资源简介

(共31张PPT)
基因工程
基因工程的基本操作程序
【学习目标】
1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案
【重难点】
1.将目的基因导入受体细胞的具体操作方法。
2.目的基因的检测与鉴定的方法
目 录
基因表达载体的构建
01
03
目的基因的检测与鉴定
将目的基因导入受体细胞
02
01
基因表达载体的构建
（核心步骤）
基因表达载体的构建（核心步骤）
1.构建基因表达载体的目的：
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
思考：各原件的作用是什么？
基因表达载体的构建（核心步骤）
注意：启动子≠密码子
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
复制原点：
DNA复制的起始位点
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
目的基因插入到启动子和终止子之间
基因表达载体的构建（核心步骤）
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
翻译的起始信号(编码氨基酸)
使转录在所需要的地方停下来
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
目的基因上游
mRNA尾端
mRNA首端
目的基因下游
DNA
DNA
mRNA
mRNA
基因表达载体的构建（核心步骤）
3.基因表达载体的构建过程：
① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口
② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
③ 将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子
基因表达载体
基因表达载体的构建（核心步骤）
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
（1）构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ限制酶切割质粒？为什么？
不能；因为Sma Ⅰ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组DNA分子）
基因表达载体的构建（核心步骤）
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
（2）若只用EcoR Ⅰ限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？
质粒自身环化
正向连接
反向连接
目的基因多拷贝与质粒连接
基因表达载体的构建（核心步骤）
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
（3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？
使用 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA
双酶切法
优点：①避免质粒自身环化
②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接
基因表达载体的构建（核心步骤）
4. 限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ
至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ
基因表达载体的构建（核心步骤）
（3）确保出现相同黏性末端原则：
切割目的基因与质粒所选的限制酶应产生相同的黏性末端
①可以选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ
②为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
02
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞
根据受体细胞和载体的不同，所采用的导入方法也不同
1.植物细胞
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
受体细胞：受精卵或体细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
实质是基因重组
a. 能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力
b. 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
③ 利用农杆菌进行转化的思路：
②农杆菌特点：
受体细胞：受精卵或体细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞
将目的基因导入受体细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
农杆菌
植物细胞
表达载体
目的基因
Ti质粒
构建
转入
导入
插入
表达
（2）农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
2.动物细胞——显微注射法
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（2）过程
体积大
易操作
全能性高
易培养成完整个体
（1）受体细胞：受精卵
将目的基因导入受体细胞
3.微生物细胞——Ca2+处理法
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
大肠
杆菌
Ca2+
表达
载体
Ca2+ 处理法示意图
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+处理细胞
将重组的基因表达载体导入其中
这种细胞称为感受态细胞
（2）过程
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
（1）受体细胞：常用原核细胞（大肠杆菌应用最为广泛）
03
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
1.分子水平检测
提取
DNA
转基因棉花
PCR
是否扩增出目的基因
利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物
M：marker
1-6：转基因棉花
7：非转基因棉花
8：阴性对照
电泳
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因
（1）转基因生物的DNA上是否插入了目的基因——利用PCR等技术检测
目的基因的检测与鉴定
（2）目的基因是否转录出mRNA——利用PCR等技术检测
提取棉花细胞 mRNA
逆转录
得到 cDNA
用以 Bt 基因序列设计的
引物进行 PCR 扩增
电泳
检测
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录
如：检测 Bt 基因是否转录出 mRNA
目的基因的检测与鉴定
除PCR技术外，还可以利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录
原理：在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交（遵循碱基互补配对原则），若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA
DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
（3）目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交
如：检测 Bt 基因是否翻译出 Bt 抗虫蛋白
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质
目的基因的检测与鉴定
2.个体生物学水平鉴定
例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度
（2）基因工程产品的功能活性——比较基因工程产品与天然产品的功能活性
（1）生物体是否表达出目标性状及其表达水平——抗虫性、抗旱性、抗病性检测
目的基因的检测与鉴定
个体水平检测的具体方法及成功标志
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡
抗病毒（菌植物） 病毒（菌）接种实验 未染病
抗盐植物 浇灌一定浓度的盐水 正常生长
抗除草剂植物 喷洒一定浓度的除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常
课堂小结
组成：复制原点、启动子、终止子、目的基因、标记基因
利用个体生物学水平的检测目的基因是否表达
构建基因文库
通过化学方法人工合成
PCR技术扩增
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射法
Ca2+处理法
利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无
利用分子杂交技术检测目的基因是否转录
利用抗原-抗体杂交检查检测目的基因是否转录
目的基因的
筛选与获取
目的基因的
检测与鉴定
构建
基因表达载体
目的基因
导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
随堂练习
1.科学家在人类的基因组中发现36种病毒基因的片段,并提取相关基因片段进行扩增及电泳鉴定。下列叙述正确的是( )
A.用PCR仪进行扩增时,扩增缓冲液中一般要添加Ca2+
B.基因片段扩增过程中,脱氧核苷酸会依次加到引物的5'端
C.电泳时,在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的构象无关
D.将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时,要留一个加样孔加标准参照物
解析：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需Mg2+激活,因此,用PCR仪进行扩增时,扩增缓冲液中一般要添加Mg2+,A错误;基因片段扩增过程中,脱氧核苷酸会依次加到引物的3’端,B错误；电泳时,在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的大小、构象都有关,C错误；将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时,要留一个加样孔加指示分子大小的标准参照物,D正确
D
2.重组新型冠状病毒疫苗的制备原理是将新型冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)基因通过基因工程技术重组到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内，在体外大量表达出RBD二聚体，提取后制备成疫苗。下列叙述正确的是( )
A.CHO细胞作为新型冠状病毒的宿主细胞，提供病毒所需的营养物质
B.新型冠状病毒的RBD基因可以直接重组到CHO细胞的DNA分子上
C.体外培养重组CHO细胞时需添加适量的干扰素防止杂菌污染
D.要检测RBD基因在CHO细胞中成功表达，可用抗原-抗体杂交方法
解析：A、CHO细胞不是新型冠状病毒的宿主细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是基因工程的受体细胞，A错误； B、新型冠状病毒为RNA病毒，不能直接与CHO中的DNA重组，B错误； C、体外培养重组CHO细胞时需添加适量的抗生素，其目的是防止杂菌污染，C错误； D、可用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否成功表达出蛋白质，D正确
D
3.苏云金杆菌会合成Bt抗虫蛋白，在棉铃虫的碱性肠道环境中，Bt抗虫蛋白在特定酶的作用下产生毒性，导致棉铃虫死亡。我国科学家利用花粉管通道法成功培育出转Bt基因的抗虫棉。下列说法错误的是( )
A.可根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因
B.需要构建含Bt基因的基因表达载体，然后将基因表达载体导入棉花细胞
C.Bt基因可以整合到棉花染色体上，抗虫棉自交后代不会发生性状分离
D.Bt抗虫蛋白具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，在环境中易分解
解析：苏云金杆菌会合成Bt抗虫蛋白，所以可以根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因，A正确；为了使Bt基因能够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体，然后将基因表达载体导入棉花细胞，B正确；Bt基因可以整合到棉花染色体上，由于只有1条染色体上含有抗虫基因，因此该抗虫棉自交后代会发生性状分离，C错误;Bt抗虫蛋白在特定酶的作用下产生毒性，具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，其本质是蛋白质，所以在环境中易分解，D正确
C
4.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 若用Pvu Ⅰ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph Ⅰ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误
D

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