资源简介

(共34张PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
目的基因
受体细胞
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
基因通常是有遗传效应的DNA片段
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
基因的结构
1.原核生物的基因结构
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
连续的、不间隔的
RNA聚合酶识别并结合的位点，
驱动基因转录出mRNA。
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
1.原核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
终止转录。
终止子
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
2.真核生物的基因结构
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
内含子
外显子
外显子
内含子
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
2.真核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
原核生物 真核生物
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都有能够编码蛋白质的 和 具有调控作用的 区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
非编码序列
=非编码区
原核基因
非编码序列
真核基因
=非编码区+内含子
1.从基因文库中获取
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
②cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
(cDNA)
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，
cDNA文库中的基因不含以上结构。
与载体连接
导入受体菌群
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
某一发育时期
二、目的基因的获取方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
1.从基因文库中获取
2.通过DNA合成仪直接合成
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
PCR——聚合酶链式反应
参与的组分 在PCR的作用
目的基因DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
缓冲液
Mg2+
高温
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（两种）
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
维持反应体系的pH
激活DNA聚合酶的活性
体外DNA复制所需的基本条件
第1步：变性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
当温度超过90℃时，
双链DNA解旋为单链。
95℃
PCR的过程
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
引物A
引物B
扩增一次
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
扩增两次
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
出现完整的目的基因
扩增三次
中长链-短链DNA____个
6
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
15
15
短链-短链DNA______个
8
扩增四次
扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR相关计算
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子数为：___个
②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个
③子代含有的目的基因数目：_____个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物_______个
⑥第n次复制需要引物___个
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
2n-2n
二、基因表达载体的构建
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
目的基因
基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子
注意事项
1.基因工程中的基因表达载体≠载体：
基因表达载体与载体相比增加了 。
2.目的基因插入位点不是随意的：
第三步.将目的基因导入受体细胞
一、常用的受体细胞
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
二、将目的基因导入受体细胞的方法
1.植物细胞：
2.动物细胞：
3.微生物细胞：
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2+处理法（感受态细胞法）
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
花粉管通道法—植物细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
双子叶、裸子植物
受损
伤口分泌酚类物质和糖类物质
吸引农杆菌向受伤组织集中
将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。
激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移
农杆菌转化法过程
（2）农杆菌转化法
__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒
重组Ti质粒转入__________
转化植物细胞
目的基因插入植物细胞中的________________上
目的基因在植物细胞中稳定存在并__________
表达
目的基因
T-DNA
农杆菌
染色体DNA
(1)第一次拼接
______________________________________________________________________
(2)第二次拼接
______________________________________________________________________
(3)第一次导入
_____________________________________________________________________
(4)第二次导入
____________________________________________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
03
将目的基因导入受体细胞
据图回答问题：
第1次拼接
第2次拼接
第1次导入
第2次导入
该过程经过____次拼接、____次导入？
显微注射法—动物细胞
目的基因的表达载体
显微注射
到受精卵中
受精卵发育
获得具有新性状的动物
显微注射技术
①体积大，易操作
②全能性高
Ca2+处理法--- 原核细胞
（1）使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（2）过程
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
感受态
繁殖快，结构简单
大肠杆菌（p82）
检测是否插入目的基因
检测目的基因是否转录
检测目的基因是否翻译
基因表达的过程
生物是否具有新性状
第四步：目的基因的检测和鉴定
分子水平的检测
个体生物学水平的检测
DNA
蛋白质
mRNA
性状
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
目的：
检测内容：
分子水平的检测
（1）基因是否插入(DNA)
（2）目的基因是否转录(mRNA)
方法：
1.PCR技术
2.分子杂交技术
需逆转录为cDNA再进行PCR鉴定
探针
32P
变性
变性
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
32P
目的DNA
目的RNA
（3）目的基因是否翻译
方法:
抗原-抗体杂交技术
个体生物学水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫
害虫死亡
病毒感染（病毒接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长

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