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第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
四、目的基因的检测与鉴定
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
害虫死亡
抗虫棉
思考：
只有一部分Bt基因能成功导入棉花细胞并表达Bt抗虫蛋白，这需要检测和鉴定才能知道，如何进行检测和鉴定呢
思考：
培育转基因抗虫棉的最终目的就是要赋予棉花抗虫特性，怎样检测棉花是否具有抗虫特性呢
1. 分子水平的检测
（1）通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
（2）通过抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质。
四、目的基因的检测与鉴定
（2）特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
（3）核酸杂交：互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
（1）定义：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
【拓展】基因探针
1. 分子水平的检测
（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
PCR技术
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
转基因生物DNA
1. 分子水平的检测
（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
转基因生物DNA
探针
15N
变性
变性
15N
DNA分子杂交
碱基互补配对原则
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
基本思路：
制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
1. 分子水平的检测
PCR技术
转基因生物
PCR操作
双链cDNA
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
1. 分子水平的检测
双链cDNA
探针
15N
变性
变性
15N
DNA分子杂交
碱基互补配对原则
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取
抗原
抗体
杂交
——通过抗原-抗体杂交检测
1. 分子水平的检测
Bt抗虫蛋白
2. 个体生物学水平的鉴定
（1）通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等
四、目的基因的检测与鉴定
例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
延伸：筛选含目的基因的受体细胞（以大肠杆菌为例）
（2）受体细胞可能有：
①含目的基因的细菌——无抗性
②含目的基因—目的基因的细菌——无抗性
③含质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性
④含质粒—质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性
⑤含重组质粒的细菌——有氨苄青霉素抗性
延伸：筛选含目的基因的受体细胞
（3）筛选方法：
①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落；
②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
延伸：筛选含目的基因的受体细胞（以大肠杆菌为例）
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1. 实验原理
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
（2）电泳鉴定PCR产物的原理
1. 实验原理
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
①电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。
②鉴定方法：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（2）电泳鉴定PCR产物的原理
1. 实验原理
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。
②鉴定方法：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（2）电泳鉴定PCR产物的原理
琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
（2）电泳鉴定PCR产物的原理
1. 实验原理
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
琼脂糖凝胶浓度（%） 分离DNA分子大小（Kb） 迁移速率
0.6 1～20 慢
快
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.4～6
1.5 0.2～4
2.0 0.1～3
琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快
DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度关系
DNA所具有的构象可根据DNA序列、螺旋的程度与方向、碱基上的化学修饰等划分。自然界中常见的有A-DNA、B-DNA与Z-DNA。B型为细胞中最常见的类型。
DNA分子越大，迁移越慢；构象不同，迁移速度不同。
DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象关系
核酸染色剂
常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。
1. 实验原理
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
观察DNA条带的分布、粗细、荧光强度初步鉴定扩增效果，还可以通过计算DNA含量鉴定效果。
2. 材料用具
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
2. 材料用具
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
2. 材料用具
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
（6）4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。相关试剂的配方参见附录3（P117）。
2. 材料用具
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL
总体积 50μL
（7）PCR反应体系的配方
2. 材料用具
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
3. 方法步骤
（1）DNA片段的扩增
①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
3. 方法步骤
（1）DNA片段的扩增
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min — —
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
3. 方法步骤
（1）DNA片段的扩增
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min — —
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
PCR仪的循环程序
使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。
思考：预变性的目的是什么？
思考：为什么最后1次变性时间延长？
Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
3. 方法步骤
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
②制备凝胶
Ⅰ. 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
（2）DNA片段的电泳鉴定
3. 方法步骤
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
梳子孔为加样孔
②制备凝胶
Ⅲ. 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
Ⅱ. 待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
（2）DNA片段的电泳鉴定
3. 方法步骤
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
③加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
（2）DNA片段的电泳鉴定
3. 方法步骤
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
电泳指示剂作用
①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向；
②使样品呈现颜色，便于加样。
标准参照物（Marker）
DNA Marker是已知的DNA分子大小的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。
④电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
（2）DNA片段的电泳鉴定
3. 方法步骤
⑤观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
（2）DNA片段的电泳鉴定
3. 方法步骤
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
4. 注意
1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该图示片段大小约为750bp。
结果分析与评价
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
如果扩增不成功（没有条带），可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2. 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
结果分析与评价
五、探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
√
×
×
练习与应用
一、概念检测
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
练习与应用
二、拓展应用
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因（β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
本节结束！

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