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(共80张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
普通棉花
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
转基因抗虫棉培育过程
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
（核心）
基因工程的基本操作程序
1. 目的基因的筛选与获取
2. 基因表达载体的构建
3. 将目的基因导入受体细胞
4. 目的基因的检测与鉴定
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
（2）根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
1. 目的基因
（1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
（3）实例：苏云金杆菌可以分泌一种苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），对鳞翅目昆虫有很强的杀伤作用。科学家通过实验将编码该蛋白质的Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
1. 目的基因
Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因）是培育转基因抗虫棉的目的基因。
一
第一步：目的基因的筛选与获取
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
知识拓展：基因
不是
基因1 基因2 基因3
知识拓展：基因的结构
DNA片段
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段；
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
启动子
1. 编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。
2. 非编码区 ：
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
不转录，不编码蛋白质；
知识拓展：基因的结构
终止子
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
本质：
位置：
作用：
原核细胞的基因结构
知识拓展：基因的结构
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。
知识拓展：基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪接
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达
知识拓展：基因的结构
真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某原核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某真核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
初始mRNA
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不能编码蛋白质的序列
= 非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
= 非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
知识拓展：基因的结构
知识归纳：基因结构
编码区：
非编码区：
原核基因
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，不能编码蛋白质的DNA序列，
然后在翻译前就被剪切掉
能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
①实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
（1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2. 筛选合适的目的基因
功能清晰
已知结构
相关信息
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
测序技术
序列数据库
序列比对工具
基因测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
2. 筛选合适的目的基因
（2）认识基因结构和功能的技术方法
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。
序列数据库是分子生物信息数据库中最基本的数据库，包括核酸和蛋白质两类，以核苷酸碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容，并附有注释信息。
序列数据库
序列数据库（如GenBank）
NCBI美国国家生物信息中心
序列比对工具（如BLAST）
序列比对工具
BLAST全称Basic Local Alignment Search Tool，即“基于局部比对算法的搜索工具”，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。
3. 目的基因的获取方法
明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
（1）人工合成目的基因：目的基因较小且全部序列已知。
①在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。
DNA合成仪
3. 目的基因的获取方法
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（主要指cDNA文库）
基因文库
基因组文库
部分基因文库
3. 目的基因的获取方法
基因文库包括基因组文库和部分基因文库。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。
如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
一
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
①基因组文库
一
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
①基因组文库
一
受体菌
每个受体菌都含有了一段不同的 。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
该受体菌群为基因组文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
DNA片段
①基因组文库
②cDNA文库
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的 。
某种生物体内的全部DNA
某个时期
基因选择性表达
转录
转录
转录
转录
mRNA
翻译
翻译
翻译
翻译
蛋白质
反转录
cDNA文库
包含某种生物 基因
部分
cDNA文库：如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
②cDNA文库
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
②cDNA文库
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
反转录
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC
CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG ……
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……
cDNA
复制
双链DNA
受体菌
无启动子、终止子等非编码区
②cDNA文库
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
②cDNA文库
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
反转录
GT …… ATCCTAGGTCTAC
GT …… ATCCTAGGTCTAC
CA …… TAGGATCCAGATG
复制
受体菌
无启动子、终止子等非编码区及无内含子
②cDNA文库
cDNA
双链DNA
部分基因文库和基因组文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（非编码区）
基因中内含子
基因多少
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
3. 目的基因获取方法
使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子）
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
3. 目的基因获取方法
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
这是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。
3. 目的基因获取方法
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
①建立基因组文库：包含某种生物全部基因
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
基因组文库
导入受体菌
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
②建立cDNA基因文库：只包含某种生物部分基因
某种生物的成熟mRNA
与mRNA互补的单链DNA
逆转录酶
双链DNA片段
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
cDNA：经逆转录后与RNA互补的DNA
（2）通过构建基因文库来获取目的基因
基因文库
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
基因组文库
部分基因文库
3. 目的基因获取方法
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
PCR基因扩增仪
PCR技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
先对目的基因进行扩增
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
思考：获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR技术：
PCR是 的缩写，它是一项根据 的原理，在体外提供 的各种组分与反应条件，对目的基因的 进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
核苷酸序列
①原理：
②操作环境：
③目的：
④优点：
DNA半保留复制
体外复制（PCR扩增仪 / PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
模拟体内DNA复制过程
【重温】DNA体内复制的过程及条件
DNA聚合酶
DNA解旋酶
复制分叉
子链
DNA模板链
DNA聚合酶
DNA模板链
子链
DNA
（1）解旋：利用能量，在解旋酶作用下，氢键断裂，DNA双螺旋的两条链解开。
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
【重温】DNA体内复制的过程
（2）合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
DNA聚合酶
注：氢键形成不需酶，磷酸二酯键形成需DNA聚合酶
【重温】DNA体内复制的过程
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
【重温】DNA体内复制的过程
（3）重新螺旋：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
解旋酶（氢键断裂）
DNA聚合酶（形成磷酸二酯键）
氢键的形成是自发的，不需要能量和酶
（1）模板：亲代DNA的两条链
（2）原料：4种游离的脱氧核苷酸
（3）能量：ATP
（4）酶：
【重温】DNA体内复制的条件
（2）PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
体外用高温代替解旋酶 打开DNA双链
2条DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
2种引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始
连接脱氧核苷酸
一定的缓冲液（Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要
Mg2＋激活
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
耐高温的DNA聚合酶
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献（P86）
Ⅰ. 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
①引物
（2）PCR技术所需的基本条件
引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
Ⅱ. DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
①引物
Ⅲ. 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。
3’
5’
3’
5’
①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。
（3）PCR的过程
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
注意：不需要解旋酶
3’
5’
3’
5’
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
（3）PCR的过程
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
注意：引物结合在模板链 端，引导子链从 方向复制。
3'
5'端→3'端
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
（3）PCR的过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
注意：复性和延伸都是从子链 方向进行。
5'端→3'端
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
（3）PCR的过程
第一轮循环的产物
第二轮循环的产物
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。
第二轮循环的产物
第三轮的产物
（3）PCR的过程
第二轮循环的产物
第三轮的产物
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
（3）PCR的过程
（4）PCR的结果
①由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成 形式扩增。
指数
2n
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
②经过n次扩增循环后，目的基因数为 ，需要引物数量为 。
2n+1-2
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
第一轮循环
基因数=
2=21
引物数=
2=22-2
基因数=
4=22
引物数=
6=23-2
第二轮循环
第三轮循环
基因数=
8=23
引物数=
14=24-2
n次循环后，目的基因数为2n，需要引物数为2n+1-2。
思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？
第三次循环
3’
5’
目的基因
5’
3’
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
目的基因
目的基因
（4）PCR的结果
③利用PCR技术扩增目的基因，在第三次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）。
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
第
三次
循
环
3’
5’
目的基因
目的基因
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
在第三次循环产物中开始出现完整的目的基因
1. 引物在PCR中能重复利用吗？
不能
2. 用PCR可以扩增mRNA吗？（P79旁栏思考）
应先将RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增。
思考 · 讨论
PCR不能直接扩增RNA
注意：PCR不能直接扩增mRNA，需逆转录成cDNA再进行扩增。
（逆转录PCR，简称RT-PCR ）。
cDNA：以mRNA为模板，合成的与其互补的单链DNA。
5'
3'
5'
3'
单链RNA
DNA-RNA杂交分子
单链DNA
双链DNA
逆转录酶
核酸酶H
降解RNA链
DNA聚合酶
由mRNA逆转录形成cDNA的过程：
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子。
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA。
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
mRNA需逆转录成cDNA再进行PCR扩增
（5）仪器：PCR过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成。
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
（6）PCR扩增产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
PCR技术与体内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
酶
温度
结果
联系
解旋酶催化
主要在细胞核内
解旋酶、DNA聚合酶等
细胞内温和条件
合成整个DNA分子
①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板
②原料：均为四种脱氧核苷酸
③酶：均需DNA聚合酶
④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
DNA在高温下变性解旋
细胞外（主要在PCR扩增仪内）
耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量
脱氧核苷三磷酸
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，无需添加ATP
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
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