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专题七　发酵工程　专项练习
非选择题
1.(2022·深圳二模)米诺环素(分子式:C23H27N3O7)是一种四环素类抗生素,应用于人类疾病治疗和畜禽养殖。由于进入人体或动物体内不能完全被吸收,造成其在环境中残留。某研究人员在自然水域中筛选和分离得到了一种米诺环素高效降解菌DM13,并展开相关研究。下表是研究过程中使用的培养基种类及配方,回答下列问题。
培养基种类 配方
BP培养基 蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化钠5.0 g,蒸馏水定容至1000 ml
BPA培养基 蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂25.0 g,蒸馏水定容至1000 ml
MM培养基 MgSO4·7H2O 0.15 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、
CaCl2 0.02 g、KH2PO4 1 g、Na2HPO4 1 g、
NH4NO3 1 g、葡萄糖0.5 g,蒸馏水定容至1000 ml
(1)分离微生物前,可通过选择培养来增加米诺环素降解菌的浓度,需在BP培养基中添加一定浓度的　　 　　　,该物质同时提供微生物生长需要的　 。
(2)选择培养得到的微生物样品先稀释,再涂布到 (BP/
BPA/MM)培养基的平板进行培养。如果水样中降解米诺环素的微生物数量较少,为了避免分离筛选失败,可采取的措施是 (回答1点)。
米诺环素溶液
碳源、氮源
把各种稀释倍数的溶液都涂布到平板进行培养、增加重复平板的数量
BPA
(3)为了测定菌株DM13在自然水体中降解米诺环素的效果,在锥形瓶中用自然水体配制四种不同初始浓度的米诺环素溶液,进行实验。
①8 h处理后,在米诺环素溶液初始浓度100 ug/L的水体中,空白对照测得的米诺环素溶液浓度41.8 ug/L,加入菌株DM13测得的浓度24.3 ug/L,相较空白对照组,米诺环素降解菌的降解率为　 。
②为了测定菌株DM13的实际降解效果,可选择表中的MM培养基替换自然水体,这样做的目的是 。
41.9%([(100-24.3)-(100-41.8)]/41.8)
排除自然水体中其他微生物的影响
【详解】　
(1)分离微生物前,可通过选择培养来增加米诺环素降解菌的浓度,需在BP培养基中添加一定浓度的米诺环素溶液,以提供选择培养的条件,该物质中含有碳元素和氮元素,因而可同时提供微生物生长需要的碳源和氮源。
(2)选择培养得到的微生物样品先稀释,再涂布到BPA培养基的平板进行培养,因为该培养基是固体培养基,且其中含有微生物生长所需的碳源和氮源。如果水样中降解米诺环素的微生物数量较少,因而可能导致实验失败,为了避免分离筛选失败,可把各种稀释倍数的溶液都涂布到平板进行培养、增加重复平板的数量,从而可分离得到相应的单菌落。
(3)本实验的目的是测定菌株DM13在自然水体中降解米诺环素的效果,因而设计在锥形瓶中用自然水体配制四种不同初始浓度的米诺环素溶液,进行实验。
①8 h处理后,在米诺环素溶液初始浓度100 ug/L的水体中,空白对照测得的米诺环素溶液浓度41.8 ug/L,加入菌株DM13测得的浓度24.3 ug/L,相较空白对照组,米诺环素降解菌的降解率为[(100-24.3)-(100-41.8)]/41.8≈41.9%。
②为了测定菌株DM13的实际降解效果,可选择表中的MM培养基替换自然水体,这样做的目的可排除自然水体中其他微生物的影响。
2.(2021·广东省一模)用大豆酿造的酱油是我国的传统调味品,初见记载于800多年前的南宋。酱油曲霉对酱油生产的原料利用率和酱油的风味起决定性作用。以下为诱变选育酱油曲霉高酶活菌株的主要步骤:将培养基装入锥形瓶→灭菌→接入菌种孢子→培养2天成曲→紫外灯诱变→纯化接种→多次筛选→测酶活性。下表为6种菌株酶活性的检测结果。请回答:
酶种类 不同菌株酶活性(相对值)
原始株 诱变① 诱变② 诱变③ 诱变④ 诱变⑤
碱性蛋白酶 1.00 1.31 1.49 0.89 1.20 1.57
中性蛋白酶 1.00 1.18 1.28 1.35 1.44 1.57
酸性蛋白酶 1.00 0.43 1.78 0.17 1.15 1.00
纤维素酶 1.00 1.28 0.92 1.16 1.35 1.41
a-淀粉酶 1.00 1.02 0.95 0.95 1.45 1.36
(1)盛有培养基的锥形瓶需通过　　 　　　法进行灭菌,灭菌是指 。
(2)平板划线接种中,在做第二次以及其后的划线操作时,总是从上一次划线的末端开始,其目的是 。 　　　　　　　　　　　　　　　　
(3)测定蛋白酶活性时,可用单位时间内、单位体积中 .
来表示。
(4)酱油质量标准:酱油中的氨基酸含量越高,则鲜味越浓、质量越好。据上表数据分析,诱变菌株　 　(填数字)具有更好的工业化应用前景,理由是　 。
高压蒸汽灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子
得到单个菌落
蛋白质消耗量(或氨基酸生成量)
②
蛋白酶的总体活性最高,氨基酸生成量多
【详解】　
(1)对培养基常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌,灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子。
(2)平板划线的目的是分离菌种,以便得到单个菌落。为达到此目的,在平板划线接种中,在做第二次以及其后的划线操作时,总是从上一次划线的末端开始。
(3)酶活性指的是酶对化学反应的催化效率,而蛋白酶能够催化蛋白质水解,所以测定蛋白酶活性时,可用单位时间内、单位体积中蛋白质消耗量(或氨基酸生成量)来表示。
(4)酱油质量标准是:酱油中的氨基酸含量越高,则鲜味越浓、质量越好。分析表中信息可知,诱变菌株②的蛋白酶的总体活性最高,说明其氨基酸生成量多,因此具有更好的工业化应用前景。
3.(2021·广州一模)乳酸菌中的谷氨酸脱羧酶(GAD)能消耗H+,将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(GABA),GABA在制药、食品等方面具有较大应用。研究人员从泡菜样品中筛选高产GABA的乳酸菌株,并优化其发酵条件。回答下列问题:
(1)已知MRS固体培养基因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌所产的酸可与碳酸钙发生反应,从而在培养基上形成 。　　　　　　　　　　从功能上判断,MRS培养基可作为乳酸菌的　　　　培养基。
(2)利用MRS培养基分离纯化乳酸菌时,首先需用　　　 　对泡菜滤液进行梯度稀释,然后再结合其他方法筛选出具高产GABA特性的乳酸菌。进行梯度稀释的目的是 .
　 。
透明圈
鉴别
无菌水
泡菜滤液中菌的浓度高,
直接培养很难分离得到单菌落
(3)研究人员对高产菌株产GABA的发酵时间和温度分别进行了研究,结果显示,发酵时间在48~60 h范围内,GABA的相对产量较高;发酵温度在35~39 ℃范围内,GABA的相对产量较高。研究人员认为,要进一步提高GABA相对产量,以达到最佳生产效果,还需同时对发酵时间和发酵温度进行优化。请为该优化实验设计一个实验结果记录表。
温度 时间
48小时 49小时 50小时 51小时 52小时 53小时 54小时
35 ℃
36 ℃
37 ℃
38 ℃
39 ℃
温度 时间
55小时 56小时 57小时 58小时 59小时 60小时 ——
35 ℃ ——
36 ℃ ——
37 ℃ ——
38 ℃ ——
39 ℃ ——
【答案】 不同温度、不同发酵时间GABA的相对产量
4.(2021·深圳二模)为筛选出优良的纤维素酶产生菌,某科研团队从腐木、腐土、腐叶等样品中采集微生物,配置马铃薯琼脂培养基和羧甲基纤维素琼脂培养基(后者的配方如下表),分别用于初筛和复筛,最终分离、纯化得到降解纤维素能力较强的木霉1株(T-1)和青霉2株(P-1,P-2)。回答下列问题:
物质 质量或体积 物质 质量或体积
羧甲基纤维素钠 10 g 蛋白胨 1 g
(NH4)2SO4 4 g 琼脂 20 g
KH2PO4 2 g 蒸馏水 1000 mL
MgSO4·7H2O 0.5 g
(1)表中的羧甲基纤维素钠主要为微生物生长提供　 　　,从功能上分析,该培养基属于　　 　培养基。
(2)复筛的过程中,在培养基中添加适量的刚果红染料,根据菌落
　　　　　　　 ,可筛选出分解纤维素的霉菌,原因是 .
.
　 。
(3)β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶,能将纤维二糖分解为　　 　。为了探究T-1、P-1、P-2这3株霉菌产生β-葡萄糖苷酶的活性选用甘蔗渣作为碳源的发酵产酶培养基,以水杨素(一种纤维二糖)作为酶促反应底物,写出简要实验思路: .
.
.
　 。
碳源
选择
是否产生透明圈
刚果红不能和纤维素水解后的产物形成红色复合物(刚果红可以和纤维素形成红色复合物,但不能和纤维素水解后的产物形成红色复合物)
葡萄糖
将3株霉菌分别接种到相同发酵产酶培养基中单独产酶,各取相同体积的酶液,加入等体积的水杨素分别进行反应,测量单位时间内水杨素的减少量或葡萄糖的增加量
【详解】　
(1)题干信息为“筛选优良的纤维素酶产生菌”,则培养基中应该以纤维素作为唯一的碳源,故表中的羧甲基纤维素钠主要为微生物生长提供碳源。该培养基只允许纤维素酶产生菌生存,其他的微生物无法生存,故从功能上分析,属于选择培养基。
(2)纤维素分解菌产生纤维素酶,可分解菌落周围的纤维素,故根据菌落周围是否出现透明圈,可筛选出分解纤维素的霉菌。原因是纤维素被分解后,刚果红就不能和纤维素水解后的产物形成红色复合物(刚果红可以和纤维素形成红色复合物,但不能和纤维素水解后的产物形成红色复合物。)
(3)纤维素酶是一种复合酶,包括三种组分,即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解为葡萄糖。为了探究T-1、 P-1、P-2这三株霉菌产生β-葡萄糖苷酶的活性,可以通过纤维素分解的速率来比较,故实验思路为:将3株霉菌分别接种到相同发酵产酶培养基中单独产酶,各取相同体积的酶液,加入等体积的水杨素分别进行反应,测量单位时间内水杨素的减少量或葡萄糖的增加量。
拮抗微生物数量多针对性强
5.(2022·广州一模)番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的,具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作为拮抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此,发掘新的高效能拮抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意义。回答下列问题。
(1)进行样本采集及拮抗细菌菌株分离纯化时,应采集某地番茄青枯病发病果园中　　 (填“健康”或“患病”)植株根际土壤,在番茄青枯病发病果园中取样的原因是　
_______。先称取1 g土壤添加到盛有　　 　的三角瓶中均匀振荡后,置于恒温水浴15 min。经分离培养后,挑取单菌落进行划线纯化。
健康
无菌水
(2)进行拮抗细菌的分离筛选时,为比较不同根系微生物纯化菌液对青枯病病原菌的拮抗作用效果,科研人员配制了含有青枯病病原菌的平板,在含青枯病病原菌平板上滴加　　　　　　　,在相同且适宜的条件下培养一段时间,观察并比较抑菌圈的大小,拮抗作用越强则　 。
(3)通过对拮抗细菌产酶活性进行测定,筛选出4株菌株,随后进行青枯病预防实验。现有番茄幼苗、4种菌液、青枯菌菌液、无菌水等。请设计实验比较菌株的预防效果(写出实验思路)。
不同根系菌液
抑制菌圈越大
将生长状况相同且良好幼苗平均分为5等分,标注1~5 组,每组设三个平行组。 1组喷洒无菌水和青桔菌液,2~5组分别喷洒四种菌液,后喷洒青枯菌菌液,培养一段时间观察比对生长及患病情况。
【详解】　
(1)根据题意,拮抗细菌可通过拮抗青枯雷尔氏菌防止番茄青枯病的发生,在发病果园中存在青枯雷尔氏菌,其中健康的植株则是由于拮抗细菌的存在而使其保持健康,为了获取拮抗菌株,我们应选取健康植株的土壤。在发病果园中取样的原因是番茄青枯病发病果园中有较多的青枯雷尔氏菌,也有较多的拮抗细菌,即番茄青枯病发病果园中拮抗微生物数量多针对性强。称取土壤后进行稀释,使用无菌水进行稀释,避免外来微生物对纯化的影响,因此先称取1 g土壤添加到盛有无菌水的三角瓶中均匀振荡后,置于恒温水浴15 min。
(2)为比较不同根系微生物纯化菌液对青枯病病原菌的拮抗作用效果,科研人员配制了含有青枯病病原菌的平板,含青枯病病原菌平板中滴加等量的不同根系微生物纯化菌液,观察其抑菌圈的大小。根系微生物对青枯病病原菌有拮抗作用,会抑制其生存,滴加了根系微生物纯化菌液的地方不会生长青枯病病原菌,其周围生长了青枯病病原菌,形成抑菌圈,所以拮抗作用越强则抑制菌圈越大。
(3)实验目的是进行青枯病预防实验比较菌株的预防效果,故实验自变量为菌株的种类,在实验设计过程中,要遵循单一变量的原则,因此实验思路为:将生长状况相同且良好幼苗平均分为5等分,标注1~5组,每组设三个平行组。1组喷洒无菌水(作为对照组)和青桔菌液,2~5组分别喷洒四种菌液,后喷洒青枯菌菌液,培养一段时间观察比对生长及患病情况。
6.(2022·江门一模)红曲霉是一类小型腐生真菌,其菌落起初为白色,老熟后因种而异变为淡粉色、紫红色或天黑色等。红曲霉具有耐酸、耐乙醇、耐高温等特性,可用作酿酒、制醋和腐乳生产的调味剂。
(1)在红曲霉的培养基中加入淀粉和蛋白质,作为其生长所需营养物质中的　　 　　　。红曲霉可产生淀粉酶和蛋白酶等多种酶类,将淀粉和蛋白质最终水解成　　　 　　等呈味物质。为获取红曲霉的单菌落,可以在无菌操作条件下通过
　　　　　 接种,此方法将混合菌株在固体培养基中培养形成单菌落,然后根据红曲霉表现出的　 　　　　 挑选所需的目的菌株。
碳源和氮源
单糖和氨基酸
平板划线或稀释涂布平板
特有的菌落特征
(2)上述培养皿中培养出不同微生物的菌落后,需经多次分离才能获得所需的红曲霉菌株。为减少分离次数,在培养基中添加适当浓度的乳酸和乙醇,并设置合适的温度,目的是 。
(3)在已分离得到多株红曲霉的基础上需进一步筛选特定的红曲霉。研究人员通过紫外线诱变获得多个红曲霉突变体,再将这些突变体点种于含有牛奶的固态培养基中,通过 的比值来筛选蛋白酶活为较高的红曲霉。
抑制红曲霉以外的其他微生物的活性
水解圈和菌落直径
【详解】　(1)在红曲霉的培养基中加入淀粉和蛋白质,作为其生长所需营养物质,其中淀粉主要作为培养基中碳源,蛋白质主要作为培养基中的氮源。红曲霉可产生淀粉酶和蛋白酶等多种酶类,将淀粉和蛋白质最终水解成单糖(葡萄糖)和氨基酸等呈味物质。为获取红曲霉的单菌落,可以在无菌条件下通过平板划线或稀释涂布平板法在固体培养基上接种从而获得单菌落,然后根据红曲霉表现出的特有的菌落特征挑选所需的目的菌株,这是目的菌纯化的过程。
(2)上述培养皿中培养出不同微生物的菌落后,需经多次分离才能获得所需的红曲霉菌株。为减少分离次数,根据红曲霉具有耐酸、耐乙醇、耐高温等特性,在培养基中添加适当浓度的乳酸和乙醇,并设置较高的温度,从而选择出目的菌株,因为很少有其他有菌种能利用乳酸和乙醇,并耐高温,从而起到选择的作用。
(3)在已分离得到多株红曲霉的基础上需进一步筛选特定的红曲霉。研究人员通过紫外线诱变获得多个红曲霉突变体,再将这些突变体点种于含有牛奶的固态培养基中,通过水解圈和菌落直径的比值大小来筛选蛋白酶活为较高的红曲霉,该值越大说明红曲霉的分解能力越强。

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