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第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时
第3章 基因工程
干扰素在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病及多种癌症，传统方法生产干扰素的产量极低。1993年，我国批准生产由侯云德院士研究和开发的药物重组人干扰素α-1b，它是我国第一个具有自主知识产权的基因工程药物，通过转基因的大肠杆菌来生产，产量得到大幅度的提高。
任务1：请同学们尝试设计通过基因工程生产人干扰素的方案
与载体拼接
大肠杆菌
干扰素
导入
干扰素基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
第一步：目的基因的筛选与获取
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
表达产物等的基因。
(2)实例：
与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因
1、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
第一步：目的基因的筛选与获取
2.目的基因的筛选
（1）较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
测序技术
序列数据库
序列比对工具
第一步：目的基因的筛选与获取
3. 利用PCR技术获取和扩增目的基因
干扰素基因
快速获得大量干扰素基因
？
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
第一步：目的基因的筛选与获取
含目的基因的DNA母链
高温
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
一般为短的单链DNA（两种）
PCR反应的基本条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
DNA母链
解旋酶催化
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
一般为短的单链RNA
第一步：目的基因的筛选与获取
PCR反应的基本过程
变性 复性 延伸
当温度超过_____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
1. 变性：
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是固定的温度？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
第一步：目的基因的筛选与获取
PCR反应的基本过程
变性 复性 延伸
当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。
碱基互补配对
思考：引物结合在模板链的什么位置？
引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
2. 复性：
50℃
两
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
第一步：目的基因的筛选与获取
PCR反应的基本过程
变性 复性 延伸
当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_____
__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
思考：耐高温的DNA聚合酶结合在引物的3’还是5’端？
结合在引物的3’端
3. 延伸：
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
任务2：构建模型，模拟PCR获取和扩增目的基因的过程
材料：扭扭棒，透明胶，剪刀
提示：1、DNA分子两条链反向平行
2、引物是一段短单链核酸，可以定位目的基因的3′端
3、DNA子链延伸的方向是从5′端到3′端
4、新合成的子链可以用与母链不同颜色的扭扭棒表示
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
第一步：目的基因的筛选与获取
第二步：基因表达载体的构建（核心工作）
确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
1、目的：
2、基因表达载体的组成
思考：若要干扰素基因在大肠杆菌中稳定存在，并能够表达和发挥作用，
载体还需要哪些结构？
思考：要各个元件有什么作用？
第二步：基因表达载体的构建
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
任务3：尝试构建基因表达载体的物理模型
若使用一种限制酶（单酶切）同时切割干扰素基因和质粒，产物共有 几种连接情况？（剪刀模拟限制酶，透明胶带模拟DNA连接酶）
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
任务3：尝试构建基因表达载体的物理模型
任务3：尝试构建基因表达载体的物理模型
问题探讨
选择两种不同的限制酶（双酶切）同时对目的基因和质粒切割
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
EcoRⅠ和BamHⅠ
第二步：基因表达载体的构建
归纳总结
选择限制酶的原则
a、不能破坏目的基因
b、不能破坏所有的标记基因、启动子、终止子和复制原点
c、切割后目的基因和质粒有相同的黏性末端
（最好采用双酶切：避免自身环化和反向连接）
1. 下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．该技术应用体内DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
B．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
A
随堂练习
D
随堂练习
2. 图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
随堂练习
3．干扰素在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病及多种癌症，传统生产干扰素的方法是从人体的白细胞内提取，产量极低。1993年，我国批准生产由侯云德院士研究和开发的药物重组人干扰素α-1b，它是我国第一个具有自主知识产权的基因工程药物，通过转基因的大肠杆菌来生产，产量得到大幅度的提高。回答下列问题：
(1)从中国人体脐带血白细胞中提取干扰素基因的mRNA，通过 的方法合成目的基因，再通过PCR技术扩增。扩增时，引物与模板链的 端碱基互补配对。
(2)若将重组人干扰素α-1b基因直接导入大肠杆菌细胞，一般不能得到重组干扰素α-1b，原因是 。因此，需将重组人干扰素α-1b基因、 和标记基因构建成基因表达载体导入大肠杆菌。
(3)筛选出具有重组干扰素α-1b基因的大肠杆菌应使用 培养基，可采用 法获得纯培养物。
平板划线法（稀释涂布平板法）
逆转录
3’
干扰素α-1b基因在大肠杆菌中不能稳定存在和复制，也不能表达和发挥作用
启动子、终止子（复制原点）
选择
感谢聆听！
第一步：目的基因的筛选与获取
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；
PCR一般以DNA单链为引物。
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。
子链合成为什么需要引物？

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