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1.2 发酵工程的无菌技术第2课时
微生物的纯培养
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
1.概念：
2.内容：
1）配制培养基
2）灭菌（培养基和器具）
3）微生物接种
4）分离
5）恒温箱中培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
一、平板划线法分离和纯化微生物
①酵母菌是兼性厌氧型单细胞真菌，可以进行出芽生殖，也可以进孢子生殖；
②培养的最适pH为4.5～5.0，最适生长温度为28～30 ℃；
③可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需要通过固体培养基培养。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
酵母菌
(1)实验目的
尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。
(2)实验原理
① 培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要；
② 是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。
马铃薯葡萄糖琼脂
平板划线法
(3)实验器材和试剂
酵母菌样本(菌种)；接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅；马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
（4）实验步骤
②培养基和培养皿灭菌：放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为103kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-20min。
用牛皮纸包扎已配制的培养基
已包好的培养皿
高压蒸汽灭菌锅灭菌
①配制马铃薯葡糖糖琼脂培养基并调pH
＋
→
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
倒平板的具体操作：
③倒平板：
待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1
2
3
4
1.拔出锥形瓶的棉塞
2.将瓶口迅速通过火焰2~3次，并转动瓶口，确保瓶口灭菌
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
因为平板凝固后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可避免培养基中的水分过快蒸发。
讨 论：
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，从而获得单个菌落的方法。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面
或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
单菌落：一般由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的纯种菌落,即单菌落。
微生物群
连续划线
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
生长繁殖
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
④平板划线和培养
操作步骤
在一个倒有培养基的培养皿的皿底外侧面中央用记号笔画一直线，再在此线中间处画一垂直线，将培养皿分成三个区域：第1区域、第2区域、第3区域，分别标上“1”“2”“3”字样。
1
2
3
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
接种划线时，将带有酵母菌样品的接种环，在培养皿内培养基的第1区域划线，然后再从第1区域划到第2区域，从第2区域划到第3区域（在第2次、第3次划线前，接种环需过火灭菌）。在固体培养基表面完成多次“由点到线”的逐步稀释。划完线后盖上皿盖，倒置培养。
接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的菌落。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
为什么要将平板倒置？
为什么要同时放入未接种的平板？
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
⑤培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
⑤实验结果分析与评价
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
走进实验室：通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等
1.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？
避免温度过高杀死菌种
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
2.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
核心探讨1
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
3.为什么划线时要注意不能划破培养基？
4.平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环挑取菌体前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
5.若在培养基上观察到不同形态的菌落，原因是什么？
原因可能是菌种不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
【核心归纳】
1.配制培养基的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰2～3次。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(4)平板冷却凝固后，要将平板倒置。因为平板凝固后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可避免培养基中的水分过快蒸发。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2.平板划线操作中三种灼烧的目的不同
项目 目的
挑取菌体前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种
每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端
划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
1．平板划线法是微生物培养中常用的接种方法。下列叙述错误的 ( 　)
A．在酒精灯的火焰旁操作可以避免周围环境中微生物的污染
B．第二次及以后划线均要从上次划线末端开始以达到分离单菌落的目的
C．划线用力大小要适当防止划破培养基，最后一区域要与第一区域相连
D．接种后需将平板倒置培养，防止冷凝水落入培养基造成污染
C
二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，使其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。
2.应用：既可用于菌种的分离和纯化，也可以用于微生物的计数。
1.稀释涂布平板法：
101
102
103
104
105
106
(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。
(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。
(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复步骤2，直到第六支试管。
注意：移液管需要经过灭菌，试管口和移液管应在离火焰1-2cm处
3.稀释涂布平板法的操作过程——系列稀释操作
①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
3.稀释涂布平板法的操作过程——涂布平板操作
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
4、稀释涂布平板法计数原则
注：平板划线法不能对菌种进行计数；而稀释涂布平板法可以计数，但计数值会比实际值偏小，因为一个菌落有可能是由两个或者多个的菌体一起形成的。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
稀释106倍
1.实验目的
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用稀释涂布平板法分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。
2.实验原理
①利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成单个菌落。单
个菌落即为纯化培养物，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以尿素为氮源的1000mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
3.实验器材和试剂
（1）样品的稀释（梯度稀释菌液）
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
4.实验步骤
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
③配置培养基及制作平板
设置一组不加氮源的平板，作为空白对照。
在大烧杯加入培养基的成分，并加琼脂煮沸溶解，定容，调节pH为7.2～7.4，装入锥形瓶，灭菌，冷却至50℃，倒平板。
④涂布
从浓度最低的土壤悬液开始，每个浓度设置3个重复。
⑤培养与观察
另设一组对照，用等体积无菌水代替土壤悬液，用来判断平板在实验前或实验过程中是否被污染。
倒置于37℃恒温箱中培养1~2d，每24h观察一次；
接种在牛肉膏蛋白胨培养基 （完全培养基），观察菌落的差异。
思考:若要判断选择培养基是否具有选择作用，应如何设计对照
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
计算时，选取菌落数为30~300的一组为样本进行统计。
公式：每克土壤样品的细菌数=某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数÷涂布所用稀释液体积数
⑥计数菌落：
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
空白对照
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或 多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
思考：通过此方法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？
走进实验室：分离、土壤中分解尿素的细菌并进行计数
常用微生物分离方法比较
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具
原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
结果
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 接种环
涂布器
2.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A.2.34×108
B.2.34×109
C.234
D.23.4
B
3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　)
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
C．5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为4号试管的10倍
D．该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数
B
核心探讨2
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果 (填“可靠”或“不可靠”)，若不可靠，应如何改进？
为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
不可靠
2.乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理
(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应 ，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
不合理
分析实验过程中可能的影响因素
3.某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板 菌落数 稀释度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为244×105÷0.1＝2.44×108(个)。

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