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(共18张PPT)
PCR的应用
基因工程拓展
2025/3/26
连接两个DNA片段
1.重叠延伸PCR
A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果
B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基
C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右
D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因
1.下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。分析不正确的是(　　)
练习
C
定点突变
1.重叠延伸PCR
1.逆转录PCR
mRNA 、RNA病毒
RNA酶消化
2.热启动PCR
55℃
0℃
减少反应起始时引物错配形成的产物
3.降落PCR
从模板上扩增
扩增先前的PCR产物
第一阶段：扩增18-20个循环
第二阶段：扩增20-25个循环
提高特异性扩增
4.巢式PCR
模板
使用外引物，进行第一次PCR
使用内引物，进行第二次PCR
第一次PCR产物
第二次PCR产物
提高特异性扩增
切胶回收
纯化目的产物
5.定量PCR
实时定量检测PCR扩增产物
染料法
TaqMan探针法
游离的染料几乎不产生荧光，
和双链DNA结合后发射强荧光。
探针完整时，不产生荧光；探针被Taq酶水解，R与Q分离，发出荧光。
5.定量PCR
实时定量检测PCR扩增产物
循环数
荧光强度
Ct值
Ct值：荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数
阈值
1. 样本中初始模板数量越多，Ct值越 。
2.若A样本Ct值为20，B样本Ct值为30，则A样本和B样本中模板DNA的比值为 。
检测样本CT如果值小于或等于30，且指数增长期明显，则检测结果呈阳性，表明患有新型冠状病毒。
练习
6.反向PCR
扩增已知序列两侧的未知序列
限制酶切
自身环化
反向PCR
测序
已知序列
未知序列

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