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动物细胞工程的技术手段
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
生产单克隆抗体
——是其他动物细胞工程技术的基础
第2节 动物细胞工程
2.2.1 动物细胞培养
从社会中来
皮肤烧伤
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
通过动物细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
借助动物细胞培养构建人造皮肤
动物细胞培养
概念：
就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养条件下，让这些细胞 。
原理：
细胞增殖
未体现出细胞的全能性
生长和增殖
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
那么，动物细胞培养需要哪些条件呢？
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
1.动物细胞培养的条件
（1）营养
合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。
使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。血清中含有人类尚未全部研究清楚、细胞生长和增殖所必需的物质
注意：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
（2）无菌、无毒的环境
无菌
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液
无毒
定期更换培养液的目的是什么？
如何防止培养过程中的微生物污染？
离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力
（3）温度、PH和渗透压
温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)
pH为7.2～7.4(多数动物细胞)
（4）气体环境
通常采用培养皿或松盖培养瓶。并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
O2：细胞代谢所必需的。
CO2：主要作用是维持培养液的pH。
渗透压：维持细胞正常的形态和功能
培养皿
培养瓶
无菌、无毒
的环境
营养
观察 “细胞房”体外培养细胞的图片
适宜的温度和PH、气体环境等
2.动物细胞培养的过程
从动物体内取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和繁殖。因此，在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用 等处理一段时间，将组织分散成 。然后，用培养液将细胞制成 ，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
单个细胞
胰蛋白酶、胶原蛋白酶
细胞悬液
悬浮型细胞：
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
贴附型细胞:
体外培养的动物细胞类型
悬浮在培养液中生长增殖（少部分细胞）
需贴附于某些基质表面才能增殖生长（多数细胞）
细胞贴壁
细胞贴壁现象
悬浮型细胞：
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
贴附型细胞:
除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
体外培养的动物细胞类型
悬浮在培养液中生长增殖（少部分细胞）
需贴附于某些基质表面才能增殖生长（多数细胞）
细胞贴壁
癌细胞无接触抑制
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖，导致细胞发生堆积，多层生长。
思考：如何解决细胞分裂受阻的问题呢？
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖
人们通常将分瓶培养之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为 。
将分瓶后的细胞培养称为 。
原代培养：
原代培养
传代培养
传代培养：
思考：进行传代培养时，如何处理悬浮细胞和贴壁细胞？
①悬浮型细胞：
直接用离心法收集
②贴附型细胞：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
①取动物组织
②制成细胞悬液
用胰蛋白酶分散细胞，可说明细胞间物质主要成分？
胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
选材
动物胚胎或幼龄动物的组织
原因：细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，易培养
消化：用胰蛋白酶(胶原蛋白酶)处理分散成单个细胞
①取动物组织
②制成细胞悬液
③转入培养液进行原代培养
④放入CO2培养箱
贴壁生长示意图
接触抑制示意图
①取动物组织
②制成细胞悬液
③转入培养液进行原代培养
④放入CO2培养箱
⑤分瓶，传代培养转入CO2培养箱
思考：细胞可以一直进行传代培养吗？
原代培养
单细胞悬液
传代培养
消化
稀释分瓶
一般能传至10代，保持正常的二倍体核型
少数能传至50代，部分细胞核型发生变化
极少数能传代超过50代，发生突变，无限分裂，类似癌细胞
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
用机械的方法， 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖（悬浮生长）
一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（贴壁生长）
细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液营养物质缺乏等分裂受阻
接触抑制
CO2培养箱中
传代培养：将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再用离心法收集
大多数细胞
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
完整植株
动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
获得大量细胞
快速繁殖等
植物激素
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
动物细胞培养与植物细胞培养比较
3.干细胞培养及其应用
受精卵
原始胚胎干细胞
囊胚
胎儿
成人
胚胎干细胞
成体干细胞
分布：
分类：
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
概念：
胚胎干细胞（ES细胞）
存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
胚胎干细胞（ES细胞）
实例
局限性
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；限制了在医学上应用。
在目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞
需要分化诱导因子诱导
实例
运用实例
分布
特点
② 成体干细胞
骨髓造血干细胞发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
①造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
②神经干细胞（神经系统中）
③精原干细胞（睾丸中）
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞→
神经干细胞→
2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。2007年，科学家用类似的方法，诱导出了人的iPS细胞。
诱导多能干细胞的概念
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
资料：
各种类型细胞
导入特定基因
导入特定蛋白
小分子化合物
成纤维细胞
T细胞
B细胞
iPS细胞
分化
移植
病人
取出
a.可治疗镰状细胞贫血症
b.治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域研究取得了新进展
成果
a.诱导过程无须破坏胚胎
b.iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
优点
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
本节小结

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