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第38讲　基因工程
考情研读·备考定位
课标要求 核心素养
阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)。 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用。 概述蛋白质工程的原理及应用。 实验：DNA的粗提取与鉴定。 生命观念：举例说出植物基因工程、动物基因工程成果及其给人类带来的影响；说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。 科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。 社会责任：认同蛋白质工程的重要意义。
必备知识·夯实基础
一、重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
操作技术： 等技术。
操作结果：赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的 和生物产品。
操作水平： 水平。
2．基因工程的诞生与发展(选择对应的序号)
A．基础理论 。
B．技术支持 。
①DNA是遗传物质的证明 ②基因转移载体的发现 ③工具酶的发现 ④DNA双螺旋结构和中心法则的确立
⑤DNA体外重组的实现 ⑥重组 DNA表达实验的成功 ⑦PCR技术的发明 ⑧遗传密码的破译
3．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
来源：主要来自 。
特点：具有 ，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定 序列。
切割——特定核苷酸序列中的 。
作用：断裂 的两个核苷酸之间的 。
结果：产生 _或 。
4．DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E.coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 _ __ T4噬菌体
特点 缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的
5．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1) 种类
质粒：分子质量较小的、环状的、裸露的 ，独立于原核细胞的拟核或真核细胞细胞核之外。
噬菌体和 等。
目的
① 将目的基因 到宿主细胞中去。
② 在受体细胞内对目的基因进行大量 。
(3) 必备条件
① 在宿主细胞中保存下来并大量 。
② 有一个至多个 。
③ 有一定的 ，便于筛选。
④ 对 无害。
6．DNA的粗提取与鉴定
提取思路：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在__物理和化学性质__方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
提取原理
① DNA的溶解性
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的 就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；DNA不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可溶于其中。
② DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
对酶的耐受性： 能水解蛋白质，但对DNA没有影响；
对高温的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，易发生变性，而DNA在 以上才会变性；
对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。
(3) 鉴定原理：DNA＋ _蓝色。
二、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1) 目的基因：主要是指 的基因。
(2) 获取方法：利用 扩增目的基因。
①含义：是一项在生物体外 的核酸合成技术。
②原理： 。
③条件： 、DNA模板、 、四种脱氧核苷酸。
④过程。
变性：目的基因DNA受热 后解链为单链(90 ℃以上)。
↓
复性： 与单链相应互补序列结合(50 ℃左右)。
↓
延伸：在 作用下进行 (72 ℃左右)。
↓
重复循环多次。
⑤结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成 形式扩增(约为2n)。
2．基因表达载体的构建——核心
基因表达载体的组成
基因表达载体的功能
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 给下一代。
②使目的基因 和发挥作用。
3．将目的基因导入受体细胞
转化的含义： 进入受体细胞内，并且在受体细胞内_ 和 的过程。
转化的方法：
①导入植物细胞：花粉管通道法和 。
②导入动物细胞：
③导入微生物细胞：用 处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
4．目的基因的检测与鉴定
(1) 分子水平检测
方法 内容
_ _技术 检测转基因生物 DNA上是否 或检测目的基因是否
__ _杂交技术 检测目的基因是否 __
个体水平鉴定
通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
5．DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR的产物一般通过 来鉴定。
三、基因工程的应用
1．基因工程在农牧业方面的应用
转基因抗虫植物
从某些生物中分离出具有 _，将它导入作物中培育出具有抗虫性作物。
转基因抗病植物
科学家将来源于某些病毒、真菌等的 导入植物中，培育出 ，如转基因抗病毒甜椒等。
转基因抗除草剂植物
将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出 ，如抗除草剂玉米等。
改良植物的品质
我国科学家成功地将与植物 导入矮牵牛，呈现出自然界中没有的颜色变异，大大提高了观赏价值。
提高动物的生长速率
由于 可以使转基因动物生长得更快，科学家将这类基因导入动物体内，以提高
改善畜产品的品质
如科学家将 基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中， 的含量大大降低，其他成分不受影响。
2．基因工程在医药卫生领域的应用
生产的 、 、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
3．基因工程在食品工业方面的应用
生产食品工业用酶、氨基酸和 等。
四、基因工程的延伸——蛋白质工程
1．原理：由预期的蛋白质找到相对应的 。
2．流程
预期_ _→设计预期的 __→推测应有的 →找到并改变相对应的 或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
3．蛋白质工程的应用
研发速效胰岛素类似物。
干扰素的改进。
改进酶的性能。
易错整合，判断正误。
E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 (　 　)
载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 (　 　)
抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达 (　 　)
PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 (　 　)
利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中 (　 　)
蛋白质工程以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础 (　 　)
1．限制酶主要来源于原核生物，为什么不能切割自身DNA分子？
2．构建基因表达载体的目的是什么？
3．蛋白质工程为什么通过对基因进行操作来实现对天然蛋白质的改造？
关键能力·考点突破
知识点一　重组DNA技术的基本工具
考向?　基因工程工具酶的应用
例1 某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是 (　 　)
A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之 间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
〔变式训练〕
1．(2022·福州模拟)下列关于DNA分子片段示意图的叙述，正确的是(　 　)
某种限制性内切核酸酶可作用于①处
解旋酶可作用于②处
C．DNA 连接酶可作用于③处
D．某种限制性内切核酸酶作用于②处得到的黏性末端序列是GAATTC
考向?　载体的作用及特点
例2 下列有关基因工程中载体的说法，正确的是 (　 　)
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
方法点拨
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
〔变式训练〕
2．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是 (　 　)
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细菌拟核DNA之外的细胞质中
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
考向?　DNA的粗提取与鉴定
例3 关于“DNA粗提取与鉴定”的实验原理的叙述中，正确的是 (　 　)
A．用猪血为实验材料的原因是猪血的红细胞有细胞核，DNA含量多
B．利用DNA在2 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，易析出的特性提取DNA
C．利用DNA不溶于酒精，而细胞中的其他物质可溶于酒精的特性提纯DNA
D．利用DNA与二苯胺作用而显现紫色的特性鉴定DNA
取材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
过滤含DNA的研磨液时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
鉴定DNA用的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
在DNA进一步提纯时，选用预冷的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
〔变式训练〕
3．(不定项) 如图是“DNA 的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述正确的是 (　 　)
A．通过①操作使NaCl 溶液浓度降至0.014 mol/L，析出DNA
B．经①②操作，DNA留在纱布上；经③②操作，则DNA留在滤液中
C．图④是用预冷的体积分数为95%的酒精来进一步纯化粗提取的DNA
D．图①③④都需要玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以防止破坏DNA
知识点二　基因工程的基本操作程序
考向?　DNA片段的扩增及电泳鉴定
例4 (2022·北京模拟)如图是快速RT—PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列叙述错误的是 (　 　)
A．逆转录酶具有DNA聚合酶能力
B．③PCR过程只需要引物b
C．RT—PCR可检测基因表达水平
D．RT—PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
1．PCR技术和DNA复制的比较
2．DNA片段的电泳鉴定
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
3．PCR产物的分析
(1) PCR产物的种类：主要看其DNA片段上的引物种类。
若只有一种引物，则是原始模板复制的产物，在每次循环中均有。
若含有两种引物，则最早出现在第二次循环，以后每次循环中均有。
PCR产物的数量(以1个DNA分子经n次循环扩增的产物分析)。
① PCR产物的总数量：2n。
② PCR扩增的特异性片段的数量：2n－2。
〔变式训练〕
4．(2021·天津模拟)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，使目的DNA得以迅速扩增。其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述错误的是 (　 　)
A．PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
B．PCR技术制备大量DNA时引物要被不断消耗
C．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因
考向?　基因工程的操作程序
例5 北极比目鱼中有抗冻基因，该基因编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，下列有关叙述正确的是 (　 　)
A．过程①是获取抗冻基因的过程，用到的酶只有限制酶
B．在重组质粒上，抗冻基因首端和末端一定具有启动子和终止子，启动和终止翻译的进程
C．过程②用到的质粒是农杆菌的Ti质粒，要将重组质粒转入农杆菌才能进行筛选
D．根据抗冻基因制作的DNA探针，可以用来检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在
1．获取目的基因方法的选择
如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。
如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。
2．启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
3．如何筛选出含有目的基因的受体细胞
原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
〔变式训练〕
5．(不定项)(2021·1月八省联考辽宁卷)菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜，桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花，下列有关叙述正确的是 (　 　)
A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B．将目的基因GNA插入到Ti质粒的T—DNA上构建表达载体
C．菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
知识点三　基因工程的应用及蛋白质工程
考向?　基因工程的应用
例6 (2022·辽宁模拟)目前基因工程硕果累累，下列叙述错误的是 (　 　)
A．我国科学家将Bt毒蛋白基因导入棉花细胞，培育出的棉花既能抗虫也能抗病毒
B．科学家可以把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的
C．可将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，用来生产乳腺生物反应器
D．科学家试图利用基因工程的方法改造猪的器官，解决器官移植中的免疫排斥问题
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体基因结构与人类基因结构差异 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
基因表达 合成的药物蛋白质与天然蛋白质相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方法 显微注射法 感受态细胞法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
生产设备 畜牧业生产、提取设备 工业生产，设备精良
〔变式训练〕
6．(不定项)(2021·山东潍坊期中)复合型免疫缺陷症(SCID)患者缺失腺苷酸脱氨酶(ADA)基因，科学家将ADA基因通过X病毒转入患者的T细胞中，再将携带ADA基因的T细胞注入患者体内，可改善患者的免疫功能。下列叙述正确的是 (　 )
A．可直接利用PCR 技术选择性地将 ADA 基因扩增出来
B．X属于动物病毒，是将ADA基因导入T细胞的载体
C．T细胞需在体外培养至一定数量后再注入患者体内
D．用正常ADA基因替换缺陷基因进行治疗的方法属于基因治疗
考向?　蛋白质工程
例7 (不定项)下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法正确的是 (　 )
A．蛋白质工程只能生产自然界已经存在的蛋白质
B．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
C．蛋白质工程是以基因工程为基础的生物工程技术
D．蛋白质工程可以制造一种新的蛋白质也可以对现有的蛋白质进行改造
蛋白质工程与基因工程比较
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 生产自然界没有的蛋白质 一般是生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
〔变式训练〕
7．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。
回答下列问题。
从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的 进行改造。
以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括 复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： _。
蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过 和
，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
素养提升·强化思维
1．(2020·海南卷 )下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是 (　 　)
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
2． (2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是 (　 　)
A．①＋③　　　　　B．①＋② C．③＋② D．③＋④
3．(2020·浙江7月选考)下列关于基因工程的叙述，正确的是 (　　)
若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。 表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
(2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是 ，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了 ，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“发生”或“不发生”)改变，原因是 。
为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 过程获得总 cDNA。通过 PCR 技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是
各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为 ，原因是
(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。
步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′—羟基与5′—磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′ ②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′ ③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′ ④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 。
A. 5′—AACTATGCG－－－－－－－AGCCCTT—3′
B. 5′—AATTCCATG－－－－－－－－CTGAATT—3′
C. 5′—GCAATGCGT－－－－－－－TCGGGAA—3′
D. 5′—TTGATACGC－－－－－－－－CGAGTAC—3′
微专题　限制酶的选择方法　
1．限制酶选择的依据
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaI。
为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstI和EcoRI两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
1．(2020·和平区二模)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是 ( 　)
图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是 ( )
A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
3．用限制酶EcoRV单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb 即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoR V、Mbo Ⅰ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoR V限制酶切割后的一个黏性末端)。
若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为 (　 　)
A．2.5和5.5　　　　B．2.5和6 C．5.5和8 D．6和8
4． (不定项)(2021·湖北期末)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是 (　 　)
限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ Sma Ⅰ
识别序列 切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G A↓AGCTT TTCGA↑A G↓AATTC CTTAA↑G CCC↓GGG GGG↑CCC
A．一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割
C．图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcoRⅠ
D．为了获取重组质粒，最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA
5．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是 。
若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是
。
DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_ 。
(2019·江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为 末端。
用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是 (填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
菌落类型 平板类型　　　　　　 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。
图2
1．(全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________；并且_________________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是____________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。
基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________________。
3．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是________________。
以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是____________________________________________________。
若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是____________________________________(答出两点即可)。
当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。
若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________。
4．真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_______________________________________________________________。
若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________(答出两点即可)等优点。
若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是______________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________。
5．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题：
除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外，还可通过__________的方法获得目的基因。
图示所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达，需要质粒为其提供________________等调控因子；质粒含有一个或多个__________切割位点，供目的基因插入其中；质粒上还含有______，供重组DNA的鉴定和选择。
图中切割人胰岛素基因和质粒的酶(酶A)相同，其目的是________________。将重组DNA分子导入大肠杆菌前，常需用________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。
(4)由于大肠杆菌中没有________________________等结构，其内合成的人胰岛素没有活性，需要经过再加工。
4．血清白蛋白具有维持血液胶体渗透压、清除自由基、抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能，科学家利用基因工程技术成功培育出了转基因羊，从其分泌的乳汁中可提取血清白蛋白。请回答下列问题：
目前获得目的基因常用方法之一是从____________中获取，进而用________技术扩增，此技术应满足的条件有：适宜的温度和pH、原料、模板、能量、_____________、______________酶。
将血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的________等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，该过程需要用__________________酶，然后通过________技术，导入羊的受精卵中。通过早期胚胎培养发育成桑椹胚或囊胚后移植到受体母羊子宫内，最终获得分泌的乳汁中含有血清白蛋白的乳腺生物反应器。
可利用________________技术检测转基因羊的乳汁中是否含有血清白蛋白。
如图表示抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：
图中所示的目的基因是________，构建重组Ti质粒时应该将基因插入质粒中的TDNA上，原因是______________________________________________。
构建重组Ti质粒需要的酶有____________________，重组质粒除了目的基因和标记基因外，还有__________________。
图中显示将目的基因导入棉花细胞的方法是________法，可以将该重组质粒导入棉花细胞，而一般不能导入小麦或玉米等单子叶作物的细胞中，原因是________________________。
图中过程③是________，过程④的实质是__________________。

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