资源简介

(共34张PPT)
基因工程
基因工程的基本操作程序
【学习目标】
1.简述目的基因的筛选和获取方法
2.简述PCR的原理、条件及过程
【重难点】
利用PCR获取和扩增目的基因
目 录
目的基因的筛选与获取
01
DNA片段的扩增及电泳鉴定
02
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
从社会中来
01
目的基因的筛选与获取
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的
目的基因——Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因
主要指编码蛋白质的基因
目的基因的种类：根据需求的不同，目的基因也不同，如生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因
那么，如何筛选与获取目的基因呢？
第一步：目的基因的筛选与获取（筛选合适的目的基因）
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBanK）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能
从相关的已知结构和功能清晰地基因中进行筛选是较为有效的方法
第一步：目的基因的筛选与获取
1.通过化学方法直接人工合成目的基因
获取目的基因的方法
DNA合成仪
要求：①基因比较小
②核苷酸序列已知的基因
2.通过构建基因文库获取目的基因
基因文库种类：①基因组文库（包含一种生物的所有基因）
②部分基因文库（只包含一种生物的部分基因，如cDNA文库）
第一步：目的基因的筛选与获取
拓展：基因文库的构建过程
某生物体全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与载体连接、导入
受体菌群体
cDNA
某生物体发育的某个时期的mRNA
逆转录
与载体连接、导入
基因组文库
cDNA文库
第一步：目的基因的筛选与获取
3.利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
苏云金杆菌
Bt基因
？
快速获得大量Bt基因
提取
前提：已知目的基因或其上下游的核苷酸序列
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
（长度通常为20-30个核苷酸）
⑴ 全称：聚合酶链式反应
⑵ 原理：DNA的半保留复制（在体外大量复制目的基因的核苷酸序列）
⑶ 原料：DNA模版、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取
复习回顾：DNA复制
碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）
(2)条件:
4种游离的脱氧核苷酸
DNA的两条链
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
ATP
(3)复制原则:
能量：
模板：
原料：
酶：
半保留复制、边解旋边复制
(1)特点:
合成子链
解旋
形成新DNA
解旋酶
DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取
DNA复制和PCR反应的条件对比
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸（dNTP)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常为小的单链DNA至少需要2种引物）
反应还需要其它条件，如控温系统、缓冲液（一般添加Mg2+）---能够调节pH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取
（5） PCR扩增的过程
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变性
双螺旋解开
PCR仪
①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链
第一步：目的基因的筛选与获取
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
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复性
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两种引物
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注意：复性温度过高会破坏引物与模板碱基互补配对
复性温度过低，会造成引物与模板结合位点增加，导致非特异性产物增加
第一步：目的基因的筛选与获取
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
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延伸
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第一步：目的基因的筛选与获取
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第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物
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第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物
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第一步：目的基因的筛选与获取
（6） 结果与鉴定
①结果：重复循环多次，每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数
水平电泳仪
②鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理
PCR利用了DNA热变性和DNA半保留复制的原理。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.材料用具
（1）试剂
①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
③PCR反应体系的配方(见教材)
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）用具
①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
PCR仪
微量离心管
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
（2）离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
（3）扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
4.方法步骤（PCR）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.方法步骤（电泳鉴定）
（1）配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
（2）制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（3）加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
（4）电泳、观察：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5. 结果分析与评价：
（1）你是否成功扩增出 DNA 片段的断依据是什么？
在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度（条带的分布代表扩增产物的类型；条带的粗细代表扩增产物量的多少）。
（2）通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的DNA 片段？为什么？
不能；因为电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现碱基序列。
课堂小结
目的基因的
获取与筛选
筛选合适的目的基因
获取目的基因
测序技术、序列数据库、序列对比工具
利用化学方法人工合成目的基因
通过构建基因文库获取目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
随堂练习
1.下列不属于获取目的基因的方法的是( )
A.从基因组文库中获取目的基因
B.利用PCR技术体外扩增目的基因
C.利用逆转录法获取目的基因
D.利用DNA连接酶复制目的基因
答案：D 解析：获取目的基因的方法有：从基因组文库中获取目的基因、利用PCR技术体外扩增目的基因、利用逆转录法获取目的基因等。DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，利用DNA连接酶不能复制目的基因，故选D。
随堂练习
2.传统的多重PCR（MPCR）是在普通PCR的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区段进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段的技术。随着科学技术的发展，MPCR技术在扩增方面取得新的突破，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分散于相应独立的空间中进行扩增。下列相关叙述错误的是( )
A.对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补
B.同一反应体系中扩增不同模板时需加入更多耐高温的DNA聚合酶才能使扩增正常进行
C.在目的DNA片段扩增时，若复性阶段温度控制过高，可能导致无产物
D.PCR扩增DNA时打开双螺旋的方式与细胞内不同，实质都是磷酸二酯键断裂
解析：A.对同一模板不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补就会形成双链，不能与模板链结合，不能完成扩增，A正确；B.在同一反应体系中扩增不同模板时需要加入更多耐高温的DNA聚合酶才能使扩增正常进行，因为扩增不同片段需要结合的酶的数量较多，B正确；C.在目的片段扩增时，温度的控制是实验成败的关键，若复性阶段温度控制过高，导致引物不能与模板链结合，可能导致无产物，C正确；D.PCR扩增DNA时通过高温将双螺旋打开，而细胞内进行DNA复制通过解旋酶将双螺旋打开，二者断裂的都是氢键，D错误。
D
随堂练习
3.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述正确的是( )
A.环化阶段,可选E.coli DNA连接酶而不能选T4DNA连接酶
B.图中环状DNA进行PCR的过程中,沿左侧引物延伸子链的方向是逆时针
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子,其中含有EcoR I的酶切位点
D.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
答案：B 解析：图示末端为黏性末端,所以环化阶段,可选E.coli DNA连接酶也能选T4DNA连接酶,A错误。据图中未知序列的位置可知,图中环状DNA进行PCR的过程中,沿左侧引物延伸子链的方向是逆时针,沿右侧引物延伸子链的方向是顺时针,B正确。根据题意和图示可知,DNA分子被限制酶EcoR I切割后环化,再通过PCR扩增得到包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子;未知序列含有EcoR I的切割位点,故PCR产物含有EcoR I的酶切位点, C错误。DNA子链合成的方向是5'→3',要通过已知序列设计引物,应选择引物1和引物4进行PCR扩增,D错误。
随堂练习
4.荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针（一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段），当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A.该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量
B.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
C.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物
D.该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键
答案：D 解析：A、利用荧光定量PCR技术可以进行DNA的含量测定，模板DNA越多，荧光信号越强，而新冠病毒的核酸为RNA，无法直接用该技术检测，A错误；
B、荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分子，一共会生成1+2+4=7个荧光分子，B错误；
C、1个双链DNA分子经过5轮循环一共会形成32个DNA分子，即形成64条链，其中62条链都是新合成的，一共需要消耗31对引物，C错误；
D、子链延伸时DNA聚合酶可在子链的3'端不断添加脱氧核苷酸，从而形成磷酸二酯键，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶可以利用5'-3'外切酶活性水解DNA单链探针的一端，使其有关基团出现荧光，D正确。

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