疫原性，因此 C68和 c7腺病毒相对
在几百个健康或 HIV一1感染的人中也进行了检验。结果显
于 Ad5疫苗载体展现出较好的克服预存免疫的特性 ’驯 ；
示 DNA HIV疫苗单独应用只能引发较弱的 CD4 CD8 T细
另外，现今已鉴别到的人类血清型Ad35和 Adl1展示与Ad5
胞免疫反应，但经 rMVA HIV疫苗增效后 ，T细胞介导的免疫
相似的免疫源性，但由于在人群中的低流行性 ，预存免疫对
反应得到较大幅度的提高，并持续相对较长时间，HIV一1感染
这两种载体的影响相对较少 ’ 。然而，这些载体疫苗是
的患者中该反应尤其强烈 。所以该疫苗也为艾滋病的预
否能在人体内依然能展示较好的免疫原性仍然有待于检验。
防和治疗带来希望。
3．重组腺相关病毒载体疫苗：AAV是一类微小、无被膜
三、总结
及具有 20面体结构的病毒，是微小病毒科家族的成员之一。
在一些 HIV一1感染者中，一些患者表现为长期的非进行
由于重组腺相关病毒载体(rAAV)有广泛的宿主和持续的转
性的病程，并证实与患者体内长期有效的免疫控制有直接的
基因表达 ，如肌肉、眼、脑 、肝和肺，因此 rAAV被认为是传递
关系。因此有效的对抗 HIV的疫苗可能是预防艾滋病的最
外源基因的有效载体而用于基因治疗 。近来一些研究将
重要的方法。尽管在过去的 20多年里付出很多努力，传统
此载体的应用扩展到治疗癌症和预防感染性疾病的免疫治
的预防艾滋病的疫苗并不能产生另人满意的体液和细胞介
疗载体 ，因为该载体在体内表达非 自身蛋白时可以有效的引
发针对该蛋白的免疫反应而将表达蛋白的细胞清除。目前 ， 导的免疫反应，因此不能有效的控制 HIV的传播。近年来随
着新一代基因疫苗的出现，为艾滋病疫苗的研究带来新的希
有 8个 AAV血清型作为传递外源基因的载体 ，其感染效率 ，
细胞靶向性等特点已被评估 。其中，得到深入研究的载 望。基于 DNA和病毒载体的基因疫苗与传统的疫苗相比展
体是 AAV2。该载体作为疫苗载体被证明只能显示有限的能 示出几个优势 ，包括较高水平的抗原基因表达，容易大规模
力感染 DC细胞，因此只能引起微弱的免疫反应和炎症反应。 生产，靶向性强，广谱的免疫反应，并且以 DNA一初次免疫联
比较而言，AAV5显示相对较强的能力来感染人和鼠的 DC 合病毒载体加强免疫的疫苗策略为艾滋病疫苗的研究构建
细胞，因此在 HIV疫苗的研究中能够有效的刺激细胞介导的 了一个新的免疫技术平台。该策略在大动物模型和临床试
免疫反应 ]。另外，AAV7和 8能够高效地感染肌细胞，并 验中被证实能够有效的控制 SIV或 HIV的传播，减慢进入艾
可大量表达 目的蛋白 。在表达 gpl60包膜蛋白的 AAV 滋病的病程和延长存活期。但针对病毒载体的预存免疫仍
HIV疫苗的研究中，AAV1、5、7、8能够刺激产生针对抗原的 然是限制该疫苗应用的重要问题，以抗体介导的中和作用能
细胞和体液介导的免疫反应，此反应显著高于 AAV2所引发 够中和进入体内的病毒载体 ，因而限制 了病毒的感染效率和
的反应 ]。因此，众 多的研究表明，尽管 AAV2现已作 为 减少了目的基因的表达，并减弱了疫苗的免疫原性。所以以
HIV疫苗进入临床2期 ，我们仍然需要开展广泛的研究来选 克服预存免疫为目的而进行的研发新疫苗载体是我们所面
择能引发强免疫原性的 AAV载体用于 HIV疫苗的开发 。 临的一个挑战和契机，并为该技术平台应用于 HIV疫苗的研
作为载体疫苗，AAV同样面临着由于先前感染而导致的 究带来希望。
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王程杂志2007年第 l3卷第3期 Chin J Biomed Eng．June 20o7．Vol 13 No．3 · 189·
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2004年2月 V1ROLOGICA SINICA February 2004
HIV疫苗研究进展
王芳宇，罗进贤 ，张添元
(中山大学基冈工程教育部重点实验室．广东广州 510275)
Progress in HIV Vaccine
WANG Fang．Yu，LUO Jin．xl。an’‘
， ZHANG Tian．yuan
(KeyLaboratory ofGeneticEngineering ofMinistryofEducation，DepartmentfoBiochem~try,Sun Yat．sen University,
Guangzhou 5 i o275．Chinnl
关键词：人类免疫缺陷病毒 (HIV)疫苗：DNA疫茼：中和抗体 CTL应答。
中图分类号：R512．91 文献标识码：A 文章编号： 1003．5152(2004)01 0087．05
自从 1983年发现人类免疫缺陷病毒 (Human 制而导致的病毒突变子不断产生，这样就导致了一
immunodeficiency virus，HIV)以来，HIV 一直以惊人 种抗体只能中和一种病毒株而不能中和来自同一
的速度在全球蔓延，感染 HIV 的人数也曰益增多。 个体的另外的病毒株。在 HIV 中所发生的这种基
到目前为止，因患艾滋病死亡的人数已达到 2500万， 因变异使得 HIV疫苗的研制过程更趋复杂。
到 2010年这 一数字可能会突破 8000万，因此研究预 HIV可以通过性行为和血液传播，因而有效的
防和治疗艾滋病的药物也正日益迫切地摆在人们面 HIV疫苗必须能诱导出抑制性传播病毒的粘膜免疫
前。然而，迄今为止还没有 种药物能完全制服艾滋 和抑制病毒直接进入血液的系统免疫。此外，HIV
病病毒(虽然著名美籍华人何大一先生发明的 “鸡尾 可能通过两种方式即游离于细胞外和与细胞相结
酒疗法”在工业化国家遏制了艾滋病的流行)，如果 合而传播，因而提示一一个有效的HIV疫苗应能诱导
一
对一名艾滋病患者进行有效的治疗需耗资 20万美元 种以上的免疫类型，即游离于细胞的病毒能被抗
以上，这对于广大低收入人群来说，无异为 笔天文 体结合并中和，与细胞相结合的病毒能被细胞免疫
数字。因而预防艾滋病毒的感染就成了一种更为经济 清除。最令 HIV疫苗研究者麻烦的是，HIV经常产
有效的途径。根据对以往流行的传染病控制的经验， 生高水平的复制，而且与大多数感染人类的其它病
针对 HIV传染的有效 HIV疫苗则成为首选。 毒不同，HIV的复制机理还不t分清楚，而这种复
制的高水平和持续性不可避免地与临床疾病的快
l HIV 的生物学
速进展相关联。到目前还没有一种疫苗诱导的免疫
感染人并引起艾滋病的 HIV 包括具有遗传多 应答能完全清除或无限地抑制HIV的复制。
样性的 HIV 病毒株系I】，主要分为在两非流行的
2 传统的疫苗设计
HIV一2和在全世界其他地方流行的 HⅣ一1，HIV一1
和 HIV一2在基因序列上差异甚大，以致于它们的外 在进行 HIV疫苗的研究早期，人们首先想到的
膜糖蛋白常常不能引起交叉免疫反应。HIV．1包括 自然是曾成功地控制了脊髓灰质炎病毒、麻疹病
一
些在不同的地理区域流行的不同病毒进化枝或 毒、天花病毒等在人类流行的传统疫苗的设计方
株系，这些不同病毒进化枝或株系在基因序列上的 式。然而迄今为止，在非人类的灵长类和人体早期
差异导致世界上不同的地理区域需要不同的 HIV 试验中，已经证实传统形式的疫苗如活的减毒病毒
疫苗 。 疫苗、失活的病毒疫苗和重组蛋白疫苗在预防HIV
在 HIV感染某一个体的过程中，HIV基因的变 感染和 AIDS发生上均是无效的I引。而且具有很大
异不断产生。由于目前还不确切的 HIV复制的酶机 的局限性：如活的减毒疫苗具有潜在的致病性；带
收稿日期：2003-07—15，修回日期：2003—09—22
作者简介：王宇芳 (1965一)，男，湖南籍，副教授、博士生。主要从事AIDS治疗的药物研究。
通讯作者。Coresponding author．Tel：020—84112397， E—mail：Lsbrc02@zsu．edu．Cl
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88 中 国 病 毒 学 第 l9卷
佐剂的失活病毒疫苗只诱导有限的特异性中和抗 病毒复制。HIV一1通过它的表面外膜糖蛋白 gpl20
体且缺乏 CTL应答；重组外膜蛋白疫苗只诱导针对 结合宿主细胞的CD4受体，并籍此改变构像促进与
病人 HIV一1的非中和抗体，并且缺乏 CTL应答。 趋化因子受体的相互作用，从而感染靶细胞16]。抗
表达大多数 HIV 蛋白的活的减毒疫苗在灵长 体能中和病毒阻止这种进入过程，从而预防感染；
类实验中曾被证明是最好的免疫原，用这样的减毒 T细胞不能预防感染，但能控制 HIV的复制。目前
病毒事先感染可以阻止随后的致病野生型病毒的 已知 CD8 T细胞可通过三种 同的机理控制 HIV
感染 j，高度减毒的 SIV可以保护成年的恒河猴 的感染：(1)通过细胞毒功能杀死感染的细胞；(2)
受 HIV的感染 和初生的恒河猴不产生艾滋病 J。 通过分泌可溶性因子抑制病毒复制 】；(3)通过分
不过，有些受保护的成年恒河猴最终还是发展成为 泌趋化因子如MIP一1 a、MIP一1 p和 RANTES而抑
艾滋病l6 J。而且，这类疫苗在人体的使用还存在安 制病毒进入。因此，一个理想的HIV疫苗既要产生
全上的隐患 J，因而采用这种活的减毒病毒方式 具有广泛交叉反应的抗体又要产生高水平的抗病
生产 HIV疫苗是行不通的。 毒T细胞。
失活病毒疫苗在人类预防流感病毒和脊髓灰 近来，HIV疫苗的研制主要集中在 DNA疫苗
质炎病毒方面曾被证明是行之有效的，然而在SIV／ 上 (见表 1)16]。最近，由编码 Env和／或Rev蛋白
恒河猴模型中进行的评价却令人失望。这种疫苗策 的治疗性 DNA疫苗在 15个无征兆 HIV感染病人
略在预防由同种SIV病毒株感染猴子时可产生最大 中所进行的 I期临床试验表明，HIV DNA 疫苗具
的保护l】川，然而这种保护既不广泛也不强烈；而且， 有潜在的免疫原性和安全性。对于 HIV DNA疫苗
当制备疫苗的病毒株与感染的病毒株在遗传上即 目前采取的策略主要有：以质粒 DNA、活的重组病
使有轻微的差异或当免疫高峰出现几个星期之后， 毒或基因缺失病毒作载体；或采用初始免疫一加强
这种保护就不再存在。此外，有些研究提示在这种 免疫(prime—boost)相结合的组合疫苗策略等。
动物模型中这种保护可能反映的是实验的假象 质粒 DNA 疫苗在恒河猴能诱导 SIV 特异性
(artifact)而不是病毒特异性免疫lJ”。失活病毒免 CTL应答，这种疫苗诱导的免疫能促进第二次CTL
疫原在有限的早期人体免疫性试验中I121的结果也 应答的产生并能控制随后的致病性SIV感染后的病
是令人失望的，这样的免疫原不能诱导中和 HIV的 毒复制fj引；此外，许多研究表明质粒 DNA在二型
抗体应答，这样的疫苗也 能诱导CTL应答。因此， rbimoda1)疫苗策略中作为初始免疫原是十分有效
这种疫苗策略在 HIV疫苗研究中也是不可行的。 的【】 。采用质粒 DNA免疫原作为HIV候选疫苗的
通过重组 DNA技术产生的高度纯化的病毒蛋 人体早期试验研究已在进行中。
白对于人体预防乙肝病毒感染是一个高度有效的 除裸露的质粒 DNA外，病毒载体正逐渐被用
免疫原。几年前，这一技术被应用到 HIV疫苗的设 来携带各种HIV基因。最常使用的病毒有：水痘病
计上，HIV的亚单位如 Env、Tat或 P24蛋白通过 毒[20,21、塞姆利基森林病毒 】、腺病毒 和辛
DNA重组技术产生，结果证明它们在人体试验中具 德毕斯病毒l2踟等。目前研究较多的是水痘病毒家
有良好的安全性『j引。采用重组HIV外膜糖蛋白作为 族，如以牛痘作为载体制成的HIV疫苗在非人灵长
免疫原在非人灵长类动物模型中，动物只得到适当 类实验中能诱导针对HIV和SIV蛋白的较强的CTL
的保护，而且只有在感染病毒与免疫原的外膜糖蛋 应答『2 ，然而出于安全考虑而妨碍了牛痘作为HIV
白序列相同时fj引。此外，这类疫苗倾向于只刺激抗 疫苗载体的进一步研究。另一种作为潜在的HIV疫
体应答，而不能诱导CTL应答。今年 2月，由美国 苗载体的水痘病毒是修饰的牛痘安卡拉 (MVA)，
VaxGen生物公司研制的AIDSVAX gpl20 HIV疫苗 MVA 是一种高度减毒的牛痘病毒株，在非人灵长
在历经三年 5000人次的Il期临床试验后，宣布该 类动物实验中，MVA可诱导强烈的免疫应答。MVA
疫苗不能有效地预防HIV在人体的感染 ，从而为 作为 HIV 疫苗载体不久将会在早期人体试验中进
该种方法产生HIV疫苗蒙上了～ 层阴影。 行评估。作为 HIV疫苗载体，研究最为广泛的水痘
综上所述，采用传统的疫苗设计思路不能产生 病毒可能是鸟类水痘病毒。重组金丝雀水痘病毒最
有效的HIV疫苗。 近几年经历了广泛的人体试验L3 ，这些研究表明它
是安全的，并具有免疫原性，在接种疫苗的个体中
3 新的疫苗策略 能诱导 70％的人产生抗体应答和 30％的个体产生
HIV疫苗的两个重要潜在靶是病毒进入过程和 CTI 应答。
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_E宇芳，等．HIV疫苗研究进展
到目前为止，最有希望作为 HIV疫苗的活的重 病毒已经证明在鼠科动物和非人灵长类动物具有
组病毒载体或许是基因缺失的腺病毒。通过 E1和 强烈的免疫原性 ，这类载体在这些动物模型中能
E3基因缺失或失活而失去复制能力的血清型V腺 诱导高滴度的抗体和高强度的CTL应答。
Abbreviations：Ad5，adenovirus 5；CTL，cytotoxic T lymphocyte；HIV，human immunodeficiency virus；IAVI，International AIDS Vaccine Initiative；lg，
immunoglobulin；IHV，Institute of Human Virology；m-2，interleukin 2；MVA，modified vaccinia Ankara；NIAID，National Institutes for Allergy and
Infectious Diseases．More information Call be obtained from WWW．iavi．org／trialsdb／and WWW．hvtn．org
一 些具有复制能力的病毒也用来研究作为HIV 最近，异质的初始免疫 (DNA)和加强免疫(活
疫苗的可能，如单链 RNA甲型病毒、细小病毒等。 病毒载体)策略因为它们能产生高强度的细胞免疫
此外，为了提高粘膜免疫，细菌载体如 Bacilus 和高滴度的体液免疫应答L3 而受到欢迎，通过活
calmete guerin rBCG) " 等也在考虑之中。 病毒载体如MVA[421或复制缺陷的重组腺病毒(rAd5)
DNA疫苗在过去 10年中广受欢迎，因为它们 8】加强免疫则 DNA初始免疫的有效性得以加强。
简单和能诱导CD4和 CD8 T细胞应答。但研究表 此外，同质的初始和加强免疫 (同为活病毒载体)
明，如果只用 DNA作为初始免疫和加强免疫则不 疫苗也能产生较多的T细胞，但由同质的初始一加
能控制致病性免疫缺损病毒的进攻 b1卯J，这是因为 强免疫疫苗产生的 CD8 T细胞应答要比异质的初
DNA本身不能有效产生高水平的 T细胞。但是在 始一加强免疫疫苗低 引。
DNA 疫苗中加入各种常规佐剂 引、基因佐剂【j j和 尽管对于一个有效的HIV疫苗的组成仍不清楚，
包裹 DNA 的微球 J，则其免疫原性可增加 5～10 但我们已有了一个日趋一致的看法，即一个有效的
倍。例如采用IL一2一Ig融合蛋白I 和CRL1005[381作 HIV疫苗不是单一疫苗模式。在二型(bimo~)疫苗策
为 DNA疫苗的佐剂可控制致病性 SHIV89．6P的进 略中，活的重组病毒载体和质粒DNA可以诱导CTL
攻。 应答，而亚单位免疫原则可诱导中和抗体应答。
～ 一r
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中 国 病 毒 学 第 l9卷
l5—2O
4 小结
【3] DanielM D，KirchhoffF，C ak SC，et a1．Protective efectsofalive
HIV疫苗的研制近年虽取得了一些进展，但确 atenuated S1V vaccine with a deletion in the r gene【J1_Science、
l992，258：1938、l941．
实还存在许多困难。与其它病毒不同，HIV所侵袭
【4] W yan dM S，M ansonK H，LacknerA A，et a1．Resistance ofneo natal
的主要靶细胞是人体免疫活性细胞，从而导致疫苗
monkeys to ilve atenuated vaccnie swains of simian immunod eficiency
无法发挥作用。HIV可以隐藏在淋巴器官、中枢神
virus【J]．Nat Med，1997，3：32—36．
经系统和感染的静息CD4 T细胞 J，在这些部位
【5] Baba T W ，Koch J，Mittler E S，et a1．M ucosal infection of neonatal
它可以不表达病毒蛋白，因而杀伤性 T细胞难以 rhesus monkeys wiht cel—free SIV 【J1 lAIDS Res Hum Retroviruses、
发现它的存在。HIV的Nef、Tat和 Vpu蛋白下调 l994．10：35 1—357．
I型 MHC和 CD4的表达，从而降低 厂细胞免疫 【6] Baba T W ，Liska V，Khimain A H，et a1．Live attenuated，multiply
应答。HIV在感染过程中，其与 CD4受体结合后 deletde simian immunod eflciency virus causes AIDS in infant na d adult
macaques【J1．Nat Med，1999，5：194-203．
构像会发生改变，从而暴露出gpl20上 些新的位
Putkonen P，Walhter L．Zhang Y J，et al Long-term proteciton against
点，但由于这种结合使得 HIV与CD4细胞更加靠
SIV-induced disease in macaques vaccinated with a live atenuated
近，因而在空问上阻止了gpl20上新近暴露的抗体
HIV一2 vaccnie【J1．Nat Med，1995，1：914—918．
结合位点与抗体的结合l4引。同时 HIV外膜蛋白因
【8] Wynad M S，Manson I('Monteifoir D C，et a1．Protection by ilve，
抗体而导致突变的速度非常之快，甚至远远超过因 atenuated simian immunod eficiency virus against heterologous
抗 HIV药物而产生的突变速度l4引，从而逃避体内 chalenge【J1．J Virol，1999，73：8356-8363．
抗体的攻击。HIV还能将自己的前病毒基因整合到 【9] Johnson R P，Lifson J D，C ak S C，et a1．Highly attenuated vaccine
靶细胞的基因组中去，从而在细胞内长期潜伏，逃 strains of simian immunod eifciency virus protect against vaginal
challenge：inverse relationship of degree of proteciton with level of
避免疫攻击。
atenuation【J]．J Virol，1999，73：49524-96 1．
HIV疫苗的研究也受到了 ‘些来 自大的制药公
【l0] M urphey—Corb M ， Martin L N， Davison。Fairbum B，et a1． A
司的冷漠对待，尽管这一状况目前已有所改变。这
form alin-inactivatedwhole S1V vaccnie confers protecitonni macqa ues
或许是因为成功的 HIV疫苗将会减少抗 HIV药物
【J1．Science，1989，246：1293-1297．
的销售，也可能是因为 HIV疫苗的研制成本太高。
【11] StotE J．Anti—celantibodyinmacqaues【J1．Nature，1991，353：393 ．
难于得到足够多的实验动物模型也是制约 HIV 疫 【12] Levine A M ，Nelson R Initial studies on active immunization of HIV
苗研究的一个重要因素。黑猩猩可以被HIV一1感染， infected subjcets usnig a gP120-depleted HIV-1 immunogen：long‘’term
但并不致病；恒河猴可以被 SIV感染并致病，但所 folow-up【J1l J Acquit Immune Deifc，1996，Syndr．1 l：35l_364．
得结果对 HIV疫苗来说只有参考价值，因为SIV与 【l3] MatiluM．An drew JM．A review of vaccinesofrHIV prevenitonIJ1．J
HIV两者抗原在一级结构上有较大的差异。因而建 GeneMed，2003，5：3—10
【l4] Berman P W ，Gergory T J，Riddle L，et a1．Protection of chillpanzees
立合适的足够数量的实验动物模型也是 HIV 疫苗
from infceiton by HIV-1 after vaccniaiton with recombnina t
成功的有效前提。
glycoprotein gpl20 but not gpl60【J1．Nature，1990，345：622-625．
此外，HIV疫苗的临床试验还受到 一些来自文
【l5] Cohen J A estback and aIl advnace on hte AIDS vaccnie front【J1 ．
化、宗教等因素的影响，因此对于HIV疫苗的研究
Science，2003，300：28—29．
也带来了一一些困扰。 【l6] Anla／'a R R．Robnison H L．A new generation of HIV vacines fJ】．
尽管目前在HIV疫苗研究上遇到了 些挫折 ， TrendsMolMed．2002．8：489-495．
但新的进展仍不断涌现，如能中和广泛的HIV一1的 【17] Levy J A，M ackewicz C E， Barker E，et a1．Controlling HIV
特殊抗体 2G12结构的阐明 、HIV小鼠模型的有 pathogenesis：the role of hte noncytotoxic an it—HIV response of C7)8+
T cels【J]．Immunol Today，1996，17，2 17·224．
望建立【 剐等，使我们有理由相信 HIV疫苗的研制会
【18] Egan M A，Charini W A，Kuroda M J，et a1．Sinfian immun od eficiency
有一个美好的明天。
virus(sir)gag DNA vaccinated rhseus monkeys develop escondary
cytotoxic T-lymphocyte erspo nsse nad control viral replication after
pahtogenic SIV infection【J]_J Virol，2000，74：7485·7495．
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王宇芳，等．HIV疫苗研究进展 9l
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· , , . ,
国外医学 流行病学传染病学分册 创洲又年 or 月第 13 卷第5 期 E加i即 M动司 阮ien 。场 d二lo 嘟 1 】
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· ·
综述
H IV 基因治疗概况及进展
陈亮 吴南屏
, 。
[摘 要j 随着人免疫缺陷病毒(印 V )感染在全球的蔓延 寻求有效的治疗和预防方法成为当务之急 卯 年
, 。 ,
代以来 人们开始探索基因治疗的新途径 基因治疗就是将外源性基因转移到合适的靶细胞中 使其表达为 R NA
, , 。
或蛋白质 在基因水平上改变病毒或宿主基因的表达 以达到控制病毒增殖的目的
【关键词】 基因治疗 ;人免疫缺陷病毒(H VI )
, 。 : ,
人免疫缺陷病毒(HW )在全球的迅速传播 使人 作用 其机制为 ()I 在前病毒 DNA 阶段 与其某些
: ,
们迫切认为 确切有效的治疗和预防方法才是当务 区域的双链互补形成三链结构 阻断前病毒基因组
。 , ,
之急 目
;
前 临床应用 的主要是高效抗逆转录药物 的复制和转录 (2) 与靶 m 丑NA 杂交 阻止核糖体和
。 , , , ,
治疗(HA ATR ) 总的说来 H A人TR 能在一段重要的 起始因子的结合 阻断翻译过程 同时激活 助aes H
, ,;
时间内控制病毒复制 也许部分恢复 C4D T 细胞 的 降解靶 m 丑N A (3) 占据酶结合位点 阻止酶与基因
。 。 , 、
功能 然而这些治疗策略并不能消除病毒感染 即 结合 直接抑制与病毒合成有关的逆转录酶 整合酶
, 。 , 。 ,
使面对 HAA
:
TR 病毒复制仍在继续 这种低水平的 等 阻断基因表达 反义 RN A 也存在一些问题 如
, ,
病毒复制可能是影响清除的重要问题 而且绝大多 仍会出现突变的病毒逃逸 RN A 酶对反义 R NA 的降
, 。 。 ,
数进行 HAA R T 的患者 病毒最终能逃避治疗 这些 解等 由于上述问题 近几年用这种方法的基因治
。 。
突变株可能再次造成 CD4 T 细胞丢失和病情进展 疗研究已经很少了
, .
另外很多顽固的副作用产生依从性问题 并有助于 1 2 R N A 干扰(R NA I)
, , ,
造成病毒逃逸 很明显 必须找到新的更有效的方法 近年来的研究表明 将与 m 丑N A 对应的正 义
。
来控制病毒感染 R N A 和反义 RN A 组成的双链 R N A (sd RN A )导人细
, ,
基因治疗就是将外源性核酸导人患者细胞以进 胞 可以使 即丑N A 发生特异性的降解 导致其相应的
。 一 。 一 -
行疾病的治疗 19 世纪印 07 年代人们发现哺乳动 基因沉默 这种转录后基因沉默机制( t降 坛犯义ri p
,
物细胞能吸收和表达外源性基因 故首次提出基因 tio n la 罗en s ilne e n
, 。
i g 用℃S )被称为 R NA 干扰 (R NAi)
。 ,
治疗的可能 近几年由于
:
分子生物学技术的发展 生化和遗传学研究表明 R NA 干扰可能由一种小分
,
因 s s
。 s 一 n
特别是基 重组转基因技术和病毒载体的应用 基 子 d R N A ( iR NA )介导 iR NA 是一个 2 1 2 3 t 的双
。 , ‘ , ’
因治疗研究也取得飞速发展 链分子 3 2
一
端有 3n t 突出并且为去磷酸化 5 端磷
, 。
HW e基因治疗的途径大致可分为基于 R N A 和 酸化 中间 19nt 为双链区域 长 sd R NA 被 R Nsa m
于 : r基 蛋白质两类途径 家族中一个称为 Di ec 的酶以 ATP 依赖的方式切割
s 。iR NA s成 然后 iR NA 结合一个核酶复合物从而形
. ,
1 基于 R NA 的基因治疗策略 成所谓 NR A 诱导沉默复合物 (R ISC ) ’5 磷酸化对
, ,
主要通过干扰 H IV 在细胞内的复制 达到抗病 siNR A进人 R IS C 是必需的 尽管这种结合是非 AT
p
。 , s 。
毒效应 依赖的 但解开 iRN A 双链却需要 ATP 的参与 一
. ,
1 1 反义 R NA 旦打开双链 单链状态的反义链就引导 R IS C 与
l , s ‘
反义 R N A 是指与已知病毒序列互补的核昔酸 证幽A的互补序列结合 并在距离 iRN A 3 端 10 碱
。 o
序列 反义 NR A
l
与 HW 基因组互补结合后对病毒 基的位置切割 证州A
,
的复制转录翻译及与宿主基因组的整合均产生抑制 这种方法不仅具有科学的逻辑性 而且强烈提
作 :
,
者单位 3 1(X刃3 杭州 浙江大学医学院第一附属医院传染病研究所
· . .
. . .
国外医学 流行病学传染病学分册 2X(又年 or 月第 31 卷第 5 期 fb比i, M
e 二se .汕司 冤 肠 】犯,咖 O
e to l祀 r ZX(拜 V ol 3 1 No 5
, 。 。
示我们 基因可 以选择性的沉默 这意味着缺陷的 和发夹状结构的核酶 锤头状核酶和底物结合后形
, ,
基因 例如肿瘤基因甚或 HW 在细胞内复制所必需 成一个锤头状的附和物 包括一个内部的螺旋(螺旋
、 。
的 g ga 或 HW 在体内进行高效复制必需的 fen 基因 工)和两个分子间的螺旋(螺旋 n 1 ) 单链区域高
。 e , 。
都可以被轻易关闭 最近 玩 等川 阐述 了在试管内 度保守 含有对最佳催化活性很重要 的核昔酸序列
,
与 evr 相对应的 si R NA 能抑制 RT 活性和人细胞 C ag 螺旋 工最接近催化中心 对整个核酶的结构产生一
。
p , 。 -42 的产量 ivNo na 等图清晰地揭 示 了与 cD4 及 定的影响 但不是严格需要 的 切割位点是在 5’
一 , 、 ,
g 口召 (p Z ln t s iR NA H w l = 二24 )对应 的 能阻止 (N拼3 和 NH H 告(N 任意核昔酸 H A c 或 u 令为切割
。 -
B ,A)L 对 Hg T 细胞的感染 Jca
。 。
uq 等闭使用与 TLR 处) 发夹状结构的核酶约 50n
t 长 切割 42 tn 的
, 。 一
AT R 可和 nef 基因对应合成 siNR A 成功地阻止了 R NA 核酶 底物复合体的二级结构有两个独立 的
一 一
H 1 十 十
, ,
w (N拼3 )对 M缚 C4D 细胞和 CCRS 细胞 的感 结构域 每个结构域都含有两个螺旋 并被一个环隔
。
ot , 、 ,染 Y 等闭用 自己合成的与 nfe dsRNA 的相 开 其中螺旋 工 螺旋 1 是与底物识别结合 之间的
应片段~ 。也显示 随着 可基因 (与我们引人的 ds R NA 环 A 对切割活性是必需的 切割位点在 ’5 N 十G uC
, = 、 、 、 , 。
片段序列上有同源性 )活性的干扰 MT 4 和巨噬细 (N A G U C 今为切割处 )
。
胞内的病毒复制可被持久地抑制 ,
3 ’S
,
这些结果是极其令人鼓舞的 它们说明了细胞
、 、
内针
v u
对靶基因的 (可能是 L 大屯尺跟 可 梦或
召 g )
, 一
A 1
RN 为基础的治疗 即 RN A 干扰可作为抑制 HW C ‘,丁- .
. ”J ‘,
的 的 一 困 :复制 有效 策略 但还存在 些 难 最重要的是 心 一峋 /
, . . ‘
如 ’ : J . . , : . ,二 1 . . J何确定患者的所有细胞都需要使用 R NA i 其次是 G Y 气
,
需要知道人体细胞摄取 R NA
} } ! } l } }
分子的确切形式 即
} 曰
如
. C*” . ’ · 1 ’1’ ,
, ‘ 、
何把所得到的 R NA i活性成分转人人体细胞 特别是 、 俨沪 “ “
作为病毒感染主要部位的淋 巴组织 和中枢神经系
。 ,
统 目前一个设想是 从 HVI 感染的患者体内移去 .1 锤头状结构的核酶
, ,
前体血细胞 并用抗 HW 基因修饰 然后再把它们回
萝
。 飞 , 辛9 u 9 5
输入患者的血循环 这种想法是基于这些前体细胞 一 ’“护梦梦片 月
“ ”
~ 分 万含节
’3
分一
, 一
H .能分化和成熟为各种类型的细胞 包括那些被 W 5广立竺三竺 A G G U C 人A
~ U A ”
碎 : G七U心 .
。 , r 万丁 8
感染的细胞 另一个方法是使用肠道病毒或细菌 H I 刀左 合:
, UAUU
它们可以作为载体 它们如果能携带编码任何重要 AoAU c -
, ZoM.
的 HW 基因
s
的 i
S I A
NR A 这些 R N 分子经细胞内转
.
相 二目3
,
录而在宿主恰当的组织出现 将明显减少 HW 蛋白
。 , A G
的产量 一旦能做到这点 在特定组织 内积聚的病 C 一 G H ‘
A 一 U
。
毒蛋 白就可相
a
应地减少 这 已经由 iX 等用多聚谷 C 一 G I。
, 0 G U
U
氨酸盐蛋白(它是至少 9 种神经系统退行性疾病的
。
病因)在成年小鼠上得以成功地说明s][ 有可能同
.
2 发夹状结构的核酶
样以病毒为基础的方法也可在人体内作为阻止病毒
。
感染的治疗策略 一人们设计了针对 HW 1不同基因的核酶试图实
.
1 3 。核酶 现对病毒的抑制 R am i等困 了~ 设计 两种针对,
核酶是一种具有催化活性的 R NA 分子 可通过 一 。H VI 1 即l基因 m R N A 的锤头状核酶 一种是针对
, 。
碱基配对特异性地与 R NA 底物结合 切割靶 R NA ,蛋白酶编码区的 凡Pro 一种是针对逆转录酶编码区
、 、
迄今 发现 的 核酶 有 1 类 内 含子 2 类 内含 子 , 一的 ZR RT 后 者能使 HW 1 逆转录酶活 性下降近
e 、 、 、
Rn as P 锤头状核酶 发夹状核酶 丁型肝炎病毒核 。 一% % W an g 等图设计了针对 Hvf l at 基因的锤头
、 。 、
酶 链抱菌属 SvRN A 等 核酶结构有锤头状 发夹
, 一 一
状核酶 R RZ Z 对 HW 1 Il B 及耐 HW 1 株有抑制作
、 。
状 假结样等 目前用于 HIV 治疗的主要是锤头状 。 一用 他们还将这种核酶通过载体转导人 HW l 感染
·
. . , .
国外医学 流行病学传染病学分册 么)〕4 年 01 月第 31 卷第5 期 FOre i即 M诫司 阮ie E扭d ol~ 二 卿
玫”月 恢加晚r Z(X又 V IO 3 1 No 5
, 。 e v ,
者外周血单个核细胞 发现有此核酶的外周血单个 等 R 的 N 端和 C 端具有不同的功能 N 端含有
, 一 , 。
核细胞比没有核酶的生存期长 从而说明针对 H IV l 与 R R E
v
结合的区域 C 端有 Re 蛋白激活的区域
一 , ,
at t 的核酶能抑制 HW 1 的复制 并影响 T 细胞的寿 有人设计了一种 N 端突变的显形突变体 由于缺乏
。 。 ~ ,
命 leK b 等阁在体外针对 H VI l 的 U I下 设计了发 核内定位信号 这种突变体积聚在核外通过两种途
, , ,
夹状核酶 并转导人人 CD4 T 细胞和 H
u t7 8 :细胞 发 径引起细胞死亡 (l) 对病毒蛋 白的抑制作用 包括
。 n 、
现对病毒复制有很强的抑制作用 凡 g 等图设计了 vRe 蛋白 G铭 蛋白的多聚化及衣壳蛋白的正确装
CC I
,
针对 RS nF困A 的发夹状核酶 使受感染细胞的 配 ; (2) 使 R ve 蛋白滞留在胞质中阻止其在核仁中的
。 , 。
CCSR m
o n ’Z
R NA 和细胞表面表达的 CCSR 都明显减少 聚集 对细胞产生毒性作用 W ef d in 等「 J用金微
一 ,
目前多项利用核酶的 HW 1基因
e v
治疗方案已进 粒载体使 R M 10 稳定地导人细胞 在体外对克隆
。 o n 一 ’。 。
人临床 工期实验 W g s 等〔 〕耐 将核酶转导人 株和临床分离株均产生抵抗作用
, , .
HW 感染者自身淋巴细胞 初步实验表明 这种方法 2 2 细胞内抗体技术
, 。
是安全的 转导核酶的 T 细胞可 以生存很长时间 抗体分子的可变区 vF (V H + V )L 保留了亲代抗
, , 。
该领域今后的研究重点包括完善导人技术 选择更 体的抗原结合位点 是最小的活性结构区域 将
, , ,
理想的靶位点 提高切割的效率和在细胞中的表达 V H + V L克隆到单个基因中(S凡 ) 其产物具有与亲
。 。 ,
增强在细胞中的稳定性等 代单克隆抗体相同的亲和力 人劝 基因在大多数毒
. ,
1 4 ’” 、R N A诱饵技术 株中具有高度的保守性 uD an 等汇 〕克隆了抗 eR 的
, , ,
反义 R NA 和核酶具有高度的特异性 可用 于 SF, 在细胞中稳定表达 特异性地抑制了病毒的复
, , 。
HW 基因组的多个区域 但其潜在的缺点是病毒极 制 同时没有观察到明显的毒副作用
。
易变异从而使治疗失败 R NA 诱饵技术利用病毒复 :运用内抗体技术时应当注意以下两个问题 ()l
, , 。
制过程中独特的调节回路 通过引人外源性核酸 稳 联合靶向的问题 内抗体在病毒生命周期不同阶段
, ,
定表达病毒与调节蛋白结合序列共扼的 R NA 分子 都能产生抑制效应 因此针对病毒复制周期不同靶
可与病毒基因组中生理性结合位点竞争结合这些调 位的联合疗法应该更为有效 ; (2) 与病毒入侵或致病
, 。 v 。
节蛋白 从而达到抑制病毒复制的效应 aT t 和 凡 机制有关的细胞蛋白可能是内抗体的最佳靶点 与
, , ,
是两个关键的调节蛋白 分别与 TA R 和 R R E 结合 逆转录酶 RT 低忠实性导致的高频体细胞突变不同
。
这两个序列是高度保守的 与反义 R N
。
A 及核酶不 细胞的靶点不易引起体细胞突变 内抗体很适于病
, v ,
同 Ta t 和 eR 的突变不仅影响其与 NR A 诱饵的作 毒和蛋白的表型敲除 例如导向 E R 的 CCSR 的内抗
, 。 。
用 也同时影响与 T AR 及 R R E 的 因 R NA CC
’4
结合 此 体能消除 SR 在细胞表面的表达 [ ]
,
诱饵技术对病毒株来说应当仍然是有效的 因为病 :同时内抗体技术也有许多尚待解决的问题 ()l
,
毒逃逸要同时具备这两处 的变异 而这种双重事件 需要开发一种能将基因高效传递的转运系统 ; (2)
。
的发生率是很低的 以前设计的 NR A 诱饵都比较 内抗体可能引发机体的免疫识别 ; (3 )如何使内抗
, 。
长 因此在高表达 R N A诱饵的时候往往会与一些细 体在体内稳定高效地表达 只有解决这一系列 问
, 。 , 。
胞内因子相结合 导致细胞功能失调 以后人们发 题 内抗体技术才能真正用于
’4
抗 H w 的治疗[ 〕
, e v .
现 R 与 R R E 主要结合在 R R E 茎环结构 1n3 t 的基 2 3 诱导自杀基因的表达
,
玫e底部位 故 等〔川设计了与此区共扼的最小 R ER 有人认为杀死被病毒感染的细胞可能比抑制病
, , ,
诱饵 不与细胞 因子结合 因此更加安全 这种小 毒更为有效 ;故设计将某些条件毒素基因(如单纯疤
。 ,
R R丑诱饵能更加专一地抑制病毒复制 疹病毒胸昔激酶或白喉毒素基因)引人宿主细胞 在
, ,
病毒调节序列的转录水平的控制下 当病毒复制时
.
, ,
2 基于蛋白质的基因治疗策略 毒素基因大量表达 引起宿主细胞的死亡 从而在产
. 。 ,
2 1 反式显形突变体 生大量新病毒前杀死被感染的细胞 例如 将单纯
一 。
病毒的反式显形突变体在病毒蛋白的重要功能 疙疹病毒胸昔激酶基因克隆到 HW 1 ll R 的下游
。 一 ,
区含有突变 这种突变的病毒蛋白可 以与野生型病 当细胞被 Hw 1 感染时 细胞内产生大量 的 atT 蛋
, , ,
毒蛋白竞争结合靶位点或与其形成多聚体 而抑制 白 Ta t蛋白作用于 叮R 可促进胸昔激酶基因转录
。 v 。
正常病毒蛋白的功能 研究较多的是调节蛋白 Re 和胸昔激酶的表达 后者可使核昔类似物底物如无
·
国外医学 流行病学
O
传染病学分册 2以” 年 01 月第 31 卷第 5 期 F er i即 M翻alc 与 10 r~ (无 比
, , ..
环鸟甘磷酸化 再在正常细胞的作用下三
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基因治疗作为一种新 的治疗手段 在体外已 6 凡拼心皿li A M田七in w w e ras in M et咖 al A 哪 id an d 心ic ne
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证明能有效地抑制病毒 但仍然有许多问题有待研 ~ 油, .
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究 例如 ()l 选择更有效的基因载体 要可注射 可 , , ,7 W an g L dleWi ri n日即 C 儿 gn A et la. 几Ce hn i ccla h teri
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的各类细胞 ;具有归巢功能 它能感知机体损伤 迁 n e e r晓 hT 2 X( X) 7( 5) 川佣 4 61
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目前仍存在体外培养困难 转导效率低的障碍 ; ()3 , , 一 .iV rlo 卿 2X( )X 2 76 (
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对机体免疫功能的影响 目前的治疗方法在抑制病 , , ,10 W面兮Sta a] F R觑hl
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毒或破坏被感染细胞后能否实现免疫重建还需要进 alu eta het an 扭v- li
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一步观察 现在的观点多偏向于联合治疗 即药物 脾 腼 喇, , , .
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一 一二
(收稿日期 2(X只 03 31 )
· ·
消息
、
全国流行病学 传染病学学术研讨会暨高级研修班会议通知
、 、 ·
由中华医学会继续教育部 中华医学电子音像出版社培训部 《国外医学 流行病学传染病学分册》编辑部主办的《全国流
、 ,
行病学 传染病学学术研讨会暨高级研修班》将于 2X( 科 年 12 月 3 一 7 日在广西省南宁市南宁银河大酒店举行 大会将邀请国内
, 。
著名专家进行专题讲座 并同时进行大会交流
:
专题报告 慢性丙型肝炎的抗病毒治疗 ;血吸虫病诊治新进展 ;慢性乙型肝炎的抗病毒治疗 ; 乙型肝炎病毒新基因的研究 ;
禽流感 ;
、
香港和越南禽流感概况 ;艾滋病的病原和临床表现 ; 艾滋病的抗病毒治疗 ;广东省 2)X( 3 2以抖 年 S月班 回顾 ;重症 SASR
的诊断和治疗 ;感染性腹泻研究新进展 ;结核病诊治新进展 ;肝细胞的凋亡研究 ;流行病在传染病临床诊治中的应用 ;狂病诊治
。
新进展
: , : :
秘书处 北京东四西大街 24 号 中华医学会老楼二单元 510 室 ;联系人 曹继霞 ; 邮编 1朋710;
. .
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⑦ 一276
40卷 3期 微 生 物 学 报 V0I_40 No．3
2000年 6月 AcZa M icrobiologica Sinica June 2000
HIV蛋白质优势 B细胞抗原表位的 R讹 ．／，
筛选 、重组表达与抗原性鉴定
杜 勇 徐 静V／李敬云 候利华 王海涛 Q18
— —
医军 葛 生物流行病研究所 北京 10071)
摘 要：设计了一种新的病原体蛋 白质 B细胞抗原表位 的筛选 和重组表 达方法。不须使用
抗原，而通过交替用病人 血清 I G抗体“淘洗”(biopanning)随机肽库和用 正常^血清 lag 反
向吸附，来获得特异抗原 表位资料。用 HIV病人血 清的 I 抗体淘洗噬 菌体递呈随机十二
肽库 ．再 以正常^ [gG抗体吸附 ．筛选到了能和 HIV 病^血清发 生特异反应的噬菌体克隆 ．
经 ELISA、DNA测序等．成功地筛选 出了位于 HIV gp41外膜蛋 白、高亲和力、构型特 异 的优
势 B细胞抗原表位(60 GcsGKLIm )。用大肠杆菌硫箕还蛋 白作 为骨架 ，在其活性部
位以“内融台”形式重组表达 了该抗 原表位 ，纯化 的重组 蛋 白具 有 良好 的抗原性 ，能与 HIV
(+)lag 抗体厦艾滋病 ^血清呈特异反应 ，表 明本技术路线可以有效地进 行 HIV蛋 白质 的 B
细胞抗原表位筛选 和重组表达。此方法也可移植 于其它病原微生物抗原 或 自身抗 原的表位
研究，继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂 的研 制、疫苗的设计提供依据 。
关键词：t 一v 垫要至些t喧丑肽压，萼塑蠢垫，ELISA
中圈分类号 =Q78 文献标识码 ：A 文章编号 ：0001—6209(2000)03—0270—76
对众多的传染性疾病、过敏性疾病及 自身免疫性疾病而言，其病人血清中的特异抗体
是 引起免 疫保护 和免疫 病理损 伤 的主 要 因素 ，从 而成 为能 够反 映病 原 体 的致 病 性 质和 宿
主的免疫 状况 的重要“信息库 ”；原病原 体上 的相应 抗原 表 位也 成 为研 制 特 异诊 断试 剂 和
疫 苗 的靶 标。 目前 常用 的分析蛋 白质抗 原表 位 的方 法 均需 要 有 高纯度 的抗原 、或 编码 抗
原 的基 因序列 ，这使得 对那些 复杂 或未知病 原 体的表位 分析工 作无法 进行 。
新近 发展 的噬菌体递 呈随机 肽库 (phge display random peptide library)技 术 ．已被 广
泛 用于蛋 白质分 子间相互 作用研 究 ，包括抗 原一抗 体 系统 。以随机肽 库的 高度多样性 、敏
感 而独特 的筛选方 法和抗原 一抗 体反应 的特 异性 作 为 理论 基 础 ，随机 肽库 相 关 技术 可 能
成 为诠 释 病人血 清抗体“信息 库”的一种 途 径 。基于 此 ，我 们设 计 了 一种新 的表 位 分析 方
法 ，成 功地从艾 滋病病 人血 清 中筛选 出了位 于 HIV gp41处 膜蛋 白的高 亲和 力 、构 型特 异
的 B细胞抗原表位 ，并利用太肠杆菌 的硫氧还蛋 白作为骨架 ，以“内融合”的形式表达 了
单 个抗 原 表位 ．经 ELISA 鉴定 ，纯化 的重组蛋 白具 有 良好 的抗原 性。
1 材 料和 方法
1 l 主要试剂
噬菌体递呈随机十二肽库试剂盒 (Ph D．．12 M Phage Display Peptide Library Kit)购
作者简介：杜 勇(1965 )．男．江苏邳县^，军事医学科学院散生物流行 病研 究所副研究员 ．博士，主要从事病毒
的 分子 生 物学研 究
收 藕 日期 ：199812 21．酱 回 日期 ：19994}5-17
维普资讯 http://www.
3期 杜 勇 等 ：HIV 蛋 白 质优 势 B细 胞抗 原 表位 的筛 选 、重组 表 达 与抗 原性 鉴 定 271
自美 国 New England BioLabs公 司 ，肽 库 的 滴度 为 4×10 pfu／mL，随机 多 样 性 为 1．9×
l0 ，受 体菌为 E．coli ER2537；大 肠杆 菌表 达 系 统 ThioFusio Expression System 购 自
美 国 Invitrogen公 司 。”S—dATP、Sequermse Version 2．0 DNA Sequencing Kit购 自美 国
Amersham 公 司 ；HRP一兔抗 M13抗体 为 本 室标 记 (效 价 1：1000)。HIV诊 断试 剂 盒 为荷
兰 Vimnostika* HIV Uni。Form 1I plus。艾 滋诊断试 剂 国家参 比品 (批 号 9701)购 自中 国
药 品生物 制品检 定所 。辣 根过 氧化物酶 标记羊 抗人 IgG购 自华美公 司 。
1．2 实验用 IgC抗 体
HIV(+)IgG来 自确 诊 的艾 滋病病人 血 清 ，HIV(一)IgG 来 自正 常人 血清 ，HCV(+)
IgG来 自丙 型肝炎病 毒 (HCV)阳性 、HIV 阴性 的病人 血清 。所有 IgG 均 经 1次 5O％、2
次 33％饱 和硫酸铵沉 淀 ，HIv 标准试 剂双抗 原夹 心法 检测 。
1．3 随机肽库 的淘洗 与吸 附
1 3．1 噬菌体 的生物 淘洗 (Biopanning)：将 制 备 的 HIV病 人血清 IgG 多克隆抗 体稀 释至
150~g／mL，每孔 150 L包 被聚 苯 乙烯 微 孔 ，4℃ 过夜 ，3％BSA 封 闭 lh。用 300~LTBST
(50mmol／L Tris-HCl，pH7．5，150mmol／L NaCl，0 5％ Twean一20)缓 冲液稀 释 10 L肽 库
原液 ，按 l00 L／孑L加 到微孔 内，室温缓 慢摇荡 1h，去掉 液体 ，TBST洗 涤 10次 。每 孔加 人
100vL 0．2mol／L甘氨酸一 盐酸 (pH2．2)，室温孵 育 10arin，洗 脱结合 的噬 菌体 。
1．3 2 非特异 噬菌体 的反 向吸附 ：将上述 洗脱 的噬菌 体加 到用 正 常 人 IgG抗 体 (150vg／
mE)包 被 的微 孔 内 ，室温 慢摇 1h以吸 附 非 特 异 噬 菌体 。将 吸 附后 的洗 脱液 加 到 20mL
E．coli ER257培养液 (0／9550=1．O)中，37℃ 250r／min培养 5h，12000g离 心 10rain，收集
上清 ，加 人 4％PEG8 000、3％Na(31，冰 浴 1h，12 000g离 心 15arin，沉 淀 的 噬 菌 体 悬 浮 于
lmL TBST
1．3．3 特异噬 菌体 的筛 选与 ELISA 鉴定 ：按 上述 步骤 ，将 制 备 的噬 菌体 再 淘洗一 吸 附 2
次 。第 三 次淘洗 的噬菌体 1：1000稀 释后 ，感 染 E．co／i ER2537，铺 制平板 ，37℃培 养 10h。
挑取单个噬斑 ，按常规方法制备原种 。将原种倍 比稀释后，ELISA检测其和 HIV病人血
清 IgG抗 体和 正 常人 IgG抗 体 的反 应 ，仅 和前 者 抗 体 反应 、而 和正 常人 血清 IgG 抗 体无
反应 的噬 菌 体 原 种 即 为 阳性 克 隆 。 按 说 明 书 操 作 程 序 ，对 阳 性 克 隆 提 取 单 链 DNA，
Sanger双脱 氧链 终止 法测序 。
1．4 重组表达质粒的构建
人工合 成编 码 抗 原 表 位 的寡 聚核 苷酸 序 列 口1(54bp)；5 TAC GCG GCT CfoGGCT
GCT CTG GGA AAC TCA TCT GCA CCA CTT GCG GTC CGC TAC 3 和 互 补 链 p2
(54bp) 5 GTA GCG GAC CGC AAG TGG TGC AGA TGA GTT TCC CAG AGC AGC
CCG GAC CGC GTA 3 (下划线 为抗原 表位 编码 序 列 )，序列 的两 端各 加 Rsr 1I酶 切位 点
和保护碱基。两个序列样品用纯水稀释后以等摩尔数混合 ，95℃变性 3arin，缓慢降至室
温，使之退火形成双链 。加入 内切酶 Rsr I，37℃酶切 16h，生成带粘性末端的 DNA片
段 。大肠 杆 菌表 达质 粒 pTrx经 Rsr 1I酶 切 、CIAP去 磷 酸化 ，与 上述 DNA 片段连 接 。连
接 物转化 大肠杆 菌 G1724，挑取单 菌落 ，经 PCR及酶切 鉴定 阳性 克 隆和 插人 片段 的方 向。
1 5 重组蛋 白的诱导 表达与 纯化
1．5．1 重组蛋 白的诱 导表 达 ：挑 取单 个 菌 落 接种 于 RM 培 养 基 ，3O℃ 、250r／min培 养过
维普资讯 http://www.
微 生 物 学 报 40卷
夜 。按 1：20接 种于新 鲜 的诱 导培养 基 ，继续在 30℃ 振摇 培养到 OD550=0．5，加 入色氨 酸
至终浓度 为 100mg／L，诱 导培 养 5h，离心集 菌。
1．5．2 重 组 蛋 白 的 纯 化 与 鉴 定 ：PBS缓 冲 液 悬 浮 菌 体 ，超 声 波 粉 碎 后 ，12 000g离 心
15rain沉淀包 含体 ，再 以含 0．5％ TritonX一100、2tool／L尿素 的 PBS洗涤 包含 体 2次。用
8tool／L尿素溶解包含体 ，然后逐步降低尿素浓度 ，使蛋 白自然复性。SDS-PAGE电泳后，
免疫印迹(Western Blolt)鉴定其抗原性，第一抗体为 1：50稀释的 HIV感染者血清，第二
抗 体为辣 根过氧 化物 酶标记 的羊抗 人 IgG 抗体 (1：200)，底物 为 DAB。
1．6 ELISA
用表达 的抗 原 表 位 重 组 蛋 白(2~tg／mL)包 被 微 孔 板 ，检测 其 和 不 同 IgG 抗 体 、HIV
(+)／(一)血清、艾滋诊断试剂 国家参 比血清的反应。实验程序为常规 ELISA方法 。
1．7 DNA序 列测定
将重 组表达 质粒 上 的插人 DNA片 段亚克 隆到 pBluescript II SK (+)中 ，转 化大肠 杆
菌 E．coil XL1一Blue，挑 取 阳性 菌落 ，提 取质粒 ，用 373A 型 自动测 序仪测 序 。
2 结果
2．1 HIV病 人血 清特异 IgG抗体滴 度 测定
为保证淘洗和吸附过程 的特异性，首先用双抗原夹心法检测 了所制备 的 HIV(+)和
卜Ⅱv(一)血清抗体，结果显示 ，高稀释度的 HIV(+)抗体仍可 以和 HIV抗原发生反应，即使
总抗体浓 度稀释至 lt~g／mL，其 OD490还远 高于 临界值(0．152)，说 明总抗 体中存在 着高滴度
的抗 HIV抗体，这确保了淘洗的敏感性 ；Hiv(一)抗体和 HⅣ 抗原之间无明显反应，这保证
了吸附过程中 ，不 至于吸附掉 目的噬菌体克隆。
2 2 阳性噬菌体克隆的筛选
用 HIV(+)IgG和 HIV(一)IgG检测第三轮淘洗一 吸附后的噬菌体克 隆，共检测 96
个样品，其中与 HIv(+)IgG结合 、而与 HIv(一)lgG不结合的有 20个 ，阳性率为 10．4％
(20／96)(图 1)。
2．3 阳性噬菌体递呈肽的氨基酸序列特征
对 ELISA检 测 阳性 的 13个 噬菌体克 隆进行 DNA 序列测 定 ，其编码 氨基 酸 的密 码于
均 为 NNK(N=G orA orT or C；K=G
1 0
or T)，这和构建随机肽库所用 的寡核苷
O 8
酸序 列 特征 一 致 ，说 明所 测 序 列 确为 随
S 0 6 机肽 库 的递呈 片段。这 13个 序列 中，
C 0 4
出现 了 完 全 相 同 的 序 列 。 推 导 上 述
0 2 DNA 序列所 编码 的氨基 酸 ，即为 阳性 噬
0 0 菌体 递 呈 肽 的 舞 基 酸 序 列 (图 2)。13
P3 P4 P5 P】3 4兀 6 p17 P22 P29 P44 P74p86 Pgl M13
P{~itive dbn髑 个 阳性 递呈 肽 可分 为 五组 ，分 析这 五组
图1 阳性噬菌体与HIV(+)／Htv(一)IgG的免疫反应 氨基酸序列 ，可 以发现每组序列都有间
Fig 1 I re删vltv of positive cloneswithHIV( ) 隔 5个 氨基 酸 残基 的两个 半 胱 氨酸 ，经
／HIV(一)IgO ELISAM13：naga control 用 CLUSTW 软 件 比较 五 组 递 呈 肽 与
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3期 杜 勇 等：HIv蛋 白质优势 B细胞抗原表位的筛选 、重组表达与抗原性鉴定 273
HIV-I所 编码 的氨基 酸序列 ，在 HIV-I gp4l蛋 白上找 到 了位 于 602～613aa的同 源序 列
( 。GCSGKLICTTN ”)，这些资料说明在此处有一个优势抗原表位 。
图 2 阳性 噬菌 体 递 呈 肚氨 基 酸 序列 比较
Fig 2 Comlmifsion d amino acid d tx：~ittve phage rlones
2．4 HIV优一势 抗原表位在 E．coil中的表达与纯化
人工 合成编码上 述优 势抗 原表 位 的 DNA 序 列 ，插人 到大肠 杆 菌 硫 氧 还 蛋 白基 因 的
RsrⅡ切点处 ，构建 了“内融合”型表达 质粒 pTrxHIVp。携 此质粒 的 E．coli GI724经 色氨
酸诱导后 ，表达了相对分子量为 12kD的重组蛋白，表达量占细菌总蛋 白的2O％。可溶性
分析表 明此蛋 白在细 菌 内以包含体 形式 存 在。经 包 含体 的提 取 、洗 涤 、变 性 与复 性 获得
了纯度 较 高的表达蛋 白(图 3) Western Blot分 析 ，表 达 的 蛋 白可 以 和 HIV 感 染 者血 清
发生反应，表明其具有 良好的抗原性。将此重组表达蛋白命名为 PI2。
2．5 重组 蛋 白 P12与不 同 I 抗 体的反 应
以重组蛋白 P12作为抗原，分析其与 HIV(+)IgG、HIV(一)IgG和 HCV(+)IgG 的
免疫反应。结果 P12仅与 HIV(十)IgG有特异反应 ，且反应强度 与抗体浓度有剂量反应
关系，而与其它两种抗体无 明显反应(图4)。
M 1 2 3 4 5
图4 重组 P12蛋 白与不同 IgG抗体的反应
Fig 4 Immu~ reaetiv[cy of r~ambinant PI2 with three kinds
ofIgGs byELISA
2．6 重组蛋白 PI2与艾滋病病人血清的反应
以重组 蛋 白 Pl2作 为 抗 原 ，分 别 检 测艾 滋
病病人血清 13份 、正常人血清 9份 (图 5)，结
图 3 表 位 重 组 蛋 白 P12的 SDS-PAGE 和
We~tern Not分 析 果 与艾 滋 病 病 人 血 清 的反 应 呈 强 阳 性 ，OD490
F'tg 3 SDs_PAGE and W estertl blot analys~ of 范 围在 0．4～1．6之 间 平 均 为 1．18；与正 常人
eombinam PI2 exDre蛐 n in E 口 GI724
血清的反应很弱．0D49 范 围在 0．085～0．232
M mark~；1 {ndmM E coLiG1724／pTrxHIVp；2
E．∞ GI724／pTrxHIVp b induedon；3，4 pLm— 之间，平均为 0．13。这些数据说明 PI2可以特
fled r啪 啪 c P12：5 W ㈣ Not P12
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274 微 生 物 学 报 40卷
异地与艾滋病病人血清反应 ；同时也说明，用作重组蛋 白骨架的大肠杆菌硫氧还蛋 白与人
的血清抗体无明显 的交叉反应。这为实际应用硫氧还蛋 白作 为抗原表位载体奠定 了基础。
1 8
蓦 0C
l 6
l 4 1 L 1 1 0 0 0 O
6 4 2 O 8 6 4 2 ，
1 2
兽 1 0
8 0 8
0 6
0 4
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0 0 1．。I1．I。．1I． ．IJ -一。-，
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l1 12 13 1{ 15 16 17 18 l9 20 21 22
NO of samp1 es
图5 重组 P12蛋 白与 HIV(+)／( )血 清的 ELISA反应
Fig 5 lmmunoreactivity of P12 withHIV(+)／(一)s啪 by ELISA 1～13，3e工a ofAIDS；14～22，sere of n曲 -AIDS
2．7 重组蛋白 PI2与艾滋诊断参 比血清的反应
以重组 蛋 白 P12作 为抗 原 。检测艾 滋诊 断试剂 国家参 比血清 45份 ，其 中阳性 血清 30
份，阴性血清 15份。在傈证特异性 100％的情况下 ，P12可以检测 出阳性血清中的27份，
阳性率为 90％(图6)。说明本实验所筛选的抗原表位确是优势表位 ，在绝大多数 (90％)
HIV感染者血清中高水平表达，仅在少部分病人中呈低水平表达。
lI．。．。．1I．。．。．
i 3 5 7 9 11 l 3 l5 l 7 l9 2】 23 25 27
0． of serum samples
图 6 重 组 PI2蛋 白 与艾 滋 参 比血 清 的 反应
ng 6 lmmunoreaetivity of recombinant P12 with reference sera panel
ofHIV 1～13 HIV(+)s％ ；32～45}ⅡV( ) The value cut-offis 0 1
3 讨论
近 年来 ，因广泛 用于蛋 白质分 子间相 互作 用研 究而被 称为“万能 库 (all purpose)的噬
菌体递呈随机肚库，也被用在蛋白质抗原 B细胞表位的~#idat ～ 。为拓宽噬菌体随机
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3期 杜 勇等 ：HIV蛋 白质优势 B细胞抗原表位 的筛选 、重组表达与抗原性鉴定 275
肽库在抗原表位分析 中的应用，我们设计 了一种新的抗原表位筛选方法：不须使 用抗原，
而 通过交 替用病 人血 清 IgG抗 体“淘洗 ”(biopanning)随机肽 库 和 用正 常人 血 清 IgG 反 向
吸附的方法。我们用 HIV病人血清的 IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机十二肽库，再以正常
人 IgG抗体吸附，筛选到 了能和 HIv病人血清发生特异反应的噬菌体克隆 ，经 ELISA、
DNiA测序等分析 ，表明在 HIV gp41外膜蛋 白上，存在着高亲和力 、构 型特异 的 B细胞抗
原表位(6o GCSGKLICTTNv6”)。这和 Joseph等 利用具有中和病毒 活性 的人单克隆
抗体所筛选的优势抗原表位相符。此序列的两个半胱氨酸可以通过二硫键而形成一个环
状结构 ，从 而成 为强 的抗原 表位 。
目前大多利用合成肽来研究抗原表位 ，但在应 用中，合成寡肽存在着不正确折叠 、固
相化时 的“空 间位 阻”及 价格 昂贵 等不利 因素 。为此 ，我们 利 用 大肠 杆菌 硫 氧还 蛋 白作 为
骨架，重组表达了“内融合”型抗原表位。大肠杆菌硫氧还蛋 白的第 32、35位氨基酸为半
胱氨酸 ，这两个半胱氨酸结成二硫键 ，使在蛋 白质的表面形成一个 凸出的环(1oop)，作为
抗原 时 ，此 环状结构 易被 免疫系统 所识别 。理 论 上 ，若在 此 环 内插 人 一个 短 肽 ，则 短 肽可
能被 提呈在 融合 蛋 白表 面而成 为 良好 的免 疫 原 。另 外 ，编码 环 的基 因序 列 内恰 有 一个 限
制性内切酶 Rsr lI的切点 ．这为基 因重组提供 了基础 。本实验 中，我们人工合成 了编码
HIV蛋白质优势 B细胞抗原表位的 DNA片段 ，并重组人硫氧还蛋白的基 因内，构建了重
组 表达质粒 pTrxHIVp，诱 导表 达和纯 化 了重 组蛋 白，经 ELISA 鉴定 ，此蛋 白和正 常人 、丙
型肝炎病人的 IgG和血清无明显 的反应，而和 HIV(+)IgG及艾滋病人血清有很强的免
疫 反应 ，这些 结果 证明 了所设计 方法 的可行 性 ，也为 抗原 表位在 特异诊 断试剂 和疫 苗研制
中的实 际应用 提供 了一条新 的途径 。
HIV— l gp41是病毒 的 跨 膜 蛋 白 ，序 列 相 对 保 守 ，含 有 多个 B 细胞 抗 原 表 世 ，抗
gp4l的抗体出现早 ，且可在较长时间内保持较高水平 ，检测 HIv抗体 的初筛试剂大多数
是根据人体对 gp41的抗体反应而设计 的，因此 ．gp41可以用作 免疫诊断或免疫预防／治
疗的靶标，我们的实验结果支持这一结论 ．并可能为设计表位水平的高度特异、敏感诊断
试剂提 供有 益 的线 索 。
参 考 文 献
Darde~D A MethodsEnzymo1．1996，9：494～507
FolgoriA．TdiR，MoDLaA al EMBO J，1994．13(9)：2236～2243
Dybwad A，BogenB，Natvlg J B，et ClinExp l~ uno1．1995，102：438— 442
Germa~hewskl V，Muray K．J Vim[Me cl】ods，1996、5B：21—32
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微 生 物 学 报 40卷
SELECTIoN AND RECoMBINANT EXPRESSION oF AN
IM M UNODoM INANT B CELL EPrIoPE 0F HIV GP41
Du Yong Xu Jing Li Jingyun Hou Lihua W ang Haitao
(Departu re of"Appgi~dMdecu~r＆硒 -，l~stituteof,'Vlicroblak~ -andEl~demiology，Bvijlng 100071)
Abstract： A novel m ethod was designed for disease—speciifc B cel epitope m apping and epi—
tope expression in E．eoli．A phage library displaying random dodecam ers was biopanned
first with human tota1 IgG antibodies against HIV-1，and then non-specific phages were sub·
tracted by HIV(一)polyclonal antibodies．After three rounds of screening，the positive
phages were tested in an ELISA for their reactivity with HIV(+)一Iga and HIV(一)-Iga
antibodies．Phages that showed positive reactivity with HIV(+)一IgG，but negative to HIV
(一)-Iga，were selected and their displayde peptides were determined by DNA sequencing
All the 13 positive clones sequencde displayed five kinds of peptides(SPKCLGKLLCAF，
THQCLGKLQCGV，SCSAKFTCrTQI，KSDCSARFMCSV，DCLKQWACEWSR)htat
have homology to the HIV．1 gp41( 。 GcSGKLIcTTN )，demonstrating there is a dom．
inat epiotpe in the region．
Key words： HIV ，Epitope m apping， Ran dom peptide librayr ，Recombinant expression，
EI，ISA4-04
or arvelo
nera
A fragments
PCR
PCR)
bes
Key words
v infe
dUTP
HIV.
CMT-GAPSTM
dNTP P
640114-89098,E
C1994-2012ChinaAcademicJournaleLectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/
4
Klenow
2
HIVIU26942
%SDS)、C
ug/ul
00-750bp
M18192021
42526272829303132
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42.P<
85℃
o1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/
12345678910111213141516
●●●●
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ABCDEFGH
0参单
BCDEFGH
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KLMN
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Hiv gene chip
from
gradual fluorescent intensity
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PCR
DNA
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o1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/
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Li L, Ma WL. So
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Exp Clin vi
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R575.04
000-2588(2002)08-0
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kou City, Zhoukou 466000, China
CS)
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4
03948232668
C1994-2012ChinaAcademicJournaleLectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/比京协和医学院;中国医学科学院
博士学位论文
HIV-1感染相关的基因在中国20个民族群体中的多态性研
姓名:钱源
I请学位级别:博
专
导教师:褚嘉祐
2008060
因医学科学院
医学院
博上研究生学位论文
HIV1感染相关的基因在中国20个民族
群体中的多态性研究
各地广;
是不同地区的流行病学特征都各不相同
导致这种差异的原因很多,包括机体免疫功能强弱、感染毒株的毒力、是否接受
疗以及遗传背景等因素。其中,与HV感染相关基因的多态性与个体的感染
艾滋病风险和感染后疾病进展密切相关。基于以上原因,本研究希望通过在大量
健康个体中对HV1感染相关的基因进行突变分布研究,描述突变位点在不同群
体中的分布特征,推测造成这种分布的原因,初步预测不同群体的易感性以及感
染后疾病进展
本研究采用PCR和 PCR-RFLP的方法对全国20个不同民族群体(包括
南特有的少数民族群体)进行了5个
感染相关基因的突变位点的检
测,即艾潋病易感性筛查研究。这5个基因均与艾滋病病毒入侵人体细胞密切相
关,包括主要协同受体CCR
要协同受体CCR2、CX3 CRI CCR5天然配体
RANTES以及CXCR4天然
据每个个体三个基因座位上的
R2SDF)突变基因型组合计算中国20个不同民族群体的相对感染风
险值
研究结果显示:(1)所研究的中国20个民族群体中都缺乏
突变
因此与欧洲群体相比来说,这些群体的 CCRSA32频率都相对低得多
和CX3CR1280M的频率表现出从
南向北渐变的特征。(2)本研究中CCR264
RANTES
CX3CR1-249和CX3C
M的分布在不同民族群体中存在差异。(3)不同民
族群体之间存在RH值的差异。与欧洲群体相比,这些民族群体的RH值都较高
(4)分布于南方的群体相对于北方的群体来说具有较高的RH值
CX3CR1-249
单倍型频率相对较低。(5)一定程度上相同语系的不同民
群体具有接近
CX3CR128M分布。(6)具有共同起源或者遗传背景较为接近的群体具有相
c、CX3CR
和CX3CR-280M分布
关键词: HIVAIDS,相关基因,多态性,群体,易感性
国医学科学院北京协和医学院
博士研究生学位论
polymorph
and rem
em. the
HIv-1 strait
background of
po
diffe
HIv-l related gene locus
CR-RFLP
ceptors. RANTES ar
re the nature ligands for CCR
CXCR
ene
ng
CCR5A3
Eu
A、 RANTE
C、cX3CR
nd cX3
ex a
th have the
ndex and维普资讯 http://www.
390 中国公共卫生 2004年4月第 20卷第 4期 ChinJPublicHealthApril2004 Vo1．20No．4
文章编号 ：1001—0580(2004}04—0390—02 中图分类号 ：R34 文献标识码 ：A 【论 著】
HIV／AIDS患者基因变异与疾病关系的研究
文小宁，尚红，韩晓旭，张曼，张子宁，王亚男，姜拥军
摘 要：目的 研究HIV一1感染者／AIDs患者体内不同亚型HIV一1 tat基因序列特征、突变特点及与疾病进
展的关系。方法 采集辽宁省 22例 HIV感染者／AIDS患者的血液样本，提取含有整合 HIV一1前病毒的基因组
DNA，nseted—PCR扩增后直接测序，并做序列排列比对、翻译和分析。结果 22株辽宁省流行的 HIV一1病毒分属
B’及B’／c重组亚型。AIDS患者体内病毒tat区第一外显子发生氨基酸突变，58位点出现T取代A，无症状感染者未
发现此变异。此外还发现7，20，24。59，62，64位点出现取代变异，这些变异在AIDS 病组要高于无症状感染组。结论
B’和 B’／C重组亚型 HIV一1tat基因第一外显子氨基酸序列发生的变异与疾病进展相关；同时还发现 AIDS患者的
tat基因第一外显子的其它一些取代变异。
关键词：HIV序列分析 ；Tat蛋白；基因变异
Study on relationship between gene variation and disease progression of HIV／AIDS patients WEN Xiao-ning，SHANG
Hong，HAN Xiao-xu，et a1．ArDS Research Center，the First Affiliated Hospital，China Medical University(Shenyang
110001，CJlina)
Abstract：Objective To study on the characters of HIV一1 Tat exon 1 amino acid sequence and mutations and the re．
1ationship with disease progre~ion among HIV一1 infected people and AIDS patients．Methods To collect 22 cases’whole
blood samples of HIV carriers and AIDS patients in Liaoning province and to extract the PBMC genome DNA．The HIV—l
tat ex0n 1 was amplified by nested— PCR iw th att specific primers．Products were sequenced idrecdy．Sequencse were
aligned ．translatde and analyzed．Results 22 cases HIV一1 strains epidemic in Liaoning were found to be of genetic subtype
B’and B’／C．In AIDS group，finding some amino acid mutations at specific position of tat exon 1，position 58 T substitutes
A．This variation appearde only in AIDS group．In addition some other variations in position 7，20。24，59，62。64 were found．
AIDS group was highat than asymptomatic HIV 一1 infection group sa to these variation．Conclusion In AIDS patients of
subtype B’and B’／C，there was amino acid esquence vairation of HIV一1 tat exon 1 which positon 58 T substituted A．
which indicated its relationship with diseaes progression．At the same time，osme other substitution variations of tat exon 1 in
AIDS patients was found．whose significance needed further research．
Key words：sequence anlaysis；tat protein；genetic variation
艾滋病病毒在复制过程中不仅编码结构蛋白和酶蛋白。 的 HIV一前病毒 DNA)，1％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量。
还编码一些辅助调节蛋白，其中能够调节 HIV转录的反式激 紫外分光光度计定量。
活蛋白(Transs—activator protein，Tat)的高水平表达 可促进 1．2．2 nested —PCR扩增 以 tat调节基 因区特异性引物
HIV的快速繁殖[1】。研究表明，HIV复制水平对 HIV感染后 NP7(5’一CAGGTAAGAGATCAGC~TGAACA一3’)和 ENV
疾病进展至关重要[ ，作为调控 HIV转录的主要因子的 Tat 一 1(5’一TTCCACACAGGTACCCCA一3’)为外 侧引物进行
蛋白及编码它的 tat基因受到国际艾滋病研究领域 的关注。 第 1轮 PCR扩增，同时设阴性对照和阳性对照 ；以 tat—B(5’
已有报道，tat区基因存在变异[3·43本研究通过 比较无症状的 一 AATGGAGCCAGTAGA-TC 一 3’)和 NP11(5’一 CC—
HIV一1感染者和 AIDS病患者体内 HIVtat基因的变异特 CATAATAGACTGTGACCCACA一3’)为 内侧 引物进行 第 2
点，初步探讨 HIV一1 tat区变异与疾病进展的相关性。结果 轮 PCR扩增。(1)首轮反应体系和反应条件为：总体积 3O l。
报告如下。 dNTP浓度 200 tlmol／L，DNA聚合酶 0．75 U，引物浓度 0．8
1 对象和方法 tlmol／L。核酸样品5 l，及相应的缓冲液。反应条件：94℃ 3
1．1 研究对象 22例 HIV一1阳性标本来源于中国医科大 min。53℃ 1min。72℃ 2．5min。5个循环 ；94℃ 30 s．55℃ 30
学附属一院艾滋病确认实验室。均经免疫蛋白印迹(wB)试验 s，72℃ 2．5 min。30个循环；72℃ 10 min。(2)第 2轮反应体
确认。根据(2001年中华人民共和国 HIV／AIDS诊断标准> 系和反应条件：总体积 5O l。取首轮扩增产物 5 。引物浓度
进行疾病分期。其 中无症状 HIV感染期：CD4 细胞≥200× 0．8 tlmol／L。dNTP浓度 200 tlmol／L，DNA聚合酶 1．2 5U。及
1O ／L；AJDS病期：CD4 细胞<200×106／L。 相应的缓冲液。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s。
1．2 实验方法 72℃ 45 s。3O个循环；72℃ 10 min。取 5 l PCR产物经 1％
1．2．1 标本采集与处理 无菌采取静脉血 5 ml，EDTA抗 琼脂糖电泳，与标准对照及阴性和阳性对照对 比。判断结果。
凝，一2O℃贮存。取 200 tA全血。以 Qiagen公司 QIAamp 1．2．3 PCR产物回收 以 Qiagen公司 QIAquick Gel Extrac—
DNA Blood Mini Kit。按操作说明提取基因组 DNA(含有整合 tion Kit按操作说明回收 目的 DNA片段。1％琼脂糖凝胶 电
泳检测回收质量，并用紫外分光光度计测定 DNA含量。(1)
*基金项目：国家 自然科学基金资助项目(30271188)
基因序列测定 ：取 50fmoles PCR扩增片段为模板。tat—B为
作者单位：中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所，沈阳 110001
作者简介：文小宁(1978一)，男，辽宁沈阳人。硕士，主要从事艾滋 测序引物，IRDye TM800 Terminator Mixse为底物，测序试剂
病流行病学调查和防治工作。 盒(Themo Sequen~ Cycle Sequencing Kit)双脱氧终止法进行
通讯作者：尚红 测序反应，醋酸钠乙醇沉淀法回收反应产物，LI—OgR Glohal
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中国公共卫生 2004年 4月第 2O卷第4期 ChinJPublicHealthApril2004 Vo1．20No．4 391
IR2 System测序仪进行基因序列测定。(2)基因序列分析：下 亚型AIDS患者的tat基因第一外显子58位点T取代A，2例
载 HIV序列库(http：／／hiv—web．1an1．gov)中各亚型 HIV一1 患者的CD4+T细胞数非常低。值得注意的是，本研究发现
共享序列，用BIOEDIT软件包中CLASTAL W 程序对下载序 了一些新的突变。AIDS患者的这些突变高于无症状 的 HIV
列及测得序列进行排列比对。以MEGA2软件包中distances 一 1感染者。目前样本尚少，无法进行深入分析，有待进一步
工具(Kimura”s two parameters method)计算毒株间基因离散 探讨这些位点的取代变异是否影响病毒的复制和疾病的进
率。以 phylogeny工 具邻 位相 连法 (neighbor—joining algo— 展。
rithm)生成系统进化树并用 bootstrap方法验证。 结果显示。B’亚型AIDS病患者基因离散率高= 无症状
2 结果 的 HIV一1感染者。提示随疾病进展，HIV一1 att基因第一外
2、1 HIV感染者与 AIDS患者 Tat蛋白序列比较 将由 env 显于可能发生更多的取代突变，某些位点的突变可能导致
和 gag区基因测序确定的 15例辽宁省 B’亚型 HIV一1感染 Tat调节病毒转录能力的增强，提高了病毒的复制能力。使病
者和 AIDS患者【5】的 HIV一1Tat蛋白序列与 B’亚型国际共 人进入 AIDS 期。
享序列(∞ NsENsUs—B’)比较发现：7位点出现N取代 R；
参考文献：
20位点出现 P取代T；24位点出现K取代N；58位点出现T
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取代A；59位点出现H取代P和64位点出现N取代T，AIDS gene of the human T—ee1]lymphotropic virus type III is required
患者的这些变异高于无症状感染者。1例进入 AIDS期的 ofr replication[J]．Cel。1986，4：941—947．
／C重 组 亚型。与 国 际 B’／C重 组 共 享序 列 (07一B’／ 【2] Coffin JM．HIV population dynamicsin vivo：Implicationf0r ge．
C、CN．)比较发现：58位点出现 T取代 A；62位点出现 R取 nefic variation，pathogenesis，and therapy[J]．Science．1995。267：
483—489．
代s。无症状感染组未发现此变异。
【3] Lorenzo．ERene，J Hemera，et a1．TheTatnadC2一V3 Envelope
2．2 HIV感染者与 AISD 患者 HIV—I的 tat基 因离散 率 Genes in the Molecular Epidemiology of Human Immunodeficiency
检测结果发现，辽宁省流行的不同 HIV一1毒株与相应 的国 Virus一1[J]．Virology，1997．221；310—317．
际共享序列 tat区基因离散率差别较大。其中 B’亚型的基因 【4] Pnatano S。Tyagi M，Giacca M．et a1．AJFRino acid modification in
the HIV 一1 Tat basic domain：insights form molecular dyn amics
离散率为(6．6±1．1)％，B’／C重组亚型的基因离散率为(4．1
and invivo functional studies[J]．J MolBiol，2002，318(5)；1331
±0．9)％，表明2种亚型传入当地时间较长。不同疾病进程 — 1339．
的基因离散率分别为 ：(B’亚型)AIDS患者为 7．2％±I．2％； 【5] 韩晓旭，尚红，姜拥军，等．辽宁省流行的人类免疫缺陷病毒1
(B’亚型)无症状感染者为 5．8％±I．0％；(B’C重组)AISD 基因亚型调查【j]．中华流行病学杂志，2001，22(6)：432—434．
【6] CaputoA，GrosiM，Bo~iniR，et a1．Inhibition ofHIV一1 repli—
患者为 3．I％±I．2％；(B’C重组)无症状感染者为 4．I％ ±
cation an d reactivation from latency by tat transdominant negative
0．9％。AIDS患者的 HIV一1B’亚型基因离散率 比较大．说
mutants inthe cysteine rich region[J]．Gene Ther，1996，3(3)：
明在 B’亚型 中．AIDS患者 比无症状感染者在 Tat区第一外 235—245．
显子发生了更多的取代变异。 【7] Han P，BrownR，Barsounl J，et a1．Trnasactivation of heterologous
3 讨论 promoters by HIV一1 tat CJ]．Nucleic Acids Rse，1991，19(25)：
7225—7229．
国外学者报告，Tat区第一外显子特定位置的氨基 酸变
【8] Balboni PG，Bozzini S，Marconi PC，et a1．Inhibition of human im．
异可以影响病毒的复制能力．其中22位点 G取代c．28位点 munodeficiency virus reactivation from latency by a tat transdomi—
R、Q取代K，41位点 A取代K．50位点 R、Q取代 K等基因 nant negative mutant[J]．j Med Virol，1993，41(4)：289—295．
突变会极大的降低病毒复制能力，而 58位点T取代A。65位 【9] BresV，KienanR，EmilianiS，et a1．Tat acetyl—receptorlysine are
impo rtna t for hum an immtmodeficiency virus type一 1 repilcaiton
D取代 H则会提高病毒的复制能力[6-93。对不同感染期病
【J J．B|0lChem。2002，277(25)：22215—22221．
例的基因序列分析发现，B’亚型的 HIV感染者 tat基因第一 【1O] Pantaho G，Menzo S，Vaccarezza M，et a1．Studies in subjcets with
外显子未出现 22，28，41，50位点的基因突变，而 AISD 患者 long—term nonprogressive human immunodeficiency vil'1．~ infec ．
却发生了58位点和 65位点的基因突变．提示此突变可能与 tionCJ]．N Engl J Med，1995，332：209—216．
疾病进展有关【m】。1例 B’亚型 AIDS患者和 I例 B’／C重组 收稿日期：2003．10．29 (孔繁学编辑 郭长胜校对)
《中华卫生监督与健康》杂志征文
<中华卫生监督与健康)杂志，2002年创刊，是华北卫生监督联会主办和河北省卫生厅卫生监督局承办的国际性 中文
版专业性学术期刊。定为月刊，96页，大 l6开本，每月 20 Et前出版。国际标准刊号 ISSN1727—3153．国内刊号 CN39—
7858 I{口 R；已入 5个国家级数据库。欢迎下列稿件：论著、综述”，论著摘要、专题研究、案例分析、卫生监督与管理、监测
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20307072
硕士学位论文
论文題目:HIvI整合碜的生物活性及蘖动力学分析
作者姓名
冯微宏
指导教帅金彪微授
学科(专业)
过物信息学
所在学院命魁学院
提交日期二O0年五月
浙汇大学願研究尘学位论文
HV1整合酶的表达和生物活性分析
硕士研究生冯微宏
导师
詹金彪教授
摘要
整合藤( integrase)是人类免疫缺陷病毒( baman immunodeficiency virus, HIV
基因编码的蛋白质,由前期融合蛋白Pr16ogag-pol经病藓自身编码的蛋白酶作
用形成的产物整合酶催化HV逆转录合成的双链cDNA整合至宿主DNA上
在H复制中起着关键的作用;由于正當宿主细胞没有憝合酶,因此整合轉是
HV病毒抻制剂的良好靶点。在整合反应过程中,合酶表现出四种活性
DNA结合、DNA3末端加工、末端转移(病毒DNA整合进宿主DNA)、去整
合。2在结合到双链平末端病毒DNA(供体DNA)后,整合酶切去3端二个
核苷酸GI,然后切割宿主DNA的5末端,并将病毒DNA整合进宿主DNA受
体DNA整合过程是可逆的,当整合DNA产物的类似物存在时,整合酶可将
原整合产物重新分解为病毒DNA和宿主DNA部分。晶体结构研究显示:整合
酶由三个结构域組成:1、N-末端结构域,包含一个锌指结构。2、中心区,包含
酶的催化中心。3、C末端结构域,非特异性结合DNA。因为以前普遍采用的方
法使用带有放射性标记的病毒DNA底物,和整合醇共育后,经过变性胶电泳以
及放射显影,显示整合酶反应的产物。但这种实验都有耗时较长及放射线污染
缺点。我们旨在建立一种快速简便安全的体外筛选HV1整合酶拘制剂的方
[方法
包含HV1整合酶基因的重组质粒的T7sTXW小在 Ecoli bl21DE3
包含体形式高效表达HV整合酶(N。所获包含体经过洗涤,稀释复性,并通
过镍柱纯化,获得高纯度及可溶的整合酶蛋白(N)。我们采用一种基于
biotin- Avidin elsa(BA- ELISA)的方法,测定分析整合酶的3端酶切活
及病毒DNA整合活性,并据此得到酶的动力学参数及整合酶的比活性,我钔还
分析了核糖体失活蛋白I型(RIPI) luftin-a对整合酶的抑制作用
浙江大学硕士研究生学位论文
结果
经过表达和复性纯化,我们得到了较纯的整合酶蛋白, SDS-PAGE电泳分析纯度
达到85%在整合酶实验中,我们表达和纯化的整合酶蛋白表现出较好的生物学
活性。整合酶抑制实验中, luffin-a具有较强的抑制整合酶的效应。经过测定和
算,我们得到如下结果:①纯化的整合酶的比活性为5492 units/mg。②整
酶反应的表观一级反应常数为00018×10/min③ Dluffin-a对整合酶的半数抑
制浓度为063±0.026N
重组的HV1型整合酶蛋白具有较高的病毒DNA3末端加工,病毒DNA整合活
性。本实验所果用的基于 BA-ELISA的筛选方法适合于大规模体外HV1整合酶
抑制剂的筛选以及对其抑制作用的动力学分析
[关键词]人类免疫缺陷I型病毒;整合;动力学;抑制剂;生物活性· 64· 中国国境卫生检疫杂志 2010 年 2 月第 33 卷第 1 期 Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2010,Vol 33,No.1
〔综述〕
HIV基因亚型检测方法研究进展
刘建礼 孙福军 朱 红
（北京国际旅行卫生保健中心，北京 100013）
摘要 艾滋病病毒（HIV）具有高度变异性，根据基因序列的同源性，HIV 被分为多个亚型，HIV 亚型检测对艾滋
病的预防与控制具有重要意义。 基于核酸分析的亚型检测方法近些年出现了快速发展，出现了异源双链核酸泳动实
验、限制性片度长度多态性分析、DNA 酶联免疫技术、基因芯片技术（DNA microassay）和多重 PCR 等多种亚型检测新
方法。
关键词 HIV；基因；亚型；检测方法
〔中图分类号〕 R512.91 〔文献标识码〕 A
Study Progress on HIV Subtype Detection Methods Liu Jianli, Sun Fujun, Zhu Hong. Beijing International Travel Healthcare
Centre,Beijing 100013,China.
[Abstract] HIV is a highly variable virus . Based on genetic similarities, the virus strains may be classified into types, groups and
subtypes. Surveillance of HIV-1 genetic subtypes and diversity play an important role in HIV prevention and control. With the rapid
progress of molecular biotechnology, many nucleic-acid-based detection method for HIV subtype was developed, such as heteroduplex
mobility assay(HMA) , restriction fragment long polymorphism (RFLP) , DNA enzymes immunoassay (DEIA), DNA microassay, multi-
primer PCR and so on.
[Key words] HIV；Gene; Subtype; Detection methods
艾滋病是由人获得性免疫缺陷病毒 (human im- 用基因测序仪进行测序， 获得病毒基因详细的核苷
munodeficiency virus，HIV)引起的。 HIV 病毒具有高 酸序列， 然后利用分子进化遗传分析软件进行系统
度的基因变异性， 根据血清学和基因序列的差异， 进化分析，并与标准的亚型进行比对，根据其在系统
HIV 分为 HIV-1 型和 HIV-2 型。 HIV-1 广泛分布于 树的进化关系确定病毒属于哪一亚型以及遗传距离
世界各地，是造成全世界 HIV 流行的主要病毒。 根据 远近。在此方法中，研究者用来分析的基因片段一般
HIV-1 基因组中的核苷酸和氨基酸序列的同源性， 是 env 区或者 gag、pol 区，用于系统分析的软件包括
HIV-1 被划分为 M、O、和 N 3 个组，其中 M 组有 A、 GCG，PHYLIP，PAUP，MEGA，TREECON 等。
B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 等 11 个亚型[1]。 各种不同亚 GSA 方法特异性好、准确率高，是目前确定 HIV 病
型发生重组又形成了很多流行重组型（circulating re- 毒亚型最公认方法，被认为是金标准。 其他研究方法得
combinant forms, CRF）。HIV 基因亚型与疾病的检测、 到的结果必须依据此方法的结果作为基准。 但 GSA 方
疫苗的研制、病毒的传播和致病性、病毒的生物学表 法检测周期较长，需要基因测序仪等高端仪器设备。 另
型、药物的敏感性都有密切的关系 [2]。 分离及鉴定感 外，基因序列的质量控制（序列如何剪裁和校正），获得
染人群中 HIV 的亚型，研究其基因变异、发展趋势及 序列的系统进化分析均对实验人员有很高的技术要求。
地理分布，是 HIV 分子流行病学研究的重要内容，可 因此，该方法仅在技术实力雄厚的实验室才能开展。
为艾滋病的预防、治疗、检测、监控提供科学的依据。
2 异源双链核酸泳动实验 （heteroduplex mobility
HIV 基因分型的实验方法可以分为血清学方法
assay , HMA）
和分子生物学方法， 其中血清学应用能够区分的亚
型有限，准确性较低，因此应用很少。 基于核酸分析 HMA 是指来源不同的 2 种或 2 种以上的核酸
的分子生物学方法近些年得到了快速发展。 分子同时存在于同一溶液中时， 其同源区域可借碱
基配对形成双链，同时，由于异源双链内存在不匹配
1 DNA 序列测定法（GSA）
区域，在链内局部形成突起或者泡（bubble），在非变
这种方法通过对病毒的基因序列进行扩增，利 性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其泳动速度变慢，双链同
中国国境卫生检疫杂志 2010 年 2 月第 33 卷第 1 期 Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2010,Vol 33,No.1 · 65·
源性越高，其泳动越快。 样品与某一亚型的标准质粒 标板上， 用病毒基因的扩增产物与探针进行杂交，产
形成的异源双链体的涌动速率最快， 则确定其与该 物与探针形成杂交双链， 然后用抗 DNA 双链单克隆
亚型同源性最近。 抗体来结合杂交双链， 然后通过酶标二抗进行显色，
其具体操作流程为： 提取病毒核酸， 利用 PCR 读取 OD 值，从而确定待测样品属于哪一亚型[6]。
或者 RT-PCR 扩增得到 evn 区或者 gag 区一段核酸 DEIA 方法中探针的设计最为关键，要求所设计
序列，同时将各亚型的标准质粒进行扩增，将病毒扩 的探针在不同亚型之间差别要足够大， 同时在同一
增产物和质粒扩增产物进行混合， 经变性和冷却复 亚型内要相对保守，并且所应用的所有探针的 Tm 值
性，形成异源双链产物，然后在 5%的非变性聚丙烯 要尽量接近，以保证杂交温度的一致性。 该方法的特
酰胺凝胶中电泳，电泳结束用 EB 染色，紫外灯下观 点是方便，快速，但是往往可以鉴别的亚型有限。 有
察， 如果样品与某一亚型的标准质粒混合物泳动最 时候可以采用逐步排除的多步杂交反应来进行多种
快，则可确定该样品为相应亚型[3]。 亚型的区分。 同时，可以根据所检测地区的亚型分布
HMA 是一种简单，快速、经济的亚型分析方法， 特点，有针对性的选择探针组合。
但是为了保证实验的稳定性、重复性和特异性，每次
5 基因芯片技术（DNA microassay）
实验应有严格的质量控制， 包括设立样品自身杂交
对照，同时 PAGE 条件要稳定，电泳装置、凝胶浓度、 基因芯片技术是 20 世纪 90 年代发展起来的新
缓冲液、电泳时间都要一致。 同时，电泳温度越高，异 技术，其主要原理是：在玻片等固相载体上以微点阵
源双链体的泳动速度越慢，因此，需要在冷水浴条件 的形式固定各种基因探针，组成二维分子排列，然后
下进行电泳。 与已标记的待测生物样品中靶分子杂交， 通过激光
共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描， 对每一个探
3 限 制 性 片 度 长 度 多 态 性 分 析 （restriction frag-
针上的荧光信号进行检测， 从而应用核酸杂交的原
ment long polymorphism,RFLP）
理来检测待检样品中的目的基因。 该方法具有操作
RFLP 是 20 世纪 80 年代中期发展起来的一种 简单，自动化程度高，高通量等特点，检测靶分子种
DNA 多态形分析技术，并随之与 PCR 技术的结合而得 类多、效率高、结果客观性强，目前在 HIV 相关检测
到突破性发展。 其原理是：选择适宜的限制性内切酶， 中正在得到广泛的开发和应用。 比如最早从事芯片
对病毒的基因序列进行酶切， 由于各亚型核苷酸序列 开发的美国 Affymertrix 开发了进行 HIV 病毒耐药性
不同，则有可能产生亚型特异性的酶切谱，通过电泳分 检测的芯片和试剂盒已经在市场上使用。
析， 根据酶切谱即可判断样品所属的亚型。 1995 年， 国内研究者对基因芯片进行 HIV 基因亚型的检
Danuta Pieniazek 等较早地将 RFLP 技术应用于 HIV- 测方法进行了探索， 第四军医大学的黎志东等将针
1 基因分型，利用 6 个限制性酶消化保守的 pol 基因中 对 HIV 膜区的探针制成 HIV 亚型分析基因芯片，可
编码整个病毒蛋白酶的基因片段， 鉴定了 HIV-1 的 5 以对 B、C、CRF01-AE 进行检测，所得结果与测序分
个基因亚型[4]。Harmelen 等选用 4 种内切酶，对病毒 gag 析的符合率达到 100%[7,8]。 浙江省医学科学院的倪崖
区 400bp 扩增片段和 600bp 扩增片段产物进行酶切， 等针对 HIV-1 不同亚型的 gag 区设计探针和引物，
通过酶切图谱可以区分 A~D4 种亚型[5]。 制 成 DNA macroarray 可 以 检 测 B、C、CRF01-AE 和
RFLP 分型技术结果可靠稳定，重复性好，很快 CRF07-BC 4 种亚型[9]。
得到了广泛应用。 但有时对于基因变异性较大的样 现在国内外有多家实验室与公司都在积极致力
本，扩增产物有不被限制酶消化切割的可能。 因此， 于 HIV 基因分型芯片的开发。 但是基因芯片是根据
RFLP 分 型 技 术 在 HIV-1 变 异 性 较 大 地 区 的 应 用 已有的数据信息制成， 对于 HIV-1 新出现基因变异
也受到一定程度限制。 但是该分型法成本低廉，实 信息无能为力， 而且该技术目前还存在仪器设备昂
验流程简单，耗时少，在 HIV-1 变异性不高的发展 贵，方法的标准化差，信号检测不完美等不足，一旦
中国家可以作为一项快速有效的亚型筛查方法。 这些问题得到解决， 该技术必将带来巨大的经济效
益与社会效益。
4 DNA 酶联免疫技术（DNA enzymes immunoas-
say, DEIA） 6 多重 PCR
该方法是将各亚型的特异性 DNA 探针固定在酶 以上提到的各种方法中， 都需要对待测样本进
· 66· 中国国境卫生检疫杂志 2010 年 2 月第 33 卷第 1 期 Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2010,Vol 33,No.1
行 PCR 扩增，然后再利用不同技术进行检测以区分
参 考 文 献
亚型。 有没有经过 PCR 扩增后直接利用产物进行亚
型鉴别的方法呢？ 在同一个 PCR 反应体系里，如果 [1] Robertson DL, Anderson JP, Bradac JA, et al.HIV-1 nomenclature
同时使用 2 对以上引物，则称为多重 PCR 或者复合 proposal[J]. Science,2000,288 (5463):55-6.
[2] 张一中,苏成豪,马桂林.HIV-1 基因亚型研究现状[J].海峡预防医
PCR。近年来，许多学者致力于研究用多重 PCR 进行
学,2005,11（4）:25-26.
HIV 亚型分析的方法。 国内的魏民等设计了针对 gag [3] 姚均,潘品良,邢辉,等.应用双链泳动分析法快速确定 HIV-1 基因
区的亚型特异性引物， 通过多重巢式 PCR 扩增后， 亚型[J].病毒学报,1999,15(4):296-304.
通过电泳观察扩增产物可以直接检测我国常见 B、 [4] Danuta Pieniazek,Luiz Mjanini,Artur Ramos, et al. HIV-1 patients
C、CRF0-AE、CRF07-BC 和 CRF08-BC 几种 HIV 亚 may harbor viruses of different phylogenetic subtypes : Implications
[10]。 Yagyu gp41 for the evolution of the HIV/AIDS pandemic[J]. Emerging Infectious型 日本学者 设计了针对 基因区域的
Diseases,1995,1(3):86-88.
亚型特异性引物进行扩增， 可以直接区别检测 A、 [5] Joanne van Harmelen , Elna van der Ryst, Robin Wood, et al.
B、C、D、F、G、CRF01-AE 共 7 种亚型[11]。 梁浩等则专 Restriction fragment length polymorphism analysis for rapid gag
门针对广西的 HIV 流行亚型设计了多套引物， 通过 subtype determination of human immunodeficiency virus Type 1 in
多 重 PCR 可 以 对 广 西 流 行 的 B/C 重 组 、C 和 South Africa[J]. Journal of Virological Methods,1999,78 (1-2):51-59.
CRF01-AE 进行鉴别[12]。 这说明，针对不同流行区的 [6] Plantier JC, Vergne L, Damond F. Development and evaluation of a
DNA enzyme immunoassay method for env genotyping of subtypes A
优势流行株设计具有针对性的多重 PCR 引物，从而 through G of human immunodeficiency virus type 1 group M, with
直接通过电泳进行亚型鉴别， 不失为一种简便易行 discrimination of the circulating recombinant forms CRF01-AE and
的方法。 CRF02-AG[J]. J Clinmicrobiol, 2002,（40）:1010-1022.
综上所述，分子生物学技术的迅速发展带动 HIV [7] 黎志东,徐志凯.HIV 亚型分析基因芯片的制备及应用[J].中国皮
了基因分型方法的不断改进和提高。 应当指出的是， 肤性病学杂志,2003,17(2):201-204.
[8] 黎志东,徐志凯.四种 HIV 分子流行病学分析方法的比较研究[J].
早期的 HIV 基因分型是以病毒基因的 env 区片段的
中国艾滋病性病,2004,10(1):1-3.
序列作为依据的，随着基因检测技术的发展， gag 区 [9] 倪崖,谭卓 ,房国坚，等 .HIV 流行毒株的 DNA macroarray 基因分
和 pol 区也逐渐被作为 HIV 基因分析的依据。 目前研 型技术的研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(1):12-13.
究的亚型分析的方法一般还是集中分析 env 区、gag [10] 魏民,梁浩,陈健平，等.使用多重巢式 PCR 对我国 HIV-1 主要流
区或者 pol 区的某一段基因片段，但是由于 HIV 病毒 行株亚型鉴定方法的建立[J].中华实验和临床病毒学杂志,2004,
18（1）:83-87.
不同亚型之间经常发生重组，因此，通过部分基因片
[11] Yagyu F, Okitsu S, Tanamoto K， et al. Determination of HIV-1
段分析得出的结论并不完全可靠。 因此，国际病毒分 subtypes (A-D, F, G,CRF01_AE) by PCR with novel designed
类委员会规定：检测中发现的新亚型或者新流行重组 primers[J]. J. Med. Virol. 2005,(76):16-23.
型必须进行全基因序列分析，才能确定其是否属于一 [12] 梁浩,罗皓,邵一鸣，等.广西 HIV-1 重组毒株 env 区快速基因分
个新的亚型。 型方法的建立[J].中华实验和临床病毒学杂志,2006,20(3):282-
284. 〔收稿日期：2010-01-12〕
（上接第 51 页）
[6] Gould, E. A., and Solomon, T.Pathogenic flaviviruses[J].Lancet,2008, future[J]. Expert Opin Biol Ther,2008, 8(11): 1787-1795.
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