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微生物的选择培养和计数
本节聚焦
怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？
如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？
测定微生物数量的常用方法有哪些？
微生物的选择培养和计数
单元主题
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
——分离
——计数
背景资料
【资料1】尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。
尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
【资料2】绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
思考1：
如果让你配制一种培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
思考1：如果让你配制一种培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
培养基添加尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长、发育、繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
思考2：该培养基与普通培养基有哪些异同？
思考2：该培养基与普通培养基有哪些异同？
除尿素作为唯一氮源，其余均相同
概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
选择培养基（selective medium）
思考3：选择培养基运用了什么原理？
生物与环境相适应
思考4：逆转录-聚合酶链式反应，即RT-PCR技术，是检测新冠病毒（2019-nCoV）核酸最为主流的方法，该过程中需要用到耐高温的DNA聚合酶，尝试运用上述原理思考，如何寻找耐高温的酶？
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境
（热泉、火山口）
寻找
寻找
科学实例
1973年，科学家布鲁克在美国黄石国家公园的热泉中发现了耐热的水生栖热菌（Thermus aquaticus)，并从这种菌种中提取出耐高温的DNA聚合酶。
启示：
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
思考5：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
单元主题
选择培养基？
对土样进行适当的处理
科学的测定微生物数量的方法
稀释涂布平板法
稀释
概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
主要过程:
A.梯度稀释菌液 B.涂布平板
当样品稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌
原理:
学习任务一 根据选择培养基、稀释涂布平板法的相关内容，以实验小组为单位，围绕单元主题“1g土壤中有多少能分解尿素的细菌”，进行实验设计。
学习任务二 观看“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”虚拟仿真实验视频，小组合作思考讨论完成下列问题：
（1）如何确保本实验的准确性（有哪些注意事项）？（2）经稀释涂布平板法统计的菌落数是否为实际数目？（3）还有其他测量微生物数量的方法吗？（4）实验结果中的单菌落周围为何有红色区域？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验名称
实验目的
实验原理
实验材料
利用选择培养基从土壤中分离能分解尿素的细菌并计数
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
实验用具
实验试剂
微生物的数量测定
计算公式:
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
稀释涂布平板法
此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是290、282、270，涂布平板时均使用0.1ml菌液，如何计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（290+282+270）/3
0.1
× 105 ≈2.8 ×108个
1. 如何确保“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验的准确？
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
分析实验结果时，要考虑平行组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验；
本次实验平板和试管较多，使用前需做好标记，如组别、培养日期和样品稀释度等信息；
问题探究
设置牛肉膏蛋白胨培养基以判断选择培养基是否有选择作用；2个空白对照组（未接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基）检测培养基是否含有杂菌。
恰当的稀释度、涂布是否均匀
是成功统计菌落数目的关键。
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
2. 经稀释涂布平板法统计的菌落数是否为实际数目？
问题探究
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
血细胞计数板
（图片来源：作者拍摄）
3. 除稀释涂布平板法外，还有其他测定微生物数量的方法吗？
稀释涂布平板法
显微镜直接计数法
细菌计数板
血细胞计数板
——间接计数法
——直接计数法
问题探究
统计结果一般偏大：
是活菌和死菌数的总和
4. 实验中，为何观察的单菌落周围有红色区域？
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
问题探究
方法：
在培养基中加入酚红指示剂
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，
遇酚红指示剂呈 红 色
——鉴别培养基
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