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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
（第一课时）
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
(核心)
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
一、目的基因的筛选与获取
（一）目的基因
1.概念
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
2.作用
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。
3.实例
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
培育转基因抗虫棉用到的目的基因
Bt 抗虫蛋白基因
简称 Bt 基因
（二）筛选合适的目的基因
1.较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
01
目的基因的筛选与获取
3.实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
①通过构建基因文库来获取目的基因
②人工合成目的基因
③利用PCR特异性地快速扩增目的基因
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（三）获取目的基因的方法
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
一、目的基因的筛选与获取
（四）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量
扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
一、目的基因的筛选与获取
（四）利用PCR获取和扩增目的基因：
【重温】DNA复制的过程
解旋
合成子链
形成新DNA
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
（1）解旋
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
（2）合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
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G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸
为什么子链的延伸方向是5 ′→3 ′？
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链，只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
为什么子链合成需要引物？
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
（3）重新螺旋形成新的DNA分子
01
一、目的因的筛选与获取
问题:结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
引物
提供DNA复制的模板
断开氢键，打开DNA双链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用高温代替）
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
01
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA母链
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
四种脱氧核苷酸(dNTP)
1.基本条件:
一般添加Mg2+
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸长度通常为20~30个核苷酸
模板、原料、能量、酶、引物、
缓冲溶液、不同温度
一、目的基因的筛选与获取
（四）利用PCR获取和扩增目的基因：
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
2.PCR反应过程
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
90
50
72
℃
变性
3`
5`
5`
3`
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
复性
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
延伸
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
变性
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
复性
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
延伸
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
变性
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
复性
2.PCR反应过程
90
50
72
℃
延伸
2.PCR反应过程
3.PCR的结果：
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
4.PCR产物的鉴定：
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
一、目的基因的筛选与获取
（四）利用PCR获取和扩增目的基因：
PCR中的数量关系
扩增次数 1 2 3 n
DNA片段数 2 4 8 2n
含引物的DNA片段数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA片段数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA片段数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA片段数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
PCR技术与DNA复制过程比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 （1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　）
（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　）
（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　）
（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
问题：获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
二、基因表达载体的构建
人们所需要的基因
作用：
便于重组DNA分子的筛选
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊的DNA片段）
终止转录
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
基因工程的核心
1.目的：
2.组成：
问题:目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
位于基因上
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
(本身不转录)
决定氨基酸
不决定氨基酸
对比 启动子 起始密码子 终止子 终止密码子
所在位置 DNA mRNA DNA mRNA
作用 RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。 翻译的起始点 AUG(甲硫氨酸） GUG（缬氨酸） 转录的终点 翻译的终点
（UAA、UGA、UAG)
问题: 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。
3.构建过程：
质粒
限制酶
限制酶切割位点
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
3.构建过程：
DNA
连接酶
重组
DNA分子
获取目的基因
质粒
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
3.构建过程：
质粒
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
重组
DNA分子
限制酶切割位点
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
思考：使用一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
3.构建过程：
1、单酶切（同一种酶）：
（1）目的（结果）：
产生相同的黏性末端
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
①目的基因——载体连接物
②载体——载体连接物（弊端）
③目的基因——目的基因连接物（弊端）
②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点一：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
①载体——载体连接物
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
DNA连接酶
连接
缺点二：
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
②目的基因——目的基因连接物
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
缺点三：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
③目的基因——载体连接物
双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
3.构建过程：
问题: 怎么改进解决以上问题？
二、基因表达载体的构建
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
请结合下图，回答问题：
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
思考
二、基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
思考
（2）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
课堂小结

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