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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养
高中生物学 | 人教版（2019）| 选择性必修3·生物技术与工程
【本节聚焦】
1.动物细胞培养需要哪些基本条件？
2.动物细胞培养的基本操作过程是什么？
3.怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险
科技探索之路:动物细胞工程(含胚胎工程）的发展历程
首例胚胎移植成功
首创动物组织体外培养法
发现哺乳动物精子获能现象
体细胞核移植成功
试管家兔诞生
创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
分离和培养小鼠胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
——动物细胞培养
——干细胞培养
动物细胞培养（基础）
动物细胞融合技术和单克隆抗体
动物体细胞核移植技术和克隆动物
1. 动物细胞培养的条件
2. 动物细胞培养的过程
3. 干细胞培养及应用
动物细胞工程
一、动物细胞培养的概念和原理
1. 概念：
从动物体中取出 ，将它分散成 ，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞 的技术。
相关的组织
单个细胞
生长和增殖
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散成
适宜条件
2. 原理：
有丝分裂（细胞增殖）
3. 目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体
幼龄动物or老龄动物？为什么
细胞分化程度低，分裂能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
思考：体外培育皮肤细胞实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养。你还记得为了维持正常的生命活动，机体给细胞提供了哪些适宜的条件吗？
动物细胞培养的
条件
营养物质
稳定的
内环境
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
通常添加葡萄糖，不包括淀粉、蔗糖等
二、动物细胞培养的条件
思考1：机体给细胞提供了充足的营养和稳定的内环境。体外培养皮肤细胞需要满足什么条件？
充足的营养
稳定的内环境
①已知成分
将细胞所需的________（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按其_____和_______严格配制而成的培养基，称为___________
②未知成分
使用合成培养基时，通常需加入____等一些天然成分
原因：_ ______________________________________
营养物质
种类
所需量
合成培养基
血清
血清中含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
2.无菌、无毒的环境
思考1：如何创造无菌环境？
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
无毒
③定期更换培养液
目的
目的：以便清除代谢物，
防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害。
思考2：离体培养的细胞对微生物没有防御能力
如何防止培养过程中的微生物污染
④可添加一定量的抗生素
二、动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
3.适宜的温度、pH、渗透压
与相应动物内环境的理化性质保持一致。
①人体细胞外液的温度一般维持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血浆近中性，pH约为：
7.35~7.45
③渗透压：
在37℃时，人的血浆渗透压约为：
770 kPa
人体？
（1）适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜；
36.5±0.5℃
（2）适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为 ；
7.2-7.4
（3）适宜的渗透压：
目的 。
维持细胞正常的形态和功能
指溶液中溶质微粒对水的吸引力。
二、动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
4.气体环境
（1）气体组成及作用：
O2
CO2
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）培养工具：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
二、动物细胞培养的条件
1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？
可用什么方法？
2.体外培养动物细胞有哪些类型？
3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
4.什么是原代培养和传代培养？
5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？
请同学们自主阅读教材P44-45，小组合作思考讨论完成问题：
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养瓶或培养皿进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
三、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
一般取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
(1)对象:
(2)原因:
1.取动物组织
三、动物细胞培养的过程
2.分散成单个细胞
(1)原因：
①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。
②利于细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
(2)方法：
用机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
3.制成细胞悬液
方法：用培养液将细胞制成细胞悬液。
三、动物细胞培养的过程
4.原代培养
(1)体外培养的动物细胞类型
①悬浮细胞：
②贴壁细胞：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。
（大多数细胞属于这种类型）
这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
——细胞贴壁
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
3.制成细胞悬液
方法：用培养液将细胞制成细胞悬液。
三、动物细胞培养的过程
4.原代培养
(2)细胞增殖受阻的原因
①悬浮的细胞：
②贴壁细胞：
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。
肿瘤细胞
失去接触抑制
适宜条件下在培养液可以无限增殖下去。
癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
正常细胞
平面观
瓶壁上的细胞层数是：
一层（或单层）
癌变细胞失去接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
思考2：如何解决细胞分裂受阻？
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
思考1：接触抑制的原因是什么？
所有细胞都能有这种现象？
——传代培养
拓展
三、动物细胞培养的过程
判断依据：是否分瓶！
(1)原代培养：
(2)传代培养：
分瓶前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养。
分瓶后的细胞培养。
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
5.分瓶、传代培养
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
5.分瓶、传代培养
（3）收集细胞的方法
三、动物细胞培养的过程
①悬浮培养的细胞：直接用离心法收集；
②贴壁细胞：重新用胰蛋白酶等处理,使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。
①第一次使用：使组织细胞分散开；
②贴壁细胞传代培养时使用：使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
（4）胰蛋白酶作用
1、进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？
P44旁栏思考：
蛋白质
用胃蛋白酶行吗？
不行，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2～7.4，此环境下胃蛋白酶(1.5～2.0)没有活性，而胰蛋白酶(7.2～8.4)的活性较高。
2.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？
胰蛋白酶除了可以水解细胞间的蛋白外，长时间的作用也会水解细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的处理时间。
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
悬浮细胞
贴壁细胞
(大多数）
细胞密度过大、
有害代谢物积累、
营养物质缺乏等
接触抑制
细胞分裂受阻
解决方法
分瓶培养
小结：动物细胞培养过程
（4）传代培养：
细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上
相关概念
（1）细胞贴壁：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
（2）接触抑制：
（3）原代培养：
分瓶后的细胞培养。
指动物组织经处理后的初次培养。
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
如何界定原代培养和传代培养？
遗传物质改变
遗传物质有的改变
洗涤、稀释、分瓶培养
多数细胞固定在表面生长和分裂
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
有关动物细胞培养的问题
思考 讨论
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养 为什么
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，
幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。
所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。
同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养结果
相同点
固体培养基
新的植株
葡萄糖、动物血清
液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
大量新细胞或细胞产物
蔗糖、植物激素
①培养过程中细胞都进行有丝分裂；
②均需无菌操作，适宜的温度、pH等条件。
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
总结：植物组织培养和动物细胞培养的比较
三、动物细胞培养的过程
课堂小结
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
(1)营养条件
(2)无菌、无毒的环境
(3)温度、pH和渗透压
(4)气体环境
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　)
(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)
(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　)
(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(　　)
没有发育成完整个体
课堂练习
×
√
1.判断正误
×
√
接触抑制
1.什么是干细胞？它有哪些类型？这些类型的干细胞各有怎样的特点和哪些方面的应用？
2.科学家是怎样获得iPS细胞的？这种细胞与胚胎干细胞相比，有哪些应用优势？
3.干细胞应用于临床治疗可能存在什么问题？
4.你如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
阅读教材P46，思考并回答下列问题：
四、干细胞培养及其应用
1.胚胎干细胞(ES细胞)
(1)分布：
(2)特点：
(3)应用实例：
(4)局限性：
存在于 中
具有分化为成年动物体内的 的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至 的潜能。
目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
胚胎干细胞必须从 中获取 ，涉及伦理问题，因而限制了在医学上的应用。
早期胚胎
任何一种类型
个体
胚胎
(1)分布：
(3)特点:
(2)常见类型
组织或器官内
造血干细胞
神经干细胞
精原干细胞
发现最早
研究最多
应用最成熟
具有 性，只能分化成 细胞或组织， 发育成完整个体的能力。
成体
（骨髓、外周血和脐带血中）
（神经系统中）
（睾丸中）
组织特异
特定的
不具有
(4)作用:
有着自我更新能力 及分化潜能的干细胞，与组织、器官的 、 和
等密切相关。
发育
再生
修复
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞→
神经干细胞→
四、干细胞培养及其应用
2.成体干细胞
(1)概念：
通过 诱导小鼠 细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞。
(2)应用：
(3)优势：
①诱导过程 破坏胚胎；
② 理论上可以避免 反应。
体外
成纤维
（该过程类似于植物组织培养中的脱分化）
无须
免疫排斥
所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
四、干细胞培养及其应用
3.诱导多能干细胞（iPS细胞）
①用iPS细胞治疗了小鼠的 ；
②用iPS细胞治疗 等领域的研究也取得了新进展。
镰状细胞贫血
阿尔茨海默病、心血管疾病
(4)制备方法：
①借助载体将 导入细胞；②直接将 导入细胞；
③用 来诱导形成。
特定基因
特定蛋白
小分子化合物等
(5)来源：
成纤维细胞、T细胞、B细胞等
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
（阅读P46—47，完成表格）
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
面临的问题:存在着导致肿瘤发生的风险。
胚胎发育过程中不同干细胞分化过程：
受精卵→全能干细胞→多能干细胞→专能干细胞
四、干细胞及其应用
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
(1)营养条件
(2)无菌、无毒的环境
(3)温度、pH和渗透压
(4)气体环境
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
干细胞培养及其应用
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
课堂小结
练习与应用
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
一.概念检测
×
√
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
用于治疗不孕症；进行濒危物种的克隆研究。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分
别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可
能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二.拓展应用

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