资源简介

热点七 紫杉醇生物合成
【命题热点】
紫杉醇是全球销量第一的植物抗癌药物，而且随着癌症防治需求的日益增加，紫杉醇成为全球销量第一的植物抗癌药，预期其市场规模在2030年以后将达到近千亿人民币规模。自从1971年鉴定化学结构以来，紫杉醇已发展成为同青蒿素齐名的、教科书级别的经典植物天然产物的代表。半个世纪以来，紫杉醇生物合成途径依然未被完全解析，成为科学界一直关注的难点。
近日，中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所（以下简称“基因组所”）领衔，联合北京大学、清华大学等国内外六家单位在国际顶级学术期刊Science以长文形式发表了题为“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III”的研究论文。该工作在研究团队前期绘制的高质量红豆杉基因组的基础上，成功发现了紫杉醇生物合成途径中最具挑战的未知酶，阐明了颠覆传统认知的植物含氧四元环结构的形成机制，建立了紫杉醇生产前体巴卡亭III的异源生物合成路线。该研究成果解决了紫杉醇生物合成的世纪难题，突破了合成生物学技术实现紫杉醇绿色可持续生物制造的关键瓶颈。
紫杉醇的生产高度依赖关键前体化合物巴卡亭III的植物提取。紫杉醇来源于珍稀濒危裸子植物红豆杉。红豆杉是我国一级珍稀濒危保护植物，素有“植物大熊猫”之称。我国紫杉醇原料药主要依靠人工种植的红豆杉植物提取紫杉醇前体结合化学半合成获得。通过采集人工培育的红豆杉枝叶等材料，利用多种萃取和分离方法，提取紫杉醇前体分子，包括巴卡亭Ⅲ或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ，再通过简单的化学合成过程，即在前体分子的C13位接上一条化学合成的侧链，从而生产紫杉醇原料药。其中，化学半合成过程技术成熟，成本可控，因此，关键前体物质巴卡亭III的稳定获取是决定紫杉醇生产成本的关键。由于前体巴卡亭III的提取高度依赖有限的红豆杉植物资源，而且红豆杉生长速度缓慢，一般成树需要几十年甚至上百年，同时紫杉醇类物质在红豆杉植物中的含量极低，这些因素造成了紫杉醇药物生产成本高昂，让我国人民不得不承受昂贵的治疗费用，而且药物供给很难满足我国日益严峻的癌症防控的需要，还容易引发生态破坏和耕地占用等诸多问题。
紫杉醇生物合成途径解析与异源重建是解决紫杉醇供应不足和打破国际技术垄断的关键突破口。由于红豆杉植物的稀缺性及紫杉醇药物的不可或缺性，世界各国，尤其是癌症大国都在积极推动相关研究与产业发展。特别是美国，自上世纪60年代开始至今，一直主导着紫杉醇的科技前沿，美国科学家们最早从红豆杉分离和鉴定了紫杉醇，首次阐明了紫杉醇的独特抗癌机理，成功开发了巴卡亭III生产紫杉醇的半路线等。当前，随着合成生物学与绿色生物制造技术的发展，将红豆杉中编码巴卡亭III合成的基因导入微生物或植物底盘中进行异源生产，成为最具潜力的紫杉醇可持续生产路线。可是，自紫杉醇发现以来的半个世纪里，共鉴定出近20个紫杉醇合成相关基因，全部由欧美研究团队主导完成。最先进的紫杉醇提取技术、核心的红豆杉细胞生产技术和基因工程技术等，依然牢牢掌控在欧美制药公司的手中，如美国的百时美施贵宝制药公司，法国的赛诺菲公司，德国Phyton公司等。我国要在紫杉醇绿色制造的道路上走的好，满足人民群众的健康需要，只能也必须靠自主研发，迎难而上。
打通紫杉醇的生物合成途径成为世界难题。自1971年首次确定紫杉醇结构以来，阐明其生物合成途径一直是天然产物研究中的一项挑战性任务。紫杉醇的生物合成途径高度复杂，需要经历多次羟化、酰化、环氧化等酶促反应，才能最终形成。一般认为，紫杉醇的生物合成途径涉及20步酶促反应。其生物合成途径可分为三个关键过程，首先从底物香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）形成带有三环二萜的紫杉烷骨架（包含4(20)-烯-5α-醇结构单元），再通过独特的氧杂环丁烷化作用及酰基化作用形成巴卡亭III，最后将苯基异丝氨酸侧链连接到巴卡亭III的C13位置生成紫杉醇。其中侧链的形成及其与巴卡亭III结合产生紫杉醇的过程已清晰，但形成巴卡亭III 的几个关键步骤仍然未知，尤其是负责氧杂环丁烷环的形成和C9的氧化的通路酶。因此，缺失的酶使得紫杉醇生物合成的上下游途径无法联系起来，导致半个世纪以来，还没有科学家解析完整的紫杉醇生物合成途径，使其成为领域内的重大难题。
突破之路，始于首张南方红豆杉基因组蓝图。为了解开这一难题，基因组所闫建斌研究员领衔于2021年率先绘制国际首张染色体级别的南方红豆杉高质量参考基因组图谱，鉴定出红豆杉独有的紫杉醇生物合成相关基因家族，并揭示了紫杉醇合成相关基因的全基因组定位与茉莉素介导的协同表达调控规律，鉴定了首个紫杉醇生物合成基因簇，为紫杉醇生物合成途径的解析提供了基因组学蓝图和关键候选基因（Nature Plants, 2021,7(8): 1026, 封面论文）。
发现最具挑战的未知酶，鉴定紫杉烷氧杂环丁烷合成酶。紫杉醇分子中的氧杂环丁烷是极其独特的化学基序，由1个氧原子和3个碳原子形成的四元环结构，是紫杉醇抗癌活性的必要化学结构。研究者们基于红豆杉生物合成相关基因家族与紫杉烷分子结构分析，通过自主建立的多基因高效筛选技术，进行了大量的筛选和验证实验，最终从58个关键候选基因中，成功发现了能够催化氧杂环丁烷合成的细胞色素P450酶，命名为TOT1（紫杉烷氧杂环丁烷合酶，Taxane Oxetanase 1）（图1）。TOT1属于红豆杉所特有的CYP725A蛋白亚家族，在红豆杉细胞中敲低该基因的表达量，能够显著降低巴卡亭III和紫杉醇的生物合成。
图1 紫杉烷氧杂环丁烷合酶的筛选与鉴定
颠覆传统认知，阐明植物含氧四元环结构的生物合成新机制。传统观点认为，紫杉醇氧杂环丁烷的形成涉及两步过程：首先，4(20)-烯-5α-基乙酸酯分子结构（简称双键结构）被环氧化，生成 4(20)β-环氧-5α-乙酰氧基三元环中间体（称为环氧化物环），然后通过重排反应从环氧化物生成氧杂环丁烷四元环。也就是说，环氧化物的形成是生成氧杂环丁烷的先决条件。然而，本研究发现TOT1并不能催化三元环中间体向四元环的转变，而是将双键结构同时转变为三元环和四元环结构，从而证明了环氧化物不是氧杂环丁烷形成的必要中间体（图2）。
图2 TOT1催化双键结构同时生成三元环和四元环产物
通过密度泛函理论（DFT）计算与酶的底物选择性检测，研究者们进一步揭示了环氧化物和氧杂环丁烷都可以通过 TOT1 酶中的羰基离子中间体（Int1）产生，但氧杂环丁烷产物的生成在能量和动力学上都比环氧化物更有利，解释了氧杂环丁烷为优势产物的分子机制。这一研究结果，改变了30年来人类对于该结构生成机制的传统认知，填补了仅在植物界中存在的环扩张反应生成含氧四元环结构的分子机制的缺失（图3）。
图3 TOT1介导氧化反应的反应能分布图
另辟蹊径，鉴定缺失的C9氧化酶。在过去三十年中未能鉴定催化C9氧化的酶的主要原因是难以分离C9位的未被氧化的中间体。研究者们发现C9氧化酶不仅参与紫杉醇的生物合成，还参与另一条重要紫杉烷合成途径紫杉素的合成。而且，在紫杉素的合成途径中，除了未知的C9氧化酶外，其他催化酶均已被报道，包括萜烯合成酶TXS、羟化酶T5αH、T10βH、T13αH和乙酰转移酶TAT1/2/3/4。研究者们因此创造性的构建了紫杉素的生物合成植物底盘，并结合生物信息学候选基因分析，利用该底盘从17个候选基因中筛选出了负责紫杉烷 C9 位氧化的酶（Taxane 9α hydroxylase 1，T9αH1）（图4）。该基因位于红豆杉的9号染色体上，介于T2αH和T7βH两个已知的紫杉醇合成基因之间。此外，这一鉴定思路弥补了在很多情况下底物不适于筛选酶的方法的不足，为后续紫杉烷或其他天然产物合成酶的鉴定提供了新的思路。
图4 紫杉烷C9氧化酶的筛选与鉴定
异源重建，打通紫杉醇生产前体巴卡亭III的生物合成途径。利用人工异源合成途径构建策略，研究者将新鉴定的TOT1和T9αH1与其他7个已知合成基因（TXS, T5αH, T13αH, T2αH, T7βH, TAT和 TBT）组合在一起，在植物底盘中进行途径重建，成功生成了巴卡亭III。证明了巴卡亭III分子可由着9个核心基因合成。进一步研究显示，这些核心基因受到植物激素茉莉素的共表达调控，具有相似的诱导表达模式和显著的表达相关性，证明这些基因在细胞中受到密切的协同调控。结合亚细胞定位分析等实验结果，该研究绘制出了巴卡亭III的完整生物合成过程，即起始底物GGPP在叶绿体中被TXS酶催化形成紫杉二烯，随后，紫杉二烯通过质体-内质网的接触点转移到细胞质之后，受到内质网锚定的六个氧化酶（T2αH、T5αH、T7βH、T9αH、T13αH 和 TOT）与两个细胞质定位的酰基转移酶（TAT和TBT）的协同催化，最终生成了巴卡亭III（图5）。
图5 巴卡亭III的完整生物合成过程
综上，该研究结合多组学分析和大量功能验证，成功鉴定了紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶，揭示了植物细胞催化氧杂环丁烷结构形成的全新机制，并通过9个酶在植物底盘中实现了紫杉醇前体巴卡亭III的生物合成，为紫杉醇的大规模生产奠定了基础，也为上百种紫杉烷类天然产物的生物合成通路解析提供了理论指导，标志着我国在复杂天然产物合成通路解析方面的理论和技术站在了世界前沿位置。而且，相关研究成果催生的知识产权，成为我国突破紫杉醇生物合成技术封锁线的重要抓手，为我国的紫杉醇合成底盘改造提供数据和专利保障，为我国的紫杉醇绿色制造产业化铺平道路。
【热点练习】
1.有关基因与性状的叙述，下列说法正确的是( )
A.生物体内一对等位基因总是控制一对相对性状
B.囊性纤维病是基因通过控制酶的合成进而控制生物的性状
C.水毛茛的叶形只受相关基因控制而与环境无关
D.显性纯合致死会导致隐性基因的频率逐渐升高
2.下面关于基因、蛋白质和性状三者之间关系的叙述不正确的是( )
A.生物体的表现型是由基因型和环境共同控制
B.基因与性状之间都是一一对应的关系
C.基因通过控制结构蛋白的合成，进而直接控制生物体的性状
D.基因可通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物体的性状
3.PEP为油菜细胞中的一种中间代谢产物，在两对独立遗传的等位基因A/a、B/b的控制下，可转化为油脂或蛋白质。某科研组研究出产油率更高的油菜品种，基本原理如下图所示。下列分析不正确的是( )
A.图中过程①③所需酶的种类不同
B.基因B和物质C在物质组成上的差别是碱基种类不同
C.该过程中体现了基因可以通过控制酶的合成间接控制性状
D.图中过程④是通过诱导b链的转录提高油菜出油率
4.单基因遗传病囊性纤维病的诊断阵列是表面结合有单链DNA探针的特殊滤纸(其中“0”处放置正常基因的探针,“1~10”处放置不同突变基因的探针)将#1~#3待测个体DNA用有色分子标记,然后将诊断阵列浸泡在溶解有单链标记DNA的溶液中,检测结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A.该病体现基因通过控制酶的合成来控制代谢,进而控制性状
B.放置多种探针的理论依据是基因突变具有随机性
C.若#2与#3婚配,则后代携带突变基因的概率为1
D.诊断阵列上还可诊断猫叫综合征、唐氏综合征等遗传病
5.眼皮肤白化病（OCA）是一种与黑色素合成有关的疾病，该病患者的虹膜、毛发及皮肤呈现白色症状。该病的两种类型OCA1与OCA2均是隐性突变造成的，OCA1型是由位于11号染色体的酪氨酸酶基因突变所致，患者毛发均呈白色，体内的酪氨酸酶含量较低；OCA2型是由位于15号染色体的P基因突变所致，患者症状略轻，体内的P蛋白缺乏，黑色素细胞中pH异常，但酪氨酸酶含量正常。有一对患病的夫妇生下了两个正常的孩子。下列叙述正确的是( )
A.OCA两种类型都体现了基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物性状
B.OCA2型患病原因可能是黑色素细胞中pH异常导致酪氨酸酶活性升高
C.OCA两种突变类型体现了基因突变的可逆性和不定向性特点
D.若这对患病的夫妇都是杂合子，生下患病女孩的概率为3/8
6.豌豆种子有圆粒和皱粒两种，如图为圆粒种子形成机制的示意图，下列相关说法不正确的是( )
A.图中显示了基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物体的性状
B.当编码淀粉分支酶的基因被打乱时，细胞内淀粉的含量会上升
C.皱粒种子中蔗糖含量相对更高，味道更甜美
D.图中①②过程中碱基互补配对的方式有差异
7.油菜的中间代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）运输到种子后有两条转变途径，如下图所示。科研人员根据这一机制培育出高油油菜，基因A和基因B是细胞核基因。据图分析错误的是( )
A.分析上图可知，油菜含油量提高的原因是物质C（双链RNA）的形成抑制了酶b合成过程中的翻译阶段
B.在细胞质中，②过程是一个快速的过程，主要是因为一个mRNA上可以相继结合多个核糖体
C.题中④过程得到的单链与基因B的自然转录模板链的碱基序列完全相同
D.图中体现基因控制性状的方式是基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物的性状
8.青蒿素是治疗疟疾的重要药物，其化学本质是一种萜类化合物。如图为黄花蒿产生青蒿素的代谢过程。青蒿素主要从黄花蒿的叶片中提取，但提取量很低，难以满足临床需求。下列说法错误的是( )
A.①过程和②过程中，遗传信息能够准确传递依赖于碱基的互补配对
B.青蒿素主要从叶片中提取，是因为不同部位的细胞中的基因存在差异
C.促进FPP合成酶基因表达、抑制SQS基因表达可提高青蒿素的产量
D.该过程体现基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物的性状
9.研究发现，β-地中海贫血症患者的常染色体上正常基因A突变成致病基因a，β-珠蛋白（血红蛋白的组成部分）合成受阻。产前基因诊断通常用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术有效且稳定性强、检测率高、检测准确。下列叙述正确的是( )
A.β-地中海贫血症属于染色体变异，且在遗传上与性别无关
B.该病体现了基因可以通过控制蛋白质的结构。间接控制生物体的性状
C.该基因诊断的主要原理是DNA分子杂交技术，体现了碱基互补配对原则
D.通过遗传咨询和产前诊断等手段能够对该遗传病进行检测和治疗
10.囊性纤维化是CFTR基因突变导致的一种人类遗传病，正常基因表达的CFTR蛋白能运输氯离子,CFTR蛋白结构异常会导致氟离子运输异常，患者细胞外产生较厚的黏液堵塞肺部气道和胰腺导管。下列说法错误的是( )
A.囊性纤维化病说明基因可通过控制蛋白质的结构直接控制生物性状
B.囊性纤维化病患者消化能力差,常常会造成营养缺乏
C.较厚的黏液堵塞胰腺导管，影响胰岛素和胰高血糖素的分泌
D.CFTR蛋白属于转运蛋白，具有特异性
答案以及解析
1.答案：D
解析：A、基因和性状并非绝对的一一对应关系，有些基因控制多种性状，如黑色素基因，既决定了头发的颜色，还决定了皮肤的颜色，A错误；B、基因对性状控制的途径有两种，一种为基因通过控制酶的合成控制代谢，进而控制生物的性状，另一种为基因通过控制蛋白质的合成直接控制生物性状，囊性纤维病约有70%患者的致病原因为后一种，B错误；C、生物的性状受基因和环境共同作用，C错误；D、若该种群存在显性纯合致死现象，则显性基因的频率会逐渐降低，隐性基因的频率会逐渐升高，D正确。故选D。
2.答案：B
解析：A、生物体的性状是基因与环境共同作用的结果，A正确；B、基因与性状之间并不是简单的一一对应的关系，如有些性状由多对基因控制，B错误；C、基因可通过控制结构蛋白的合成，直接控制生物体的性状，C正确；D、基因可通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物体的性状，D正确。故选B。
3.答案：B
解析：过程①为转录，需要RNA聚合酶，过程③为DNA的复制，需要解旋酶和DNA聚合酶，A正确；基因B为DNA，物质C为双链RNA，在物质组成上的差别是五碳糖和碱基种类不同，B错误；基因A控制酶a的合成，基因B控制酶b的合成，从而间接控制PEP的转化来控制性状，该过程体现了基因可以通过控制酶的合成间接控制生物体的性状，C正确；过程④能形成与基因B的a链的mRNA互补的单链RNA，即诱导b链的转录，进一步形成物质C，从而抑制了翻译形成酶b，最终使PEP形成更多的油脂，D正确。
4.答案：C
解析：A、囊性纤维病是由于该蛋白在第508位缺少丙氨酸,其空间结构发生变化,使CFTR转运氯离子的功能出现异常,该致病机理说明基因可以通过控制CFTR蛋白的结构直接控制生物性状,A错误;B、放置多种探针的理论依据是基因突变具有不定向性,产生一个以上的等位基因,B错误;C、若正常基因用“A”表示,图中“1~10”对应的致病基因可表示为“a1~a10”,结合图像可推知,#1的基因型是AA,#2的基因型是Aa4,#3的基因型是a2a5,#2与#3婚配(Aa4×a2a5),则后代携带突变基因的概率为100%,C正确;D、猫叫综合征、唐氏综合征等遗传病属于染色体遗传病而非基因遗传病,不可用诊断阵列进行诊断,D错误。故选C。
5.答案：D
解析：A、据题意，OCA1型是由位于11号染色体的酪氨酸酶基因突变所致，因此属于基因控制酶的合成进而影响性状，A错误；
B、老年人的黑色素细胞由于衰老造成酶活性降低，据题意知OCA2型患者的酪氨酸酶活性也较低，B错误；
C、OCA两种突变类型体现了基因突变的不定向性特点，未体现出可逆性，C错误；
D、患病夫妇生下两个正常的孩子，则夫妇各患一种病，即基因型为A-bb和aaB-，夫妇为杂合子，则基因型为Aabb和aaBb，则后代患病概率为3/4，患病女孩就是3/8，D正确。
故选D。
6.答案：B
解析：图中显示了基因通过控制酶的合成来控制代谢过程,进而控制生物体的性状,A项正确;当编码淀粉分支酶的基因被打乱时,会导致淀粉分支酶不能合成,从而使淀粉的含量下降,B项错误;皱粒种子中淀粉含量相对较低,而蔗糖含量相对较高,种子的甜度增加,C项正确;图中①②过程分别为转录和翻译,都会发生碱基互补配对,其中转录过程中有T和A配对,而翻译过程中没有,D项正确。
7.答案：C
解析：A、分析题图可知，由于非模板链进行转录形成的RNA与模板链转录形成的mRNA形成了物质C（杂合双链DNA），抑制了酶b的形成的翻译过程，使PEP不能转化成蛋白质，进而油菜的油脂含量升高，A正确；
B、在翻译的过程中，②翻译过程是一个快速的过程，一个mRNA上可以结合多个核糖体，从而使少量的mRNA分子就可以迅速合成大量蛋白质，提高翻译的效率，B正确；
C、基因中模板链与非模板链是互补的，题中④过程是非模板链转录，得到的单链与基因B的自然转录模板链的碱基序列是互补的，C错误；
D、由图可知，基因可通过控制酶（酶a、酶b）的合成控制细胞代谢进而控制生物体的性状，D正确。
故选C。
8.答案：B
解析：分析题图可知，①表示转录，②表示翻译，①过程和②过程中，遗传信息能够准确传递依赖于碱基的互补配对，A说法正确；青蒿素主要从叶片中提取，是因为不同部位的细胞中的基因表达情况存在差异，由于同一植株的细胞均由同一个受精卵经有丝分裂而来，故不同部位的细胞中的基因相同，B说法错误；分析题图可知，促进FPP合成酶基因表达（导致FPP生成增多）、抑制SQS基因表达（降低FPP转化成其他萜类化合物）可提高青蒿素的产量，C说法正确；分析题图可知，青蒿素的合成体现了基因控制性状的方式是通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物性状，D说法正确。
9.答案：C
解析：A.由题可知，该病由于正常基因A突变成致病基因a，故3-地中海贫血症属于基因突变，A错误。B.该病体现了基因可以通过控制蛋白质的结构，直接控制生物体的性状，B错误C.该基因诊断的主要原理是DNA分子杂交技术，体现了碱基互补配对原则，C正确D.通过遗传咨询和产前诊断等手段能够对该遗传病进行产前检测，不能达到治疗的目的，D错误。故选C
10.答案：C
解析：囊性纤维化病说明CFTR基因可通过控制CFTR蛋白的结构直接控制生物性状，A正确。较厚的黏液堵塞胰腺导管，会影响胰液进入消化道从而使机体消化能力变差，造成营养缺乏，而胰岛素和胰高血糖素是由胰腺内分泌细胞分泌的，导管堵塞不影响激素的分泌，B正确、C错误。CFTR蛋白能运输离子，属于转运蛋白，具有特异性，D正确。

展开更多......

收起↑