资源简介

(共88张PPT)
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
问题探讨
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
（核心工作）
第2节 基因工程的基本操作程序
1
基因表达载体的构建
2
目的基因的筛选与获取
3
将目的基因导入受体细胞
4
目的基因的检测与鉴定
四个步骤：
基因表达载体的构建（核心）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
基因工程的基本操作程序
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
第2节 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（1）概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相
关的基因。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
一
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
思考：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
2.筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
越来越多基因的功能和结构被分析。
一
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
实例：
利用PCR技术获取和扩增（重点）
cDNA文库
直接获取
人工合成
基因文库（P82了解）
（化学合成法）：根据测序技术或从GenBank等序列数据库中掌握了目的基因的序列后，用DNA合成仪进行人工合成
基因组文库
从生物体内用限制酶直接得到
获取目的基因的具体方法
3.目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
（1）从基因文库中直接获取
3.目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
目的基因的筛选与获取
一
提取基因组DNA
DNA片段
重组载体
基因组文库
限制酶
与载体连接
导入受体菌
提取特定组织或发育时期的mRNA
单链DNA
重组载体
cDNA文库
双链cDNA
导入受体菌
与载体连接
DNA聚合酶
逆转录酶
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
cDNA文库中的基因不含以上结构
3.目的基因的获取
（ 2 ）人工合成
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
3.目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3.目的基因的获取
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR技术：PCR是______________ 的缩写，是一项根据______ _____
的原理，在___ _提供参与DNA复制的___ ____与__ ____，对
_________________ _进行______ __的技术；
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
原理
操作环境
目的
优点
（3）利用PCR扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
PCR扩增仪
温故知新：回顾DNA的复制过程
体内DNA复制过程
解旋酶
DNA聚合酶
体内DNA复制需要模板、原料、引物、酶、能量等
引物
目的基因的筛选与获取
一
DNA复制的方向
引物
DNA母链
DNA的复制方向总是从子链的5’端向3’端延伸
引物从模板链3’端结合
① DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
目的基因的筛选与获取
一
（3）利用PCR扩增目的基因
DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反相平行的，所以需要两种引物。
复制原则:碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
引物①设计引物的依据是：
_______________________
②引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：
________________________________________
③使用的一对引物的序列相同吗？
_________________________________________
④引物设计的要求（或引物失效的原因）
a._______________________________________
b._______________________________________
⑤每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因
______________________________
⑥两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因
_____________________________________
⑦两种引物都结合在DNA模板链的_____端
脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸
目的基因两端的核苷酸序列
为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点
不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列
*两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增
3’
防止引物自身环化
防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合
3’
每种引物内部不能发生局部碱基互补配对
两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
目的基因的筛选与获取
一
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
② 基本过程
变性 复性 延伸
① 基本条件:
（3）利用PCR扩增目的基因
控制温度
能量:热能，dNTP水解释放的能量
③检测方法
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。
(90℃以上）
(50℃左右）
(72℃左右）
（含目的基因）
dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核
糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP
是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧
核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
B.复性
50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
C.延伸
72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
目的基因的筛选与获取
一
② 基本过程
（3）利用PCR扩增目的基因
碱基互补配对原则
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
目的基因的筛选与获取
一
② 基本过程
（3）利用PCR扩增目的基因
PCR小结
目的基因的筛选与获取
一
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
(1)过程：
（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。　　　　
指数
2n
2n＋1－2
(2)DNA复制方向： 。
5’端→ 3’端
观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：
为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那么几轮循环后会出现只有目的基因片段（等长）的DNA分子？
目的基因的筛选与获取
一
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
③ 相关计算
观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：
为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那么几轮循环后会出现只有目的基因片段（等长）的DNA分子？
三轮
目的基因的筛选与获取
一
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
③ 相关计算
思维拓展
复制次数 DNA分子总数
0 1
1
2
3
n
21=2
22=4
23=8
2n
１)复制n次后DNA总数:
2n
2）含母链的DNA占总数的比例：
2
2ｎ
1
2ｎ-1
=
3）只含子链的DNA占总数的比例：
亲代DNA
（2条链）
无论DNA复制多少次，含母链的DNA数永远是2
第1次复制
第2次复制
第3次复制
2ｎ -2
2ｎ
思维拓展
复制次数 脱氧核苷酸链总数
0 2
1
2
3
n
2×21=4
2×22=8
2×23=16
2×2n=2n+1
１)复制n次后脱氧核苷酸链总数:
2）新合成的脱氧核苷酸链数：
2n+1
一个DNA分子中含有2条脱氧核苷酸链
亲代DNA
（2条链）
第1次复制
第2次复制
第3次复制
2n+1-2
②1个目的基因进行PCR扩增,循环n次，得到多少个目的基因？含引物的DNA分子有多少个？
①1个DNA分子进行PCR扩增,循环n次，理论上至少需要多少个引物？
2n
思维拓展
复制n次，需要的引物数=新合成的脱氧核苷酸链数
找一找：复制n次，含有引物的脱氧核苷酸链有多少？
2n+1-2
2n+1-2
思维拓展
一个DNA分子复制n次，则消耗的脱氧核苷酸数
若亲代DNA分子含有胞嘧啶脱氧核苷酸m个，经过n次复制需要消耗胞嘧啶脱氧核苷酸数:
m（2n-1）
第n次复制需胞嘧啶脱氧核苷酸数:
m.2n-1
亲代DNA
（2条链）
第1次复制
第2次复制
第3次复制
总的DNA数 X m-亲代DNA的m（原本就有的）
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶、引物
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
DNA在高温下变性解旋
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
PCR与DNA复制过程比较
目的基因的筛选与获取
一
（3）利用PCR扩增目的基因
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3'端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 高温解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
补充2.PCR技术与细胞内DNA复制的比较
目的基因的筛选与获取
一
1.下列有关体内DNA复制与PCR比较的叙述，正确的是
A.二者合成子链的方向相同，均从5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制不需要引物，PCR反应需要引物
D.二者遵循的碱基互补配对方式相同，且均需要ATP提供能量
√
学以致用 · 链接典例拓展
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
B.复性
50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
C.延伸
72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
目的基因的筛选与获取
一
② 基本过程
（3）利用PCR扩增目的基因
碱基互补配对原则
思维拓展
新合成的脱氧核苷酸链上都有引物，即每个DNA都有引物
找一找：
①复制n次，含有引物的脱氧核苷酸链有多少？
②复制n次，含有引物的DNA有多少？
2n
2n+1-2
大本78 题 2
小本141 题 13
c
d
小本141 题 13
c
d
e
f
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
实验原理
（1）DNA 片段的扩增
①利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。
② PCR 利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。
③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA 片段的电泳鉴定
① DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。
加样孔
电源
琼脂糖凝胶电泳
DNA片段的电泳鉴定
材料用具
（1）仪器
（2）用具
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
方法步骤
（1）DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5 min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后1次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
10倍浓缩的扩增缓冲液 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1μL
20 μmol/L的引物I 2.5μL
20 μmol/L的引物II 2.5μL
H2O 28-33μL
1~5U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 1~2U
模板DNA 5~10μL
总体积 50μL
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
制备凝胶
加样
电泳
观察记录
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意说明
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
结果：
片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。
1 2 3 4 5 6
1：Marker、标准大小的DNA分子
2：目的基因
3-5：不同循环次数的PCR产物
6：清水
琼脂糖凝胶电泳
目的基因的筛选与获取
一
2至5都为含目的基因的DNA片段,因为引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的DNA片段结合，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸
应用：在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个体之间的亲缘关系。
琼脂糖凝胶电泳
目的基因的筛选与获取
一
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
二
基因表达载体的构建
1.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）紧挨转录的起点
能控制表达所需要的特殊性状。
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的转录
用来鉴别或筛选含有目的基因的细胞
基因表达载体的构建
二
DNA复制的起始位点，DNA聚合酶结合位点。
=复制原点 +目的基因+启动子+终止子 +标记基因
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
二
基因表达载体的构建
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
思考：
1、启动子和终止子分别是转录的起点和终点吗？
提示：不是。启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。
启动(终止)转录
启动(终止)翻译
作用
位于DNA上
位于mRNA上
位置
DNA片段
三个相邻碱基
本质
启动(终止)子
启始(终止)密码子
2、完成下表
结果：
片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。
1 2 3 4 5 6
1：Marker、标准大小的DNA分子
2：目的基因
3-5：不同循环次数的PCR产物
6：清水
琼脂糖凝胶电泳
目的基因的筛选与获取
一
2至5都为含目的基因的DNA片段,因为引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的DNA片段结合，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸
基因表达载体的构建
复制
原点
标记基因KanR
启动子
多克隆位点
终止子
XbaI
HindIII
BamHI
SmaI
pBI121表达载体
HindIII 酶切
HindIII
HindIII
BamHI
CCCAAGCTT
AAGCTTGGG
TTCGAACCC
CCTAGG
Bt基因
GGATCC
GGGTTCGAA
核心步骤
HindIII
HindIII
BamHI
AGCTT
CCTAGG
Bt基因
GGATCC
A
TTCGA
A
同一种限制酶切
CGA
T
T
AGC
T
T
A
A
A
CGA
T
T
A G C
T
T
A
如何改进
DNA连接酶
A
CGA
CGA
T
T
T
T
AGC
T
T
A
AGC
T
T
A
A
Bt基因
A
CGA
CGA
T
T
T
T
AGC
T
T
A
AGC
T
T
A
A
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
HindIII
BamHI
AGCTT
Bt基因
A
CCTAG
G
用两种限制酶切
CGA
T
T
GAT
C
C
G
A
DNA连接酶
G
CGA
TAG
T
T
C
C
GAT
C
C
A
AGC
T
T
A
G
Bt基因
HindIII
HindIII
BamHI
CCCAAGCTT
AAGCTTGGG
TTCGAACCC
CCTAGG
Bt基因
GGATCC
GGGTTCGAA
原则：1.限制酶切位点不得破坏目的基因和载体上的各类有功能的基因
2.用两种酶切割，可以避免目的基因自接，质粒自身环化，目的基因与质粒倒接
3.用于切割目的基因和质粒的限制酶必须是同种酶
复制
原点
标记基因KanR
启动子
多克隆位点
终止子
XbaI
HindIII
BamHI
SmaI
pBI121表达载体
小本137 题 9
小本137 题 12
大本73
体验区 题 1
(2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，有人将此质粒用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_____ _ ；并且_____ 和____ 的细胞也是不能区分的，其原因是________________ _ 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，
还需使用含有________的固体培养基。
二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
含有质粒载体
含有目的基因的重组质粒
二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
四环素
即含有重组质粒的大肠杆菌在其中不能生长，而含有普通质粒的大肠杆菌能生长．
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
原核细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法（感受态细胞法）
（我国科学家独创)
将目的基因导入受体细胞
三
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
（双子叶植物、裸子植物)
（叶肉细胞)
（受精卵)
（大肠杆菌)
基因枪法
（单子叶植物)
1.花粉管通道法
或②在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
将目的基因导入受体细胞
三
（一)将目的基因导入植物细胞
是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。
2.农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物
农杆菌转化法步骤：
将目的基因导入受体细胞
三
（一)将目的基因导入植物细胞
构建基因表达载体
Ti质粒
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入植物细胞染色体DNA中
植物细胞
植物组织培养
表现出新性状的植株
总结：农杆菌转化法流程图
该过程经过__次拼接、__次导入
①第一次拼接
_______________________________
②第二次拼接
_______________________________
_______________________________
③第一次导入
__________________________________
④第二次导入
__________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
2.农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物
将目的基因导入受体细胞
三
（一)将目的基因导入植物细胞
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3.基因枪法
适用于单子叶植物
将目的基因导入受体细胞
三
（一)将目的基因导入植物细胞
基因枪法意图
1.显微注射法
操作程序：
（为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？)
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
将目的基因导入受体细胞
三
（二)将目的基因导入动物细胞
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
2.科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
将目的基因导入受体细胞
三
（二)将目的基因导入动物细胞
使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
过程
微生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
将目的基因导入受体细胞
三
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（三)将目的基因导入原核细胞
（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）
常用菌：
大肠杆菌
Ca2+
感受态细胞
吸收
返校要带的生物资料
1.生物必修一《分子与细胞》教材
2.选择性必修三单元复习清单默写
（还没打印的同学要打印带回来）
3.笔记本（大一点厚一点，一轮复习用）
4.选择性必修三教材，大小本
目的基因的检测与鉴定
四
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
1.分子水平检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
PCR技术 或
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
（一)分子水平的检测
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
DNA分子杂交结果图
目的基因的检测与鉴定
四
15N
15N
变性
变性
①首先取出转基因生物的基因组DNA；
过程:
②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。
（基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或DNA-RNA分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
Bt基因在抗虫棉中的表达
从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳
目的基因的检测与鉴定
四
（一)分子水平的检测
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带, 表明目的基因转录出了mRNA。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
目的基因的检测与鉴定
四
（一)分子水平的检测
转Bt基因
非转基因
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
采摘抗虫棉植株叶
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
目的基因的检测与鉴定
四
（二)个体水平的鉴定
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
四
（二)个体水平的鉴定
目的基因的检测与鉴定（小结)
四
类型 步骤 检测内容 方法
分子水平检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
DNA-RNA分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
目的基因的检测与鉴定
四
基因工程的基本操作程序
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物);
目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
单元网络构建
一、目的基因的筛选与获取
基因工程的基本操作程序
1.筛选适合的目的基因：
3.利用PCR获取和扩增目的基因：
2.获取目的基因的方法：
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
直接获取，人工合成，利用PCR技术获取和扩增
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
DNA模板，4种脱氧核苷酸，2种引物，耐高温的DNA聚合酶，能量
原理
操作环境
目的
条件
过程
变性（90℃以上）→复性（50℃左右）→延伸（72℃左右）
DNA合成方向
5’端 → 3’端
结果
DNA数：2n ,需要的引物数：2n＋1－2
扩增产物的检测
琼脂糖凝胶电泳
单元网络构建
基因工程的基本操作程序
二、基因表达载体的构建（核心）
1. 目的
2. 组成
3.启动子
4.终止子
5.标记基因：
6.描述基因表达载体的构建过程
7.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的方法
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
=复制原点 +目的基因+启动子+终止子 +标记基因
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）紧挨转录的起点，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
基因的下游（一段特殊的DNA片断），终止mRNA的转录
鉴定或筛选含有目的基因的受体细胞
注意：1.限制酶切位点不得破坏目的基因和载体上的各类有功能的基因
2.用于切割目的基因和质粒的限制酶必须是同种酶
优点：可以避免目的基因自接，质粒自身环化，目的基因与质粒倒接
双酶切
单元网络构建
基因工程的基本操作程序
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入原核细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法（感受态细胞法）
（我国科学家独创)
（双子叶植物、裸子植物)
基因枪法
（单子叶植物)
1.分子水平检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
PCR扩增 或
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
练习与应用（P83）
一.概念检测
D
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
练习与应用（P83）
二、拓展应用
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因
是___ ，标记基因是___ _，质粒pSYN12424的作用是____ __ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断
练习与应用（P83）
二、拓展应用
(3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开
练习与应用（P83）
二、拓展应用

展开更多......

收起↑