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考题分布 考查类型 命题分析
2020·山东·T25 基因启动子的定点编辑 通过近几年考题分析可知，PCR或基因编辑是每年的必考知识点，多数以对某种疾病的基因治疗、科研成果等为情境，考查利用PCR扩增DNA片段中引物的设计、限制酶的选择等内容
2021·山东·T25 PCR技术
2022·山东·T25 PCR技术
2023·山东·T25 PCR检测
2024·山东·T5 PCR技术
2024·山东·T25 PCR技术和基因编辑
1．PCR引物的设计
(1)引物长度要适宜：引物的长度一般为15～23 bp，常用的长度为18～21 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，过短则特异性差。
(2)引物GC含量要适宜
①引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其他三种碱基的错误引发效率相对小一些。
②3′端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45～55%，过高或过低都不利于引发反应。
③上下游引物的GC含量不能相差太大。
(3)引物自身及引物之间不应存在互补序列：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。
(4)引物5′端可以修饰，3′端不可修饰
①引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
②引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
③在引物的5′端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
2．常见特殊的PCR
(1)反向PCR技术
①原理：用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。
②过程：如图所示
实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。
(2)PCR定点突变
①重叠延伸PCR：如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
②大引物PCR：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
3．CRISPR-Cas9基因编辑
(1)Cas9蛋白特点：实质是一种限制酶，会用RNA来引导自己找到目标DNA。Cas9-RNA复合物会在DNA上不停“弹跳”，直到找到正确的位点。Cas9会附着到DNA上，检测邻近的序列是否和充当向导的RNA匹配。这种RNA叫作向导RNA(简称gRNA)，而只有当gRNA和DNA匹配时，Cas9蛋白才会对DNA进行切割。
(2)基因编辑的程序
1．某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A．利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增
C．dsred2基因和amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
C　解析：利用PCR 技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开 DNA 双链，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy 基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。
2．人血清白蛋白(HSA)是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用PCR 技术来大量扩增HSA基因，下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR 技术依据的原理是 DNA 半保留复制
B．扩增HSA 基因时，应选择图中的引物Ⅱ和引物Ⅲ
C．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是延伸
D．PCR 反应缓冲液一般要添加Mg2＋，用来激活 DNA 聚合酶
C　解析：PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使脱氧核苷酸序列呈指数方式增加，A正确；引物结合在模板链的3′端，使子链从5′→3′延伸，扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，故应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，B正确；PCR过程每次循环分为变性、复性和延伸3步，其中温度最低的一步是复性，C错误；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此在PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，D正确。
3．荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)，荧光监测系统随时接收荧光信号变化。下列叙述正确的有(　　)
A．图示引物与胞内DNA复制所用引物的化学本质相同
B．耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5′→3′
C．一段待扩增的DNA经过4次循环后，等长目标片段所占比例为1/3
D．反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈正相关
B　解析：细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的DNA链，A错误。耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5′→3′，所以子链延伸的方向也为5′→3′，B正确。
结合图示分析，若将目标片段设为X基因，该基因第一次复制得到两种：①和②(一条链带有引物，一条链为模板链)；X基因第二次复制得到四种：①复制得①和③、②复制得②和④(其中③、④带有两个不同的引物，但不等长)；X基因第三次复制得到五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤；⑤即为目标片段，占8/16＝1/2，C错误。由荧光定量PCR技术原理每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，并且每扩增一次，就有一个荧光分子生成推测，反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈负相关，D错误。
4．重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因，制备过程如下图所示。回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链，还需要加入______________________________________________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是______________________。
(2)从P2、P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是____________________________________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是____________________________________________________。②过程不需要加入引物，原因是__________________________________。
(3)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如下图所示。则融合基因最可能是__________，判断依据是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR体系中需要加入的物质有引物、模板链、耐高温的DNA聚合酶和dNTP(4种游离的脱氧核苷酸作为原料)、扩增缓冲液等等；PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA半保留复制。(2)LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的碱基之间能够结合在一起，从而将两个基因融合在一起；由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在同一个体系中进行，理由是引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程；②过程不需要加入引物，两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端。(3)PCR体系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2个DNA分子片段，其分子量较大。根据电泳图可知，3号DNA分子的分子量最大，因此3号DNA分子最可能是融合基因。
答案：(1)耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸、扩增缓冲液等　DNA半保留复制　(2)这两种引物的部分区域能进行碱基互补配对　P2和P3能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程　两条母链可作为合成子链的引物　(3)3　融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大
5．Cre酶是一种重组酶，loxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列，当一个DNA上存在两个相同的loxP序列且方向相同时，Cre酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。Cre/loxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。利用Cre/loxP重组酶系统敲除小麦细胞中某特定基因的过程如图1所示，回答下列问题。
(1)loxP序列的方向是由图1中的区域____(填序号)决定的。经Cre酶敲除后获得片段1和2游离的磷酸基团增加了______个。
(2)小麦细胞中不含Cre酶，需要导入Cre酶基因，图2质粒中部分片段序列及部分限制酶识别序列已标出。在用PCR技术获取Cre酶基因时，为了方便后续的剪切和连接，设计引物时会将限制酶识别序列加在Cre酶基因序列的两端，基因下游引物需要添加的限制酶识别序列为________________。使用双酶切的方法来构建基因表达载体的优点是_______________________________________。
(3)经检测导入成功后，抗除草剂基因若继续留在小麦体内可能会引发基因污染，可用Cre/loxP重组酶系统将标记基因敲除，不同的Cre酶可识别不同的loxP序列，图3为改造后的标记基因序列，启动子M可在花粉中特异性表达，改造的目的是____________________________________________，从而避免基因污染。在培育过程中可采取多种方法达到上述目的，比如外源α-淀粉酶基因可使含有该基因的花粉失去活性，请利用α-淀粉酶基因提出一条防止基因污染的措施。________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)loxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列，而loxP序列被Cre酶识别和切割的位点在Ⅱ区域，因此loxP序列的方向是由图1中的区域Ⅱ决定的。基因没有敲除前，DNA含有两个游离的磷酸基团，DNA敲除后产生了片段1环状DNA和片段2链状DNA，环状DNA不含游离磷酸基团，因此经Cre酶敲除后获得片段1和2，游离的磷酸基团增加了0个。(2)为了能将Cre酶基因和质粒连接形成重组DNA分子，两者需要含有相同的黏性末端，因此需要两种限制酶识别序列，结合图2可知，HindⅢ位于启动子处，不能切割，XbeⅠ在终止子两侧都有，不能选择XbeⅠ，因此能选择的是NdeⅠ和BamHⅠ，NdeⅠ靠近启动子一侧，添加在基因上游引物，BamHⅠ靠近终止子，添加在基因下游引物，因此基因下游引物需要添加的限制酶识别序列为5′-GGATCC-3′。若使用一种限制酶酶切，可能导致目的基因自身环化，目的基因和质粒反向拼接等，使用双酶切的方法来构建基因表达载体的优点是保证目的基因和质粒之间发生正确连接。(3)抗除草剂基因本身的作用是检测目的基因是否成功导入受体细胞，但若抗除草剂基因通过花粉传播给其他植物会导致基因污染，影响生态系统的相对稳定。由于外源α-淀粉酶基因可使含有该基因的花粉失去活性，因此将α-淀粉酶基因与抗除草剂基因导入细胞核的同一DNA分子中，可以使含有抗除草剂基因的花粉失去活性，从而避免基因污染。
答案：(1)Ⅱ　0　(2)5′-GGATCC-3′　保证目的基因和质粒之间发生正确连接　(3)防止抗除草剂基因通过花粉传播　将α-淀粉酶基因与抗除草剂基因导入细胞核的同一DNA分子中(共36张PPT)
专题十三　基因工程、生物技术的安全性与伦理问题
命题热点10　PCR与基因编辑
考题分布 考查类型 命题分析
2020·山东·T25 基因启动子的定点编辑 通过近几年考题分析可知，PCR或基因编辑是每年的必考知识点，多数以对某种疾病的基因治疗、科研成果等为情境，考查利用PCR扩增DNA片段中引物的设计、限制酶的选择等内容
2021·山东·T25 PCR技术
2022·山东·T25 PCR技术
2023·山东·T25 PCR检测
2024·山东·T5 PCR技术
2024·山东·T25 PCR技术和基因编辑
1．PCR引物的设计
(1)引物长度要适宜：引物的长度一般为15～23 bp，常用的长度为18～21 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，过短则特异性差。
(2)引物GC含量要适宜
①引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其他三种碱基的错误引发效率相对小一些。
②3′端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45～55%，过高或过低都不利于引发反应。
③上下游引物的GC含量不能相差太大。
(3)引物自身及引物之间不应存在互补序列：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。
(4)引物5′端可以修饰，3′端不可修饰
①引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
②引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
③在引物的5′端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
2．常见特殊的PCR
(1)反向PCR技术
①原理：用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。
②过程：如图所示
实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。
(2)PCR定点突变
①重叠延伸PCR：如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
②大引物PCR：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
3．CRISPR-Cas9基因编辑
(1)Cas9蛋白特点：实质是一种限制酶，会用RNA来引导自己找到目标DNA。Cas9-RNA复合物会在DNA上不停“弹跳”，直到找到正确的位点。Cas9会附着到DNA上，检测邻近的序列是否和充当向导的RNA匹配。这种RNA叫作向导RNA(简称gRNA)，而只有当gRNA和DNA匹配时，Cas9蛋白才会对DNA进行切割。
(2)基因编辑的程序
1．某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A．利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增
C．dsred2基因和amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
√
C　解析：利用PCR 技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开 DNA 双链，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy 基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。
2．人血清白蛋白(HSA)是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用PCR 技术来大量扩增HSA基因，下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR 技术依据的原理是 DNA 半保留复制
B．扩增HSA 基因时，应选择图中的引物Ⅱ和引物Ⅲ
C．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是延伸
D．PCR 反应缓冲液一般要添加Mg2＋，用来激活 DNA 聚合酶
√
C　解析：PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使脱氧核苷酸序列呈指数方式增加，A正确；引物结合在模板链的3′端，使子链从5′→3′延伸，扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，故应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，B正确；PCR过程每次循环分为变性、复性和延伸3步，其中温度最低的一步是复性，C错误；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此在PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，D正确。
3．荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)，荧光监测系统随时接收荧光信号变化。下列叙述正确的有(　　)
A．图示引物与胞内DNA复制所用引物的化学本质相同
B．耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5′→3′
C．一段待扩增的DNA经过4次循环后，等长目标片段所占比例为1/3
D．反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈正相关
√
B　解析：细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的DNA链，A错误。耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5′→3′，所以子链延伸的方向也为5′→3′，B正确。
结合图示分析，若将目标片段设为X基因，该基因第一次复制得到两种：①和②(一条链带有引物，一条链为模板链)；X基因第二次复制得到四种：①复制得①和③、②复制得②和④(其中③、④带有两个不同的引物，但不等长)；X基因第三次复制得到五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤；⑤即为目标片段，占8/16＝1/2，C错误。由荧光定量PCR技术原理每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，并且每扩增一次，就有一个荧光分子生成推测，反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈负相关，D错误。
4．重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因，制备过程如下图所示。回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链，还需要加入___________________________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是______________。
(2)从P2、P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是______________________________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_________________________________。②过程不需要加入引物，原因是____________________________。
(3)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如下图所示。则融合基因最可能是__________，判断依据是________________________________。
解析：(1)PCR体系中需要加入的物质有引物、模板链、耐高温的DNA聚合酶和dNTP(4种游离的脱氧核苷酸作为原料)、扩增缓冲液等等；PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA半保留复制。(2)LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的碱基之间能够结合在一起，从而将两个基因融合在一起；由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在同一个体系中进行，理由是引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程；②过程不需要加入引物，两条母链的起始
段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端。(3)PCR体系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2个DNA分子片段，其分子量较大。根据电泳图可知，3号DNA分子的分子量最大，因此3号DNA分子最可能是融合基因。
答案：(1)耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸、扩增缓冲液等　DNA半保留复制　(2)这两种引物的部分区域能进行碱基互补配对　P2和P3能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程　两条母链可作为合成子链的引物　(3)3　融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大
5．Cre酶是一种重组酶，loxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列，当一个DNA上存在两个相同的loxP序列且方向相同时，Cre酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。Cre/loxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。利用Cre/loxP重组酶系统敲除小麦细胞中某特定基因的过程如图1所示，回答下列问题。
(1)loxP序列的方向是由图1中的区域____(填序号)决定的。经Cre酶敲除后获得片段1和2游离的磷酸基团增加了______个。
(2)小麦细胞中不含Cre酶，需要导入Cre酶基因，图2质粒中部分片段序列及部分限制酶识别序列已标出。在用PCR技术获取Cre酶基因时，为了方便后续的剪切和连接，设计引物时会将限制酶识别序列加在Cre酶基因序列的两端，基因下游引物需要添加的限制酶识别序列为______________。使用双酶切的方法来构建基因表达载体的优点是_________________________________。
(3)经检测导入成功后，抗除草剂基因若继续留在小麦体内可能会引发基因污染，可用Cre/loxP重组酶系统将标记基因敲除，不同的Cre酶可识别不同的loxP序列，图3为改造后的标记基因序列，启动子M可在花粉中特异性表达，改造的目的是_______________________，从而避免基因污染。在培育过程中可采取多种方法达到上述目的，比如外源α-淀粉酶基因可使含有该基因的花粉失去活性，请利用α-淀粉酶基因提出一条防止基因污染的措施。___________________ ________________________________________________________。
解析：(1)loxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列，而loxP序列被Cre酶识别和切割的位点在Ⅱ区域，因此loxP序列的方向是由图1中的区域Ⅱ决定的。基因没有敲除前，DNA含有两个游离的磷酸基团，DNA敲除后产生了片段1环状DNA和片段2链状DNA，环状DNA不含游离磷酸基团，因此经Cre酶敲除后获得片段1和2，游离的磷酸基团增加了0个。(2)为了能将Cre酶基因和质粒连接形成重组DNA分子，两者需要含有相同的黏性末端，因此需要两种限制酶识别序列，结合图2可知，HindⅢ位于启动子处，不能切割，XbeⅠ在终止子两侧都有，不能选择XbeⅠ，因此能选择的是NdeⅠ和BamHⅠ，
NdeⅠ靠近启动子一侧，添加在基因上游引物，BamHⅠ靠近终止子，添加在基因下游引物，因此基因下游引物需要添加的限制酶识别序列为5′-GGATCC-3′。若使用一种限制酶酶切，可能导致目的基因自身环化，目的基因和质粒反向拼接等，使用双酶切的方法来构建基因表达载体的优点是保证目的基因和质粒之间发生正确连接。(3)抗除草剂基因本身的作用是检测目的基因是否成功导入受体细胞，但若抗除草剂基因通过花粉传播给其他植物会导致基因污染，影响生态系统的相对稳定。由于外源α-淀粉酶基因可使含有该基因的花粉失去活性，因此将α-淀粉酶基因与抗除草剂基因导入细胞核的同一DNA分子中，可以使含有抗除草剂基因的花粉失去活性，从而避免基因污染。
答案：(1)Ⅱ　0　(2)5′-GGATCC-3′　保证目的基因和质粒之间发生正确连接　(3)防止抗除草剂基因通过花粉传播　将α-淀粉酶基因与抗除草剂基因导入细胞核的同一DNA分子中

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