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专题八　细胞工程和基因工程
专题突破
第1讲　细胞工程
【思维导图】
【考点梳理】
考点1　植物细胞工程
1.理论基础——植物细胞具有全能性
细胞的全能性:细胞经分裂和分化后,仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
2.植物组织培养技术
(1)概念
植物组织培养:将离体的植物器官、组织或细胞等,培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱导其形成完整植株的技术。
(2)过程
外植体 愈伤组织 根、芽等 → 试管苗 完整植株
主要包括脱分化和再分化。
脱分化:已经分化的细胞失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞,进而形成不定形的薄壁组织团块(愈伤组织)。
再分化:愈伤组织能重新分化成根、芽等器官的过程。
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素,二者的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
3.植物体细胞杂交技术
(1)概念:将不同来源的植物体细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
(2)过程
意义:克服了远缘杂交不亲和的障碍,获得杂种植株。
4.植物细胞工程的应用
(1)植物繁殖的新途径
快速繁殖:快速繁殖优良品种的植物组织培养技术,也叫微型繁殖。高效、快速、保持优良品种的遗传特性。
作物脱毒:茎尖等病毒极少,甚至无病毒。茎尖组织培养获得脱毒苗。
考点2　动物细胞工程
1.动物细胞培养——动物细胞工程的基础
(1)条件
充足营养:需加血清。
无菌、无毒环境。
适宜温度、pH和渗透压。
适宜的气体环境:主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
(2)过程
取动物组织剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理→分瓶进行传代培养→收集。
细胞贴壁:细胞贴附在瓶壁上生长增殖的现象。
接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖的现象。
(3)干细胞培养
干细胞包括胚胎干细胞(简称ES细胞)和成体干细胞。
胚胎干细胞:来源于早期胚胎。具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
成体干细胞:只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力。
诱导多能干细胞(简称iPS细胞):通过体外诱导成纤维细胞,获得类似胚胎干细胞的一种细胞。iPS细胞可分化成各种细胞、组织等,可解决器官移植中器官来源和免疫排斥两大难题。
2.动物细胞融合技术与单克隆抗体
(1)动物细胞融合技术的概念:使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞遗传信息。
意义:主要用来制备单克隆抗体。
(2)诱导融合方法:PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
(3)单克隆抗体的制备——杂交瘤技术
杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生抗体。
单克隆抗体的优点:特异性强、灵敏度高,并能大量制备。
(4)单克隆抗体的应用
①作为诊断试剂——单克隆抗体最广泛的用途
准确识别各种抗原物质的细微差异,与特定抗原发生特异性结合作为诊断试剂。如早早孕试剂盒,用同位素或荧光标记的单克隆抗体可定位诊断肿瘤、心脑血管疾病等。
②用于治疗疾病和运载药物
抗体-药物偶联物(ADC):通常由抗体、接头和药物三部分组成。如将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合,实现了对肿瘤细胞选择性杀伤。单克隆抗体:起靶向运载药物的作用。
单克隆抗体药物用于治疗疾病。
3.核移植技术和克隆动物
(1)动物细胞核移植技术:将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,使这个重新组合的细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的技术。
(2)克隆动物:用核移植的方法得到的动物。
(3)原理:动物细胞核的全能性。
(4)种类:胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。
(5)过程
(6)应用
畜牧业:加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育等。
医药卫生:转基因克隆动物作为生物反应器生产医用蛋白等。
其他领域:了解胚胎发育及衰老过程、保护濒危物种等。
考点3　胚胎工程
1.理论基础
(1)受精
①包括准备阶段(精子获能、卵子准备)和受精阶段。
精子必须在雌性动物生殖道内发生相应生理变化后,才能获得受精的能力。
刚排出的卵子需要在输卵管内进一步成熟,到减数第二次分裂(MⅡ)中期才具备与精子受精的能力。
②受精阶段:精子穿越卵细胞膜外的结构(透明带)→精子接触卵细胞膜→精子进入卵细胞→雌、雄原核形成→雌、雄原核融合(实质阶段)→受精卵。
精子接触卵细胞膜瞬间,透明带迅速发生生理反应,会阻止后来的精子继续穿过透明带。
精子进入卵细胞后,卵细胞膜立即发生生理反应,防止其他精子进入卵内。
完成受精的标志:卵细胞膜和透明带之间出现2个极体。
(2)胚胎早期发育
受精卵→2细胞→4细胞→8细胞→桑椹胚→囊胚
受精卵早期分裂在透明带内进行,细胞数量增加,但胚胎总体积不增加,这称为卵裂。
囊胚出现了内细胞团、滋养层和囊胚腔。内细胞团将来发育成胎儿各种组织;滋养层将来发育成胎膜和胎盘。
孵化:囊胚进一步扩大,导致透明带破裂,胚胎从其中伸展出来。
2.胚胎工程技术及其应用
(1)体外受精
主要包括卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精等步骤。
(2)胚胎移植
①概念:将通过体外受精及其他方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为新个体的技术。供体:提供胚胎的个体。受体:接受胚胎的个体。
②过程
供体和受体的生理环境条件要保持一致。
③实质:早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
(3)胚胎分割
①概念:指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
选择发育良好的,形态正常的桑椹胚或囊胚进行分割。分割囊胚要将内细胞团均等分割。
②特点:后代具有相同的遗传物质。
典型示范一
细胞融合技术有着广泛应用。下图为细胞融合的简略过程,据图回答相关问题:

(1)若a、b分别是基因型为yyRr和YYrr两个玉米品种的花粉,且这两对基因分别位于两对同源染色体上。科学家分别将它们的花粉除去细胞壁,然后诱导其融合,再把这些融合细胞进行培养,培育出了玉米新品种。
①这两个品种的花粉可用化学诱导剂　　　　　诱导融合,这些融合细胞经过脱分化形成　　　　　。
②若想培育出基因型为yyRR的玉米植株,也可直接用yyRr植株的花粉培养,再经过　　　　　处理并筛选获得,这种育种方法叫作　　　　　　　　。
【答案】　(1)①聚乙二醇(PEG)　愈伤组织　
②秋水仙素　单倍体育种
【详解】　(1)①原生质体可以用聚乙二醇诱导融合,这些融合细胞经过脱分化形成愈伤组织。②直接用yyRr植株的花粉(yR、yr)经过秋水仙素处理得到yyRR、yyrr,筛选获得yyRR,这种育种方法叫作单倍体育种。
细胞融合技术有着广泛应用。下图为细胞融合的简略过程,据图回答相关问题:

(2)若a、b表示番茄和马铃薯两种植物的体细胞,请据图回答:在“番茄—马铃薯”的培育过程中,运用了植物细胞工程中的 　　　　技术,植物体细胞融合完成的标志为　　　　　。a、b细胞融合之前,要用到的酶是　　　　　。
【答案】　(2)植物体细胞杂交　杂种细胞再生出新的细胞壁　纤维素酶和果胶酶
【详解】　(2)在“番茄—马铃薯”的培育过程中,运用了植物细胞工程中的植物体细胞杂交技术;植物体细胞融合完成的标志为杂种细胞再生出新的细胞壁;a、b细胞融合之前,要用到的酶是纤维素酶和果胶酶,用于去除细胞壁。
【重点归纳】　植物组织培养技术:将离体的植物器官、组织或细胞等,培养在人工配制的培养基上,给予适宜的营养条件,诱导其形成完整植株的技术。植物体细胞杂交过程: 先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁,获得原生质体,借助物理或化学方法诱导原生质体融合,得到的杂种细胞再经过诱导形成愈伤组织,并进一步发育成完整植株。
变式训练一
某研究所在“神舟四号”飞船进入太空后为一对“新人”——黄花烟草(二倍体)的原生质体和革新一号烟草(二倍体)的原生质体举办了特殊的“婚礼”。将两个“新人”放入融合器中,当充满液体的融合器加上直流电场,两个原本相互游离的细胞一下子贴到一起,开始了“窃窃私语”。紧接着,在瞬间高压脉冲的作用下,两股细胞质展开了“心灵沟通”。渐渐地,细胞核也扭摆着“亲热”起来,20 min后,一个新生命就这样诞生了。地面实验结果显示:这种“太空烟草”比普通烟草个子矮、株秆粗、烟叶多,是我国太空育种试验的一项重大成果。据此回答下列问题:
(1)由于细胞的密度不同,因此在地面上进行细胞融合非常困难。从理论上讲,在太空中细胞更容易融合,可能的原因是 　　　　　　　　　　 。在显微镜下观察,两个“新人”的细胞膜融合在一起,使细胞呈圆球状,这是因为膜具有　　　　　。
【答案】　(1)太空中重力作用很弱　一定的流动性
【详解】　(1)由于细胞的密度不同,在地面上受重力影响,因此在地面上进行细胞融合非常困难。从理论上讲,在太空中细胞更容易融合,可能的原因是与地面相比,太空中重力作用很弱,细胞融合率大大提高。两个细胞的细胞膜能融合一起,是因为两者细胞膜的组分和结构相似,均具有一定的流动性。
(2)两种烟草原生质体融合时(只考虑两个细胞融合),可能出现
　　　　　种融合结果,其中　　　　　　类型是我们需要的,融合完成的标志是　　　　　　　。此细胞经组织培养后得到的植株属　　　　　倍体。
【答案】　(2)3　黄花烟草与革新一号烟草原生质体融合　融合细胞再生细胞壁　四(异源四倍体)
【详解】　(2)植物原生质体融合过程常利用化学试剂聚乙二醇(或PEG),若只考虑两个细胞融合,则融合后有3种不同类型的原生质体,即黄花烟草—革新一号烟草原生质体融合、黄花烟草—黄花烟草原生质体融合、革新一号烟草—革新一号烟草原生质体融合,其中杂种原生质体黄花烟草—革新一号烟草原生质体融合是我们所需的。融合细胞再生细胞壁是原生质体融合完成的标志,该杂种细胞经植物组织培养之后得到的植株同时含有黄花烟草和革新一号烟草的染色体,即异源四倍体。
(3)这种“太空烟草”的培育过程是植物细胞工程的　　　　技术,该技术与传统的有性杂交相比,其突出的优点是:　 　 。
【答案】　(3)植物体细胞杂交　在打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种等方面有优势
【详解】　 (3)“太空烟草”的培育是利用相关技术将黄花烟草和革新一号烟草这两个物种的优良性状集中到一个个体,采用的是植物细胞工程的植物体细胞杂交技术。与传统的有性杂交相比,能进行有性生殖的生物之间不存在生殖隔离,而黄花烟草和革新一号烟草属于两个物种,可见植物体细胞杂交能在打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种等方面有优势。
(4)“太空烟草”不一定能稳定遗传,原因是: 　 。
【答案】　(4)如果“太空烟草”为纯合子,无性繁殖和有性繁殖都能稳定遗传;如果为杂合子,无性繁殖能稳定遗传,有性繁殖会出现性状分离;培养过程中也可能会发生基因突变,则“太空烟草”不能稳定遗传
【详解】　(4)通过无性繁殖技术能使性状稳定遗传,而能通过有性生殖稳定遗传的品种一般都是纯合子。“太空烟草”不一定能稳定遗传,如果“太空烟草”为纯合子,无性繁殖和有性繁殖都能稳定遗传;如果为杂合子,无性繁殖能稳定遗传,有性繁殖会出现性状分离;培养过程中也可能会发生基因突变,则“太空烟草”不能稳定遗传。
典型示范二
下图为细胞融合的简略过程,请据图回答:

(1)植物细胞工程常用的基础技术是　　　　　;动物细胞工程各技术手段的基础是　　　　　。
【答案】　(1)植物组织培养　动物细胞培养
【详解】　(1)植物细胞工程常用的技术手段有植物组织培养、植物体细胞杂交,其中植物组织培养是基础技术,动物细胞工程包含的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合等,其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
下图为细胞融合的简略过程,请据图回答:


(2)若图中甲、乙是植物细胞,在细胞融合之前应用 　　　处理,除去　　　　　;甲细胞、乙细胞到丙细胞的过程中,常用的化学试剂是　　　　　;融合成功的标志是　 　　　　　。
【答案】　(2)纤维素酶和果胶酶　细胞壁　聚乙二醇(或PEG)　再生出新的细胞壁
【详解】　(2)植物体细胞杂交前,先采用酶解法去除细胞壁,因此,若图中甲、乙是植物细胞,在细胞融合之前先采用纤维素酶、果胶酶处理除去细胞壁,获得原生质体;诱导甲细胞、乙细胞融合常用的化学方法是PEG诱导,此外还可通过物理的方法进行诱导;再生出细胞壁是原生质体融合完成的标志。
下图为细胞融合的简略过程,请据图回答:


(3)与植物细胞相比,动物细胞融合特有的方法是　 。
【答案】　(3)灭活病毒诱导法
【详解】　(3)诱导植物原生质体融合的方法有:物理方法(电融合法、离心法等);化学方法(聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法等)。诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。显然灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的方法。因此,与植物细胞相比,动物细胞融合特有的诱导融合的方法是灭活病毒诱导法。
下图为细胞融合的简略过程,请据图回答:


(4)若利用动物细胞融合技术来生产单克隆抗体,应将　　 和
　　　进行融合,融合后需经多次筛选,以得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞,第一次筛选一般利用　　　　　进行,第二次筛选需对细胞进行反复的克隆化培养和抗体检测,以筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
【答案】　(4)B淋巴细胞　骨髓瘤细胞　选择培养基
【详解】　(4)若利用动物细胞融合技术来生产单克隆抗体,应将经免疫的B细胞(效应B细胞)和骨髓瘤细胞融合,融合后需经多次筛选,以得到能产特异抗体的杂交瘤细胞,第一次筛选一般利用选择培养基(HAT培养基)进行,第二次筛选需对细胞进行反复的克隆化培养和抗体阳性检测,以筛选出能产特定抗体的杂交瘤细胞,然后在体外条件下大量制备单克隆抗体。
【重点归纳】　植物体细胞杂交实验的原理是细胞膜的流动性,操作流程为去除细胞壁后诱导原生质体融合,诱导细胞融合的方法有离心、电融合、聚乙二醇融合等,该方法的优点是克服远缘杂交不亲和,从而获得杂交植株。
单克隆抗体制备流程:先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应,之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞;诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞;进行抗体检测,筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞;进行克隆化培养,即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养;最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
变式训练二
2006年中国首例带有抗疯牛病转基因体细胞的克隆牛顺利降生。作为克隆牛,其培育过程如下图所示:

(1)细胞A是　　　　　,细胞B是　 　　　　　。
【答案】　(1)高度分化的体细胞　卵母细胞
【详解】　(1)细胞A是甲牛体内已高度分化的体细胞,细胞B是乙牛体内的卵母细胞。去核的卵母细胞可作为受体细胞。
2006年中国首例带有抗疯牛病转基因体细胞的克隆牛顺利降生。作为克隆牛,其培育过程如下图所示:

(2)一个重组细胞D发育成丁牛生出,涉及的细胞增殖方式是　　　　　　　　。
【答案】　(2)有丝分裂
【详解】　(2)一个重组细胞D发育成丁牛生出,属于个体发育,其涉及的细胞增殖方式只有有丝分裂。
2006年中国首例带有抗疯牛病转基因体细胞的克隆牛顺利降生。作为克隆牛,其培育过程如下图所示:

(3)丁牛的性别和　　牛的性别相同,原因是　 。
【答案】　(3)甲　牛的性别由细胞内的性染色体决定,丁牛的性染色体与甲牛相同
【详解】　(3)由于牛的性别由细胞内的性染色体决定,而丁牛的性染色体与甲相同,所以丁牛的性别和甲牛的性别相同。
2006年中国首例带有抗疯牛病转基因体细胞的克隆牛顺利降生。作为克隆牛,其培育过程如下图所示:

(4)培育抗疯牛病克隆牛所使用的技术手段是 　 。
【答案】　(4)动物细胞培养、核移植和胚胎移植、转基因技术
【详解】　(4)据图可知,培育抗疯牛病克隆牛所使用的技术手段是动物细胞培养、核移植和胚胎移植、转基因技术。
2006年中国首例带有抗疯牛病转基因体细胞的克隆牛顺利降生。作为克隆牛,其培育过程如下图所示:

(5)上述方法培育出克隆动物,与植物组织培养技术培育出完整的植株相比,获得的后代在遗传物质方面有什么不同
　 。
【答案】　(5)在遗传物质上(不考虑发育过程中的变异),植物组织培养形成的植株与提供体细胞的植株完全相同,克隆动物体内有卵母细胞细胞质的基因,所以克隆动物的遗传物质与提供体细胞核的动物不完全相同
【详解】　(5)上述方法培育出克隆动物,与植物组织培养技术培育出完整的植株相比,获得的后代在遗传物质上有区别。植物组织培养形成的植株与提供体细胞的植株完全相同,克隆动物体内有卵母细胞细胞质的基因,所以克隆动物的遗传物质,与提供体细胞核的动物不完全相同。
典型示范三
“试管婴儿”技术是指用人工的技术,将不孕夫妇的精子和卵细胞取出在试管中完成受精,并在试管中培养发育到一定时期,再将胚胎移入女性子宫内发育成胎儿。该技术实现了不孕夫妇当爸爸妈妈的愿望。目前,我国每年试管婴儿数量逾20万例次。试管婴儿的培育过程如图所示。回答下列问题。
(1)“试管婴儿”技术中体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。首先给不孕妻子注射　　　　　,使其超数排卵,并将冲出的卵子培养到　　　　　期,然后与获能的精子完成体外受精。
【答案】　(1)促性腺激素　减数第二次分裂中
【详解】　(1)促性腺激素能促进母体超数排卵。卵细胞则要培养到减数分裂第二次分裂中期(或MII中)才能与精子结合。
(2)受精卵早期发育有一段时间是在透明带内进行,这一时期称为　　　　　。当早期胚胎发育到桑椹胚期时,移植到妻子的
　　　　中继续完成胚胎发育。在植入前,通常取　　　　　阶段的滋养层进行基因检测等测试。
【答案】　(2)卵裂　子宫　囊胚
【详解】　(2)胚胎发育的早期有一段时间是在透明带内进行的,这一时期称为卵裂期,其特点是细胞分裂方式为有丝分裂,细胞数量不断增加,但胚胎的总体积并不增加,甚至略有缩小。
当早期胚胎发育到桑椹胚期时,移植到妻子的子宫中继续完成胚胎发育。目前,对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY-PCR法,即从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞,提取DNA进行检测。
(3)胚胎在植入前还要进行染色体检查,该项技术对人口优生的益处与对性别比例的潜在影响:①对优生的益处是及时发现染色体异常遗传病,有效规避该类遗传病;②对性别比例的潜在影响是 　 。
【答案】(3)非法进行胎儿性别鉴定,容易导致人口性别比例失衡
【详解】(3)胚胎在植入母体前可以进行染色体检查,该项操作对人口优生的益处是规避染色体遗传病;对性别比例的潜在影响是可能用于选择胎儿性别,非法进行胎儿性别鉴定,容易导致人口性别比例失衡。
(4)要得到“同卵双胞胎”,采用的技术是　　　　　,同卵双胞胎性别　　　　　(填“相同”或“不相同”)
【答案】　(4)胚胎分割　相同
【详解】　(4)来自同一个胚胎的后代具有相同的遗传物质,因此采用胚胎分割移植技术可获得“同卵双胞胎”。用这种方式诞生的双胞胎,其性别相同。
【重点归纳】　试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精,并通过培养发育为早期胚胎后,再经移植后产生后代的技术。胚胎分割时,一般采用发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。对囊胚期的胚胎进行分割时,要特别注意将内细胞团均等分割,否则会影响分割后的胚胎恢复和进一步发育。来自同一胚胎分割产生的后代具有相同的遗传物质,因此,胚胎分割可以看作动物无性繁殖(或克隆)的方法之一。
【答案】　(1)促性腺　同期发情　生理状态
【详解】　(1)图中①过程常用促性腺激素促进布朗瑞士奶牛超数排卵。在胚胎移植过程中为了使供、受体具有相同的生理状态,需要用激素对供、受体进行同期发情处理。
【答案】　(2)囊胚　滋养层
【详解】　(2)早期胚胎发育到囊胚期时出现内细胞团和滋养层细胞的分化,内细胞团将来发育为胎儿的各种组织,滋养层的细胞将来发育为胎膜和胎盘,因此在图中④胚胎移植前可以取囊胚期的滋养层的细胞进行性别鉴定,这样不影响胚胎的继续发育。
【答案】　(3)桑椹胚　囊胚　内细胞团　二
【详解】　(3)进行胚胎分割时,应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚,选择囊胚对其进行分割时要注意将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。到目前为止,仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高。
真题回顾
1.(2020·天津卷)某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进行预实验。

据表回答:
(1)Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体,原因是　 。
品种B
组织培养阶段 细胞分裂素浓度
(μmol/L) 生长素浓度
(μmol/L)
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ诱导生根 m3 n3
【答案】　(1)细胞分化程度低,容易诱导产生愈伤组织
【详解】　(1)在诱导愈伤组织形成时,通常采用茎尖、幼叶做外植体,因为这些部位的细胞分裂能力强、分化程度低,全能性容易表达,容易诱导产生愈伤组织。
1.(2020·天津卷)某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进行预实验。

据表回答:
(2)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是　　　　阶段。
品种B
组织培养阶段 细胞分裂素浓度
(μmol/L) 生长素浓度
(μmol/L)
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ诱导生根 m3 n3
【答案】　(2)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
【详解】　(2)Ⅰ过程愈伤组织形成是离体的植物细胞脱分化的结果,脱分化过程中细胞的结构和功能发生的明显改变,成为未分化状态;Ⅱ、Ⅲ过程形成幼芽、根的过程存在细胞的分化,分化和脱分化都存在基因的选择性表达,故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都存在基因的选择性表达。
1.(2020·天津卷)某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进行预实验。

据表回答:
(3)为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度,参照品种B的激素配比(m1>2.0),以0.5 μmol/L为梯度,设计5个浓度水平的实验,细胞分裂素最高浓度应设为　　　　　μmol/L。
品种B
组织培养阶段 细胞分裂素浓度
(μmol/L) 生长素浓度
(μmol/L)
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ诱导生根 m3 n3
【答案】　(3)m1+1.0
【详解】　(3)根据题意,表中数据为品种B的最佳激素配比,若要确定品种A的Ⅰ阶段最佳细胞分裂素浓度,以0.5 μmol/L为梯度,
可参考m1为中间值,故实验中细胞分裂素最高浓度可设为m1+1.0 μmol/L。
1.(2020·天津卷)某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进行预实验。

据表回答:
(4)Ⅲ阶段时,科研人员分别选用浓度低于或高于n3 μmol/L的生长素处理品种A幼芽都能达到最佳生根效果,原因是处理幼芽时,选用低浓度生长素时的处理方法为 　　　　　　　　,选用高浓度生长素时的处理方法为　 。
品种B
组织培养阶段 细胞分裂素浓度
(μmol/L) 生长素浓度
(μmol/L)
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ诱导生根 m3 n3
【答案】　(4)浸泡法(长时间处理)　沾蘸法(短时间处理)
【详解】　(4)实验中用生长素处理插条的方法可选用浸泡法或沾蘸法,浸泡法时间长、所需浓度低,而沾蘸法处理时间短、所需浓度高;因此Ⅲ过程中分别选用浓度低于或高于n3 μmol/L的生长素处理品种A的幼苗芽,选用低浓度生长素时的处理方法为浸泡法,时间长,而选用高浓度生长素时处理方法为沾蘸法,时间短,都能达到比较适宜的浓度,达到最佳生根效果。
1.(2020·天津卷)某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时,参照品种B的最佳激素配比(见下表)进行预实验。

据表回答:
(5)在　　　　　阶段用秋水仙素对材料进行处理,最易获得由单个细胞形成的多倍体。
品种B
组织培养阶段 细胞分裂素浓度
(μmol/L) 生长素浓度
(μmol/L)
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ诱导生根 m3 n3
【答案】　(5)Ⅰ
【详解】　(5)秋水仙素可抑制纺锤体形成,导致染色体加倍形成多倍体,愈伤组织分裂旺盛,故在Ⅰ阶段用秋水仙素处理,最易获得由单个细胞形成的多倍体。
2.(2020·全国Ⅰ卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

回答下列问题:
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是　 。
【答案】(1)诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞
【详解】(1)实验前给小鼠甲注射病毒A,是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。
2.(2020·全国Ⅰ卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

回答下列问题:
(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:　 。
【答案】　(2)取小鼠甲脾脏剪碎,用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞,加入培养液制成单细胞悬液
【详解】　(2)取小鼠的脾脏,剪碎组织,用胰蛋白酶处理获得单个细胞,加入培养液可以制成单细胞悬液。
2.(2020·全国Ⅰ卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

回答下列问题:
(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于　　　　　　　　,使用该培养基进行细胞培养的结果是　　　　　　　　　　。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是　 。
【答案】　(3)选择培养基　只有杂交瘤细胞能够生存　
抗原与抗体的反应具有特异性
【详解】　(3)图中筛选1需要用到选择培养基,只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞,该过程要用到抗原抗体杂交,故筛选所依据的原理是抗原—抗体反应具有特异性。
2.(2020·全国Ⅰ卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

回答下列问题:
(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有 　。(答出2点即可)。
【答案】　(4)将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养
【详解】　(4)获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,可以在体外培养液中进行培养,或在小鼠的腹腔中进行培养,使杂交瘤细胞大量增殖。
3.(2020·全国Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路,制备一种膀胱生物反应器来获得W,基本过程如图所示。


(1)步骤①中需要使用的工具酶有　　　　　　。步骤②和③所代表的操作分别是　　　　　　　　和　　　　　　　　。步骤④称为　　　　　　　　。
【答案】　(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶　显微注射　
早期胚胎培养　胚胎移植
【详解】　(1)由分析可知,步骤①为构建基因表达载体,需使用同种限制酶切割目的基因和运载体,再由DNA连接酶连接黏性末端,形成重组表达载体;步骤②为显微注射;步骤③为早期胚胎培养;步骤④为胚胎移植。
3.(2020·全国Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路,制备一种膀胱生物反应器来获得W,基本过程如图所示。


(2)与乳腺生物反应器相比,用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的 　 (答出2点即可)的限制。
【答案】　(2)性别、年龄
【详解】　(2)与乳腺生物反应器相比,用膀胱生物反应器生产W,可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
3.(2020·全国Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路,制备一种膀胱生物反应器来获得W,基本过程如图所示。


(3)一般来说,在同一动物个体中,乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息　　　　　(填相同或不同),原因是　 　 。
【答案】　(3)相同　
两种上皮细胞都是体细胞,且来源于同一个受精卵
【详解】　(3)在同一动物个体中,乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞,其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
3.(2020·全国Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路,制备一种膀胱生物反应器来获得W,基本过程如图所示。


(4)从上述流程可知,制备生物反应器涉及胚胎工程,胚胎工程中所用到的主要技术有 　 (答出2点即可)。
【答案】　(4)体外受精、胚胎移植
【详解】　(4)由分析可知,步骤③为早期胚胎培养,步骤④为胚胎移植,均属于胚胎工程;另外,体外受精也属于胚胎工程。
4.(2022·全国甲卷)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊,为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代,该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题:
(1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液,精液保存的方法是 　　　　　　　　　　。在体外受精前要对精子进行获能处理,其原因是　 　　　　　　　　　　　;精子体外获能可采用化学诱导法,诱导精子获能的药物是　　　　　　　　(答出1点即可)。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞,因为卵母细胞达到　 　　　　　　　　时才具备与精子受精的能力。
【答案】　(1)冷冻保存　刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力　
肝素或钙离子载体A23187　MⅡ中期
【详解】　(1)精液可以冷冻保存,使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力,故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法,化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中,用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期(MⅡ中期)才能具备与精子受精的能力。
4.(2022·全国甲卷)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊,为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代,该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题:
(2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行,该培养液的成分除无机盐、激素、血清外,还含的营养成分有　　　　　　　　　　(答出3点即可)等。将培养好的良种囊胚保存备用。
【答案】　(2)维生素、氨基酸、核苷酸
【详解】　(2)进行早期胚胎培养的培养液中,除了无机盐、激素、血清外,还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。
4.(2022·全国甲卷)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊,为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代,该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题:
(3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作,以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 　 。
【答案】　(3)对受体母羊进行发情处理,将保存的囊胚进行胚胎移植,对受体母羊进行是否妊娠的检查,一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代
【详解】　(3)要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料,获得具有该公羊优良性状的后代,主要是利用胚胎移植技术,即对受体母羊进行发情处理,将保存的囊胚进行胚胎移植,对受体母羊进行是否妊娠的检查,一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。(共65张PPT)
专题八　细胞工程和基因工程
专题突破
第2讲　基因工程
【思维导图】
【考点梳理】
考点1　基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(限制酶)——“分子手术刀”
①作用:切开磷酸二酯键。
②特点:识别双链DNA的特定核苷酸序列(识别序列,大多数由6个核苷酸组成),并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
③种类:EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶。
EcoRⅠ限制酶:中轴线两侧切开,产生黏性末端。

SmaⅠ限制酶:中轴线出切开,产生平末端。

同一种限制酶产生的粘性末端能进行碱基互补配对。
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用:恢复磷酸二酯键。
②结果:将两个DNA片段连接起来。

③种类:E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。
E.coliDNA连接酶:连接黏性末端。
T4 DNA连接酶:连接黏性末端和平末端,但连接平末端效率较低。
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
①种类:质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒等。
质粒:裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状DNA分子。
用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
②条件:结构小、能自我复制、具多个限制酶切位点、具标记基因(抗性基因)等。
考点2　基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的筛选与获取
①目的基因:用于改变性状的基因。
②筛选合适目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
③利用PCR获取和扩增目的基因。
原理:DNA半保留复制。
条件:DNA模板、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、2种引物。
过程

仪器:PCR扩增仪。
鉴定:琼脂糖凝胶电泳。
(2)基因表达载体的构建
启动子:紧挨转录起点,RNA聚合酶识别和结合的部位。
限制酶切割位点:插入目的基因的位置。
终止子:转录终点。
复制原点:DNA复制起点。
标记基因:可用抗性基因标记,便于重组DNA分子的筛选。
用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因和载体。
用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。
受体细胞 导入方法 注意事项
植物 花粉管通道法;农杆菌转化法 农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物
动物 显微注射
微生物 Ca2+处理 常用大肠杆菌
(4)目的基因的检测与鉴定
①分子水平检测:检测目的基因是否导入、转录、翻译。
用PCR、分子杂交技术检测目的基因是否导入和转录出mRNA。
用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出蛋白质。
②个体水平的鉴定(抗虫、抗病、活性鉴定等)。
考点3　基因工程的应用
●基因工程的目的:克服了远缘杂交不亲和的障碍,定向改造生物的遗传性状。
(1)农牧业方面的应用
培养具有抗虫、抗病、抗除草剂等抗逆能力的农作物。
改良植物的品质。
提高动物生长速度。
改善畜产品的品质。
(2)医药卫生方面的应用
生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等药物。
(3)食品工业方面的应用
生产食品工业用酶(凝乳酶、淀粉酶等)、氨基酸和维生素等。
考点4　蛋白质工程
(1)概念:以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。
(2)崛起的缘由:①基因工程原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。②天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要。
(3)基本原理:
天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的,而蛋白质工程却与之相反。
典型示范
α1-抗胰蛋白缺乏症是一种在北美较为常见的单基因遗传病,患者成年后会出现肺气肿及其他疾病,严重者甚至死亡。对于该致病患者常可采用注射α1-抗胰蛋白酶的方式来缓解症状。据此回答:
图1

图2
(1)图1表示获取α1-抗胰蛋白酶基因的两种方法,请回答下列问题:
①a过程是在　　　　　酶的作用下完成的,该酶的作用特点是　 。
②c过程需要的原料是　 。
【答案】　(1)①限制　识别特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA分子　②4种游离的脱氧核苷酸
【详解】　(1)①a过程表示直接获得目的基因的方法,该方法是在限制酶的作用下完成的,该酶的作用特点是识别特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA分子。②c过程表示逆转录,该过程的产物是DNA,需要的原料是4种游离的脱氧核苷酸。
(2)利用转基因技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵,最终培育出能在乳腺细胞表达α1-抗胰蛋白酶的转基因羊,从而更易获得这种酶,简要过程如图2所示。
①获得目的基因后,常利用PCR技术在体外将其大量扩增,其过程是高温变性解旋,低温复性　　　　　　　　,然后中温延伸,在Taq酶的作用下从引物开始进行互补链的合成。
②载体上绿色荧光蛋白(GEP)基因的作用是便于　　　　　。基因表达载体d,除图中的标示部分外,还必须含有　 。
【答案】　(2)①引物结合到互补DNA链上　
②筛选含有目的基因的受体细胞　启动子、终止子
【详解】　(2)①获得目的基因后,常利用PCR技术在体外将其大量扩增,其过程是高温使模板DNA 变性解旋为单链DNA,低温复性过程为引物结合到互补DNA链上,然后在中温条件子链延伸,即在Taq酶的作用下从引物开始进行互补链的合成。②载体上绿色荧光蛋白(GEP)基因是作为标记基因用的,用于筛选含有目的基因的受体细胞。基因表达载体d,除图中的标示部分外,还必须含有启动子、终止子,以便目的基因在受体细胞中正常表达。
(3)人类遗传病一般很难用药物治疗,基因治疗是指把正常基因导入病人体内进行治疗。目前基因治疗分为 　　　　　　　　　　　　　　　 两种方法。
【答案】　(3)体内基因治疗、体外基因治疗
【详解】　(3)基因治疗是指把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的。基因治疗分为体内基因治疗、体外基因治疗。
变式训练
图甲为人们利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图,实现基因工程操作通常使用到限制酶。图乙和图丙分别是表示SmaⅠ和EcoR Ⅰ酶切作用的示意图,回答下列相关问题:
图甲

图乙

图丙
(1)图甲中A表示　　　　　　　　,是通过②逆转录过程获得的,③④过程利用　　　　　技术获得大量的A。
【答案】　(1)cDNA(互补DNA)　PCR
【详解】　(1)图甲中的A是由mRNA逆转录而成cDNA。扩增目的基因可以采用PCR技术。
(2)图甲中C→D过程,通常采用　　　　法将含有　　　　的质粒导入大肠杆菌细胞内,在其细胞内表达人胰岛素。
【答案】　(2)Ca2+转化(CaCl2转化)　人胰岛素基因
【详解】　(2)将目的基因导入细菌,经常采用Ca2+转化法,题中的目的基因是人胰岛素基因。
(3)图乙中DNA分子经Sma Ⅰ限制酶切割后产生的DNA片段是　　　　　末端,若将切下来的DNA片段重新拼接起来,可选用
　　　　　　　　(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。已知Mun Ⅰ识别序列和切割位点是-C↓AATTG-,该酶切割DNA后所得末端与图丙所得末端　　　(填“能”或“不能”)用E.coli DNA连接酶连接起来。若能连接,得到的DNA分子不能再次被EcoR Ⅰ或Mun Ⅰ重新切割的原因是　　 。
真题回顾
1.(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题:
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是　　　　　,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
【答案】　(1)逆转录酶(反转录酶)
【详解】　(1)分析题意可知,新冠病毒的遗传物质是RNA,而RT-PCR法需要先得到cDNA,由RNA到DNA的过程属于逆转录过程,逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
1.(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题:
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的　　　　　来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是　 。
【答案】　(2)特异性核苷酸序列　退火(复性)
【详解】　(2)PCR过程需要加入引物,设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列,在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行;PCR过程每次循环分为3步,分别为变性(90~95 ℃)、复性(55~60 ℃)、延伸(70~75 ℃),故其中温度最低的一步是复性(或退火)。
1.(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题:
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明 (答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明　 。
【答案】　(3)曾感染新冠病毒,已康复　已感染新冠病毒,是患者
【详解】　(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测,若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明该个体曾经感染过新冠病毒,机体发生特异性免疫反应,产生抗体,将病毒消灭,则核酸检测为阴性,但由于抗体有一定的时效性,能在体内存在一段时间,故抗体检测为阳性;若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明该个体体内仍含有病毒的核酸,机体仍进行特异性免疫过程,能产生抗体,则说明该人已经感染新冠病毒,为患者。
1.(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题:
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　 。
【答案】　(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)
【详解】　(4)基因工程的基本操作流程是:获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定,结合题意,本基因工程的目的是获得大量的S蛋白,故具体流程为:获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)。
2.(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
↓　　　　　 ↓　　　　　 ↓　　　 ↓
GAATTC　CCCGGG　CTGCAG　GATATC
CTTAAG　GGGCCC　GACGTC　CTATAG
　　　↑　　　 ↑　　　 ↑　　　　　 ↑
限制酶:EcoRⅠ　SmaⅠ　PstⅠ　　　 EcoRⅤ
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
【答案】　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　
EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
【详解】　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端,限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端,E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来,而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体,可用于连接黏性末端和平末端,但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接,除了这两种限制酶切割的DNA片段,限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 　　　　　 。
【答案】　(2)磷酸二酯键
【详解】　(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　 　 。
【答案】　(3)自我复制　一至多个限制酶切位点　
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
【详解】　(3)质粒是小型环状的DNA分子,常作为基因表达的载体,首先质粒上含有复制原点,能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点,便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指 　 。
【答案】　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列,是RNA聚合酶识别及结合的部位,能驱动转录过程
【详解】　(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得需要的蛋白质。
3.(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 　　　　　　　(用数字序号表示)。
【答案】　(1)④②③①
【详解】　(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测,若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
3.(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(2)操作③中使用的酶是　　　　　。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　　　三步,其中复性的结果是　 。
【答案】　(2)Taq酶(热稳定DNA聚合酶)　延伸　
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
【详解】　(2)在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶),PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。
3.(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与 　　　　特异性结合。
【答案】　(3)病原菌的两条单链DNA
【详解】　(3)DNA复制需要引物,为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合。
3.(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指 　　　 ,该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【详解】(4)据分析可知,PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
4.(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,
Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA
(SgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题:
(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是　　　　　　　　。
【答案】　(1)DNA连接酶
【详解】　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 　　　　　　　　 。
【答案】　(2)感受态细胞法/Ca2+处理法
【详解】　(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
(3)过程③~⑤中,SgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是　　　　　　　　　　　　。随后,Cas9蛋白可切割
　　　　　　　　序列。
【答案】　(3)碱基互补配对　目标(目的)DNA(基因)
【详解】　(3)根据题图可知:在CRISPR/Cas9基因编辑技术中,
SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA,准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别,进而定位;由此可见,
Cas9在功能上属于限制酶,可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因,在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是　　　　　　　,基因敲除成功的判断依据是　 　 。
【答案】　(4)DNA分子杂交技术　经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交,若无杂交带,则敲除成功
【详解】　(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功,即利用经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交,若无杂交带,则敲除成功。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入到大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程: 　 。
【答案】　(5)表达Cas9蛋白和sgRNA,两者形成复合体;sgRNA识别并结合目标DNA序列;引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
【详解】　(5)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是SgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
5.(2021·广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有 　　　　　　　　　　。(答出两种即可)
【答案】　(1)基因文库中获取、人工合成法
【详解】　(1)分析题意,研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术,此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有 　 。(答出两种即可)
【答案】　(2)盐析法、酶解法或高温变性
【详解】　(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质,方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备　　　　　细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有　 。
【答案】　(3)感受态　抗原—抗体杂交技术
【详解】　(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备感受态细胞, 即利用钙离子处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中,酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质,常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
(4)依图所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是　　　　　　　　。在分子水平上,可以通过改变　　　　　　　　,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
【答案】　(4)有的酶失活而使反应中断　基因的碱基序列
【详解】　(4)依图所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和,若这些酶最适反应条件不同,则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上,可以通过改变基因的碱基序列,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
6.(2022·广东卷)“绿水逶迤去,青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
【答案】　(1)引物
【详解】　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因,首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物,引物与模板链结合后,Taq酶才能从引物的3'端延伸子链。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是 　　　 ,终止子的作用是　 。
【答案】　(2)作为标记基因,筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录,使转录在需要的地方停下来
【详解】　(2)基因表达载体中,抗生素抗性基因作为标记基因,可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞,终止子可终止转录,使转录在需要的地方停下来。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是 　 ,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
【答案】　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长
【详解】　(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,在这些酶蛋白的作用下,二氧化碳等气体大量用于合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长,所以会导致生长迟缓。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】　(4)废物的资源化　
不仅不排放二氧化碳,而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【详解】　(4)根据题意可知,这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料,实现了废物的资源化,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳,而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳,有利于减缓温室效应,并实现较高的经济效益,所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。

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