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第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
第1课时　目标微生物的分离和纯化
[学习目标]　1.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。2.尝试分离和纯化酵母菌。
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1．单菌落：在________培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养获得的由____________________分裂形成的、______________________的、有一定形态构造的子细胞集团。
2．目标微生物分离和纯化的两种方法
提醒　(1)扇形划线：从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。
(2)多次连续平行划线：划线分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。
(3)稀释涂布平板法：接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记。
判断正误
(1)采用划线的方法接种时，每划一条线前接种环都要灼烧灭菌(　　)
(2)多次连续平行划线时，接种环已灭菌，整个划线过程中不再灭菌(　　)
(3)与平板划线法相比，稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的效果更好(　　)
任务一：微生物的分离和纯化的原理
1．多次连续平行划线法的操作中，在进行第二次及之后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因：划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要____，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步________，最终能得到由________细胞繁殖而来的菌落。
2．为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
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3．稀释涂布平板法也是常用的微生物分离和纯化方法。某同学欲通过稀释涂布平板法了解某牛奶中大肠杆菌的含量，进行了相关的实验操作。请分析回答下列问题：
(1)如何获得该牛奶的10倍、100倍、1 000倍稀释液？
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(2)接种前，该同学将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，这样做的目的是什么？
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(3)该同学应如何确定哪些菌落是大肠杆菌的单菌落？
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　平板划线操作中三种灼烧的目的
项目 目的
蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种
每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端
划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
1．(2024·宁波北仑中学高二期中)在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列有关叙述错误的是(　　)
A．操作过程中，接种环蘸取菌液1次，至少需灼烧5次
B．连续划线的目的是获得单个细胞形成的菌落
C．蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
D．图甲中的a区域为划线的起始区域
2．图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液
B．对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为102，则所得到的菌落不一定是由单个的细胞繁殖而成的
C．图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落
D．图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外)
二、活动：接种、培养并分离酵母菌
1．目的要求
(1)用____________法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用________培养基大量扩增酵母菌。
2．方法步骤
判断正误
(1)用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上(　　)
(2)用接种环取出菌种后需马上塞上装菌种试管的棉塞，然后再划线(　　)
(3)用固体培养基更容易大量扩增酵母菌(　　)
任务二：酵母菌培养过程的注意事项和结果分析
1．如何判断培养基是否被杂菌污染？
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2．如果培养基出现不同颜色特征的菌落，你认为出现的原因是什么？
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3．仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎么进行进一步鉴定？
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4．判断液体培养基中接种酵母菌成功的依据是什么？
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5．平板倒置的目的是什么？
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6．制作平板和平板划线法接种时，哪些操作可防止杂菌污染？
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　实验结果的分析
(1)培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明培养基未被污染。
(2)在接种酵母菌的固体培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在固体培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
3．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是(　　)
A．对比观察培养基的成分是否相同
B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
4．平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是(　　)
A．每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次
B．划线分离结束后接种环无需再进行灭菌
C．在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行
D．划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
答案精析
一、梳理教材新知
1．固体　一个细胞　肉眼可见
2．微生物　连续平行　扇形　梯度稀释　固体　涂布器　划线的尾部　稀释度适当　多次连续平行
判断正误
(1)√　(2)×　(3)√
探究核心知识
1．少　减少　单个
2．最后一次划线已经将菌种稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了菌种的数目，达不到纯化的效果。
3．(1)向1 mL牛奶中加入9 mL无菌水，获得10倍稀释液；再取1 mL 10倍稀释液，加入9 mL无菌水，获得100倍稀释液；取1 mL的100倍稀释液加入9 mL无菌水，获得1 000倍稀释液。
(2)避免涂布器上可能存在的微生物污染培养基，影响实验结果。
(3)根据大肠杆菌菌落特有的形状、大小、颜色、边缘、表面光滑与否等特征进行确定。
落实思维方法
1．D　[操作过程中，接种环蘸取菌液1次，划线了4次，至少需灼烧5次，A正确；连续划线可以将聚集的菌种逐步稀释，以便获得由单个细胞生长繁殖成的单菌落，B正确；为了防止空气中杂菌的污染，蘸取菌液和划线都要在酒精灯火焰旁进行，C正确；分析图乙可知，a对应的区域出现了单菌落，d对应区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，D错误。]
2．C　[平板划线法中多次划线的目的是降低菌种浓度，经过连续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符合要求，C错误。]
二、梳理教材新知
1．(1)平板划线　(2)液体
2．底部　灼烧灭菌　培养容器内壁　稀释　中央　不接种菌液　斜面
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×
探究核心知识
1．培养未接种的培养基，观察是否有菌落生长。如果有，说明培养基被杂菌污染。
2．可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等。
3．不能。可以利用生化实验及显微镜观察来进一步鉴定，如①挑取单菌落接入糖水中，培养一段时间检查是否能产生酒味；②接入面团中观察能否发面；③挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别。
4．和对照组相比，培养基变浑浊。
5．防止水分过度挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基。
6．(1)倒平板：①要使三角瓶的瓶口通过酒精灯火焰；②不要让培养基溅在培养皿内壁与皿盖上；③用拇指和食指将培养皿打开一条缝隙，将培养基倒入，立即盖上皿盖。
(2)平板划线法接种：①在酒精灯火焰旁划线；②接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧；③取菌液前后，要将试管口通过酒精灯火焰；④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养皿表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
落实思维方法
3．B　[对未接种的培养基进行培养，起到对照作用，可确定培养基是否被杂菌污染。]
4．C　[划线分离时，菌种只蘸取一次，A错误；划线分离结束后，接种环仍需进行灼烧灭菌，B错误；微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确；划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。]第2课时　微生物的数量测定和选择培养
[学习目标]　1.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。2.举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。3.尝试分离和计数能分解尿素的微生物。
一、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1．稀释涂布平板法测定微生物数量
2．显微镜计数法
判断正误
(1)稀释涂布平板法中，随机抽取某个稀释度的培养基，统计菌落数(　　)
(2)将不同稀释度的3个平板统计菌落数后求平均值(　　)
(3)如果小方格内酵母细胞数目过多，应当对菌液进行稀释(　　)
任务一：稀释涂布平板法测定微生物的数量
1．两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
(1)稀释涂布平板法测定微生物数量的原理是什么？
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(2)两位同学的统计结果是否可靠？若不可靠，应如何改进？
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(3)统计的菌落往往比活菌的实际数目低，为什么？
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2．某同学在三种稀释倍数下吸取0.1 mL的稀释菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 mL菌液中活菌数(一般选择菌落数为30～300的平板进行计数)。
稀释倍数 菌落数
平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
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任务二：显微镜计数法
1．一次取样后，将样液稀释10倍，采用如图1所示血细胞计数板计数，在显微镜下观察到如图2所示的现象(“”表示酵母菌)。
对图2的中方格中的酵母菌计数时，最佳计数路径是a～d中的哪一种？若以图2的计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度是多少？
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2．为什么显微镜计数法统计的菌数往往比活菌的实际数目要多？
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　稀释涂布平板法测定微生物数量
(1)统计依据：平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。
(2)误差分析：菌落太少说明稀释倍数太大，各平板之间菌落数差异会很大(多一个菌落，乘以稀释倍数误差就大了)，造成误差。数量太多的菌落的生长受到抑制，菌落之间营养竞争较大，可导致某些菌落营养不良影响计数，并且难以区分各个菌落，无法准确计数，造成误差。
(3)结果分析：统计的菌落数往往比实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．某同学对101、102、103倍稀释液计数的平均菌落数分别是2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)(　　)
A．2.76×104个/mL
B．2.95×105个/mL
C．4.6×104个/mL
D．3.775×104个/mL
2．(2024·绍兴高二校考)下列对液体培养基中的酵母菌进行计数的方法，描述不正确的是(　　)
A．可以用显微镜直接计数，需要血细胞计数板，但数据可能偏大
B．也可以用培养菌落的方法进行计数，但数据可能偏大
C．无论用哪种方法计数，都必须进行浓度梯度稀释
D．无论用哪种方法计数，都必须多次计数求平均值
二、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1．选择培养基
2．活动：能分解尿素的微生物的分离与计数
(1)实验原理
(2)方法步骤
提醒　①LB固体培养基的成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂和水。
②尿素固体培养基的成分：葡萄糖、氯化钠、K2HPO4、酚红、琼脂糖和水。
③琼脂和琼脂糖之间的主要区别在于琼脂是从红藻中获得的凝胶状物质(含N)，而琼脂糖是从琼脂或红藻中纯化的线性聚合物(不含N)，琼脂糖是琼脂的主要成分，占琼脂的70%以上。 琼脂糖在细菌培养中非常有用。
判断正误
(1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物的生长(　　)
(2)分离能分解尿素的微生物时，培养基中尿素作为唯一氮源(　　)
(3)配制的尿素固体培养基在灭菌后再加入尿素溶液，因为尿素高温易分解(　　)
(4)相同稀释度下，尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基多(　　)
任务三：用功能不同的培养基分离与鉴别微生物
按功能划分，可以把培养基分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。鉴别培养基是指根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物的培养基。据此回答以下问题。
1．根据教材“活动”中尿素固体培养基的配制，回答下列问题：
(1)从物理特征看，该培养基属于________培养基，从功能上看属于________培养基。
(2)尿素固体培养基是如何实现对能分解尿素的细菌的筛选的？
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(3)在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
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2．已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。请回答下列问题：
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出实验方案。
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(2)怎么比较纤维素分解菌的分解能力？
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　几种选择培养基的设计
特性 主要用途 设计原理
加入青霉素 分离酵母菌等真菌 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
不加氮源 分离固氮微生物 固氮微生物能利用空气中的氮气
不加碳源 分离自养型微生物 自养型微生物能利用无机碳源
3．(2023·湖州高二期末)下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是(　　)
A．利用高温条件筛选耐热的Taq细菌
B．加入青霉素可以筛选出对青霉素有抗性的细菌
C．含酚红的尿素培养基初步鉴别出分解尿素的细菌
D．筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质
4．如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”的部分实验结果，下列叙述正确的是(　　)
A．图中采用平板划线法接种
B．图中①和②表示尿素培养基长出的菌落
C．图中③④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2
D．实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高
答案精析
一、梳理教材新知
1．3　减小　平均值
2．计数板　盖玻片边缘　红细胞　五点取样　不数下　数左　3　80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数
判断正误
(1)×　(2)×　(3)√
提示　(1)在每一个梯度浓度内，至少要涂布 3 个平板，一般选择菌落数在 30～300 的进行记数，求其平均值。(2)应随机抽取相同稀释度的3个平板统计菌落数后求平均值。
探究核心知识
任务一
1．(1)当稀释倍数适当时，在固体培养基表面能得到由单个细胞生长繁殖成的单菌落；通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。
(2)都不可靠。甲同学应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。乙同学的其中一个平板菌落数为21，与另外两组数值相差太大，意味着操作有误，需要重新实验。
(3)因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
2．105的稀释倍数下取0.1 mL的稀释菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244(个)。进一步可以换算出1 mL菌液中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
任务二
1．据图分析可知，a图所示的计数方法从头到尾，一气呵成，计数过程中不会出现漏记与重复计数，而其余几种计数方法中都有多条计数路径，需要将各路径的数据相加，容易出现漏记与重复计数，因此对图2的中方格中酵母菌计数时，最佳计数路径是a。据图分析，图2含有酵母菌25个，若以该计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度＝25×25×10 000×10＝6.25×107(个·mL－1)。
2．因为显微镜计数法不能区分死菌和活菌。
落实思维方法
1．B　[某同学在101、102、103倍稀释的平均菌落数为2 760、295和16，为保证结果准确，一般应选择菌落数在30～300的平板进行计数，故数值为295，稀释倍数为102，则每毫升菌落总数为295×102÷0.1＝2.95×105(个)。]
2．B　[对液体培养基中的酵母菌进行计数可以用显微镜直接计数，需要血细胞计数板，由于不能区分死菌和活菌，数据可能偏大，A正确；对液体培养基中的酵母菌进行计数可以用培养菌落的方法进行计数，当两个或多个酵母菌连在一起时，繁殖后会形成一个菌落，可能会导致数据偏小，B错误；无论用哪种方法计数，都必须进行浓度梯度稀释，并多次计数求平均值，C、D正确。]
二、梳理教材新知
1．添加(或减去)　特定　其他　抗性　敏感　固氮　目标微生物　特定的细胞
2．(1)尿素　脲酶　氨　黄　酚红指示剂　红色　强
(2)G6玻璃砂漏斗　60 ℃　99　1　底部　移液器　由大到小　0.1　酒精灯火焰　均匀　恒温培养箱
判断正误
(1)√　(2)√　(3)√　(4)×
提示　(4)LB固体培养基为全营养培养基，尿素固体培养基为选择培养基，可淘汰不能以尿素为氮源进行固氮的微生物，因此尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基少。
探究核心知识
1．(1)固体　选择
(2)该培养基中的唯一氮源为尿素，只有能分泌脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能分泌脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。
(3)不都是，有些菌落可能是自生固氮微生物，而不是能分解尿素的微生物。
2．(1)用“纤维素作为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基中加入刚果红进行鉴别。在培养基上形成透明圈的菌落即为纤维素分解菌。
(2)透明圈直径与菌落直径比值越大，说明该菌落分解纤维素的能力越强。
落实思维方法
3．D　[耐热的Taq细菌可以生存在高温环境中，所以可以利用高温条件筛选耐热的Taq细菌，A正确；尿素分解菌可以将尿素分解成氨使酚红指示剂呈红色，C正确；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，同时也要加入其他营养物质，D错误。]
4．C　[根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A错误；图中①和②的稀释度等于③和④，但菌落数却明显多于③④，很可能是LB培养基上长出的菌落，B错误；根据实验结果，判断自然界中能合成脲酶的微生物比例较低，D错误。](共74张PPT)
第一章 发酵工程
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第2课时
微生物的数量测定和选择培养
学习目标
1.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。
2.举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。
3.尝试分离和计数能分解尿素的微生物。
内容索引
一、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
课时对点练
二、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
一
梳理　教材新知
1.稀释涂布平板法测定微生物数量
3
减小
平均值
2.显微镜计数法
计数板
盖玻片边缘
红细胞
五点取样
不数下
数左
3
80个小方格细胞
总数/80×400×10 000×稀释倍数
(1)稀释涂布平板法中，随机抽取某个稀释度的培养基，统计菌落数
(　　)
×
提示　在每一个梯度浓度内，至少要涂布 3 个平板，一般选择菌落数在 30～300 的进行记数，求其平均值。
(2)将不同稀释度的3个平板统计菌落数后求平均值(　　)
×
提示　应随机抽取相同稀释度的3个平板统计菌落数后求平均值。
(3)如果小方格内酵母细胞数目过多，应当对菌液进行稀释(　　)
√
任务一：稀释涂布平板法测定微生物的数量
1.两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
探究　核心知识
(1)稀释涂布平板法测定微生物数量的原理是什么？
提示　当稀释倍数适当时，在固体培养基表面能得到由单个细胞生长繁殖成的单菌落；通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。
(2)两位同学的统计结果是否可靠？若不可靠，应如何改进？
提示　都不可靠。甲同学应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。乙同学的其中一个平板菌落数为21，与另外两组数值相差太大，意味着操作有误，需要重新实验。
(3)统计的菌落往往比活菌的实际数目低，为什么？
提示　因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
2.某同学在三种稀释倍数下吸取0.1 mL的稀释菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 mL菌液中活菌数(一般选择菌落数为30～300的平板进行计数)。
稀释倍数 菌落数
平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示　105的稀释倍数下取0.1 mL的稀释菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244(个)。进一步可以换算出1 mL菌液中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
任务二：显微镜计数法
1.一次取样后，将样液稀释10倍，采用如图1所示血细胞计数板计数，在显微镜下观察到如图2所示的现象(“　”表示酵母菌)。
对图2的中方格中的酵母菌计数时，最佳计数路径是a～d中的哪一种？若以图2的计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度是多少？
提示　据图分析可知，a图所示的计数方法从头到尾，一气呵成，计数过程中不会出现漏记与重复计数，而其余几种计数方法中都有多条计数路径，需要将各路径的数据相加，容易出现漏记与重复计数，因此对图2的中方格中酵母菌计数时，最佳计数路径是a。据图分析，图2含有酵母菌25个，若以该计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度＝25×25×10 000×10＝6.25×107(个·mL－1)。
2.为什么显微镜计数法统计的菌数往往比活菌的实际数目要多？
提示　因为显微镜计数法不能区分死菌和活菌。
核心归纳
稀释涂布平板法测定微生物数量
(1)统计依据：平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。
(2)误差分析：菌落太少说明稀释倍数太大，各平板之间菌落数差异会很大(多一个菌落，乘以稀释倍数误差就大了)，造成误差。数量太多的菌落的生长受到抑制，菌落之间营养竞争较大，可导致某些菌落营养不良影响计数，并且难以区分各个菌落，无法准确计数，造成误差。
(3)结果分析：统计的菌落数往往比实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1.某同学对101、102、103倍稀释液计数的平均菌落数分别是2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)
A.2.76×104个/mL
B.2.95×105个/mL
C.4.6×104个/mL
D.3.775×104个/mL
√
落实　思维方法
某同学在101、102、103倍稀释的平均菌落数为2 760、295和16，为保证结果准确，一般应选择菌落数在30～300的平板进行计数，故数值为295，稀释倍数为102，则每毫升菌落总数为295×102÷0.1＝2.95×105(个)。
2.(2024·绍兴高二校考)下列对液体培养基中的酵母菌进行计数的方法，描述不正确的是
A.可以用显微镜直接计数，需要血细胞计数板，但数据可能偏大
B.也可以用培养菌落的方法进行计数，但数据可能偏大
C.无论用哪种方法计数，都必须进行浓度梯度稀释
D.无论用哪种方法计数，都必须多次计数求平均值
√
对液体培养基中的酵母菌进行计数可以用显微镜直接计数，需要血细胞计数板，由于不能区分死菌和活菌，数据可能偏大，A正确；
对液体培养基中的酵母菌进行计数可以用培养菌落的方法进行计数，当两个或多个酵母菌连在一起时，繁殖后会形成一个菌落，可能会导致数据偏小，B错误；
无论用哪种方法计数，都必须进行浓度梯度稀释，并多次计数求平均值，C、D正确。
调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
二
1.选择培养基
梳理　教材新知
添加(或减去)
特定
其他
抗性
敏感
固氮
目标微生物
特定的细胞
2.活动：能分解尿素的微生物的分离与计数
(1)实验原理
尿素
脲酶
氨
黄
酚红指示剂
红色
强
(2)方法步骤
G6玻璃砂漏斗
60 ℃
99
1
底部
移液器
由大到小
0.1
酒精
灯火焰
均匀
恒温培养箱
提醒　①LB固体培养基的成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂和水。
②尿素固体培养基的成分：葡萄糖、氯化钠、K2HPO4、酚红、琼脂糖和水。
③琼脂和琼脂糖之间的主要区别在于琼脂是从红藻中获得的凝胶状物质(含N)，而琼脂糖是从琼脂或红藻中纯化的线性聚合物(不含N)，琼脂糖是琼脂的主要成分，占琼脂的70%以上。 琼脂糖在细菌培养中非常有用。
(1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物的生长(　　)
(2)分离能分解尿素的微生物时，培养基中尿素作为唯一氮源(　　)
(3)配制的尿素固体培养基在灭菌后再加入尿素溶液，因为尿素高温易分解(　　)
(4)相同稀释度下，尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基多(　　)
√
×
√
√
提示　LB固体培养基为全营养培养基，尿素固体培养基为选择培养基，可淘汰不能以尿素为氮源进行固氮的微生物，因此尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基少。
任务三：用功能不同的培养基分离与鉴别微生物
按功能划分，可以把培养基分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。鉴别培养基是指根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物的培养基。据此回答以下问题。
1.根据教材“活动”中尿素固体培养基的配制，回答下列问题：
(1)从物理特征看，该培养基属于　　　培养基，从功能上看属于_____培养基。
探究　核心知识
固体
选择
(2)尿素固体培养基是如何实现对能分解尿素的细菌的筛选的？
提示　该培养基中的唯一氮源为尿素，只有能分泌脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能分泌脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。
(3)在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
提示　不都是，有些菌落可能是自生固氮微生物，而不是能分解尿素的微生物。
2.已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。请回答下列问题：
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出实验方案。
提示　用“纤维素作为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基中加入刚果红进行鉴别。在培养基上形成透明圈的菌落即为纤维素分解菌。
(2)怎么比较纤维素分解菌的分解能力？
提示　透明圈直径与菌落直径比值越大，说明该菌落分解纤维素的能力越强。
核心归纳
几种选择培养基的设计
特性 主要用途 设计原理
加入青霉素 分离酵母菌等真菌 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
不加氮源 分离固氮微生物 固氮微生物能利用空气中的氮气
不加碳源 分离自养型微生物 自养型微生物能利用无机碳源
3.(2023·湖州高二期末)下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是
A.利用高温条件筛选耐热的Taq细菌
B.加入青霉素可以筛选出对青霉素有抗性的细菌
C.含酚红的尿素培养基初步鉴别出分解尿素的细菌
D.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质
√
落实　思维方法
耐热的Taq细菌可以生存在高温环境中，所以可以利用高温条件筛选耐热的Taq细菌，A正确；
尿素分解菌可以将尿素分解成氨使酚红指示剂呈红色，C正确；
筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，同时也要加入其他营养物质，D错误。
4.如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”的部分实验结果，下列叙述正确的是
A.图中采用平板划线法接种
B.图中①和②表示尿素培养基长出的菌落
C.图中③④培养基中菌落生长代谢时，会
　释放CO2
D.实验结果表明，自然界中能合成脲酶的
　微生物比例较高
√
根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A错误；
图中①和②的稀释度等于③和④，但菌落数却明显多于③④，很可能是LB培养基上长出的菌落，B错误；
根据实验结果，判断自然界中能合成脲酶的微生物比例较低，D错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　微生物的数量测定
1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)
A.2.34×108个 B.2.34×109个
C.234个 D.23.4个
√
对点训练
据题意分析可知，每毫升样品中的菌落数＝234÷0.1×106＝2.34×
109(个)。
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2.下列关于教材中用显微镜计数法测定酵母菌的数量的叙述，正确的是
A.对于压在方格边缘线上的酵母菌的处理方法是计数四条边及其顶角的酵母菌数
B.对酵母菌计数时，用滴管吸取静置的培养液滴满血细胞计数板的方格区
C.若血细胞计数板的大方格体积为2 mm×2 mm×0.1 mm，加入稀释10倍的培
　养液后镜检，大方格内酵母菌数为M，则10 mL培养液中酵母菌的总数约为
　2.5M×105个
D.某同学按对角线方位计数5个中方格菌数分别为10、11、8、10、9，估算每
　一小方格的酵母菌数是0.48
√
对点训练
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对点训练
对于压在一个方格边缘上的酵母菌的处理方法是只计数每一小方格上方和左侧线条上的酵母菌数(即“数上不数下”“数左不数右”)，A错误；
对酵母菌计数时，用滴管吸取振荡均匀的培养液滴满血细胞计数板的方格区，B错误；
血细胞计数板的大方格体积＝2×2×0.1＝0.4(mm3)，其中酵母菌数为M，则10 mL培养液中酵母菌数＝M÷0.4×1 000×10×10＝2.5M×105(个)，C正确；
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对点训练
某同学按对角线方位计数5个中方格(血细胞计数板规格为25×16，即每个中方格有16个小方格)菌数分别为10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌数＝(10＋11＋8＋10＋9)÷5÷16＝0.6，D错误。
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3.(2024·杭州高二联考)人们在研究、利用微生物时，需用无菌技术获取纯种微生物，并对其进行计数或保存。下列相关叙述正确的是
A.可用稀释涂布平板法在显微镜下对酵母菌细胞进行计数
B.血细胞计数板若先加液体再加盖玻片则会导致计数结果偏大
C.获得单菌落后，利用涂布法接种至斜面培养基中保存
D.接种、分离后，使用过的器皿需先经洗涤再彻底灭菌
对点训练
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可用血细胞计数板在显微镜下对酵母菌直接计数或用稀释涂布平板法间接计数，A错误；
应该先盖盖玻片再滴加培养液，若先向血细胞计数板的计数室中加培养液再加盖玻片会造成统计结果偏大，B正确；
获得单菌落后，可挑取菌落，利用划线法接种至斜面培养基中保存，C错误；
接种、分离后，使用过的器皿需先经高压灭菌后再洗涤，以免造成环境污染，D错误。
对点训练
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4.丙草胺是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其计数(如图所示)，以期为修复污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述错误的是
A.将培养基调至酸性时，有利于降解菌
　的生长繁殖
B.利用该方法的计数结果往往比显微镜
　计数法偏小
C.用以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培
　养可以提高降解菌的浓度
D.5 号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为 1.7×109个
对点训练
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对点训练
细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，A错误；
该计数方法为稀释涂布平板法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌
落，故计数结果比显微镜计数法偏小，B正确；
若以丙草胺作为唯一氮源，则只有具有降解丙草胺能力的菌株能够存活，故可以提高降解菌的浓度，C正确；
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对点训练
根据5号试管的数据可知，每克土壤中菌株数为(168＋175＋167)÷3
÷0.1×106＝1.7×109(个)，D正确。
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选项 尿素 琼脂糖 葡萄糖 硝酸盐
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
5.分离土壤中分解尿素的细菌，可选用的培养基是
√
对点训练
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
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6.(2024·嘉兴高二期末)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。
下列叙述错误的是
A.步骤②的液体培养基含有的
　唯一氮源是尿素
B.步骤③的平板培养基是加入了适量尿素的LB固体培养基
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，期待获得能分解尿素的细菌的单菌落
D.步骤④挑取③中菌落分别接种，可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿
　素的能力
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对点训练
步骤②为选择培养，该液体培养基中含有的唯一氮源是尿素，A正确；
步骤③的平板培养基应该是以尿素作为唯一氮源的固体培养基，其目的是筛选出分解尿素的微生物，而LB固体培养基中本身就含有氮源，B错误；
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步骤③采用稀释涂布平板法接种，其目的是通过梯度稀释获得能分解尿素的细菌的单菌落，C正确；
尿素在分解过程中会产生氨，进而会导致培养基中pH发生变化，故可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力，D正确。
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7.通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是
A.将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
B.选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数
C.取104、105、106倍的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上
D.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
对点训练
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培养细菌时，要将培养皿倒置，可防止水分过度挥发和冷凝水滴落到培养基表面，并在37 ℃恒温培养24～48小时，A正确；
选择菌落数在30～300个的3个平板进行计数，求其平均值，B错误。
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8.“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中，配制LB全营养培养基的目的是
A.作为实验组，分离尿素分解菌
B.作为对照组，检测培养基灭菌是否彻底
C.作为对照组，观察尿素分解菌在含有酚红培养基上的菌落形态
D.作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量
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对点训练
配制LB全营养培养基的目的是作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量，以区分选择培养基是否具有选择作用，D正确。
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9.某同学依据如图操作步骤，从土壤中分离能分解尿素的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是
A.尿素固体培养基比尿素液体培养基
　多了琼脂
B.以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌
　方式是过滤灭菌
C.利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率
D.两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2＝乙1/乙2)
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尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂糖和酚红指示剂，A错误；
以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素溶液用过滤除菌，B错误；
两种步骤获得的菌落比值关系为甲1/甲2＞乙1/乙2，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变大，D错误。
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10.(2024·嘉兴高二期中)益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。研究小组尝试检测某品牌益生菌中的活菌含量，实验步骤为制备培养基→调节 pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是
A.培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
B.经高压灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
C.对该品牌益生菌进行计数时，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
D.若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
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由题意可知，益生菌主要在肠道内发挥调节功能，所以其代谢类型是厌氧型，因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢，A正确；
经高压灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置，防止水分过度挥发和冷凝水对培养基造成污染，B正确；
由于在平板上两个或多个细菌可能会形成一个菌落，所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小，C错误；
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若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养，如果出现了菌落，则说明培养基被污染，D正确。
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11.(2024·杭州高二期末)营养缺陷型菌株是突变后代谢过程中某些合成反应不能正常进行的菌株。如图是科研人员利用影印法(用无菌的丝绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上)初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程。
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C.进行②过程的顺序是先将丝绒布“复印”
　至完全培养基上，再“复印”至基本培养基上
D.氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落
　中挑选
综合强化
√
下列叙述错误的是
A.可用接种环从斜面中取出保存的菌种，
　然后诱变处理以获得想要的营养缺陷
　型菌株
B.①过程接种方法为稀释涂布平板法，
　接种后的培养皿不能立即进行倒置培养
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可用接种环从斜面中取出保存的菌种，放在摇床上振荡培养然后诱变处理以获得想要的营养缺陷型菌株，A正确；
由接种后的菌落分布情况可推测该过程接种的方法为稀释涂布平板法，为防止培养液滴落，接种后的培养皿不能立即进行倒置培养，B正确；
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进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布“复印”至基本培养基上，再“复印”至完全培养基上，C错误；
在基本培养基中氨基酸缺陷型菌株不
能生长，而在完全培养基中能够生长，
比较基本培养基和完全培养基中的菌落可知，氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落中挑选，D正确。
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12.金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下列是某研究小组测定自来水中金黄色葡萄球菌浓度的实验操作，错误的是
A.在金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，其作用是有利于金黄色葡萄球菌的
　筛选
B.在制作血平板时需等平板冷却后，才可加入血液，以防止高温破坏血细胞
C.现将10 mL菌液依次稀释成10－1、10－2、10－3、10－4四个稀释样液，再取四个稀释
　样液各0.1 mL分别接种到4个血平板上，所用方法是稀释涂布平板法
D.若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、
　36和37，则每升自来水中的活菌数约为3.6×106个
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由于金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，7.5%NaCl在不影响金黄色葡萄球菌生长的同时还抑制其他菌的生长，因此，金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，有利于金黄色葡萄球菌的筛选，A正确；
若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为(35＋36＋37)÷3÷
10－3÷0.1×1 000＝3.6×108(个)，D错误。
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13.产脲酶的细菌可分解尿素。为筛选产脲酶的菌株，科研人员开展了相关研究。回答下列问题：
(1)为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一_______，尿素的灭菌方法是____________________________________。
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氮源
用已高压灭菌的G6玻璃砂漏斗过滤除菌
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(2)称取1 g土壤样品，加入99 mL________中，制备成土壤细菌悬液。若用稀释涂布平板法计数细菌的个数，要使所得估计值更接近实际值，应严格操作，多次重复，还应保证对待测样品_____的比例恰当。取0.1 mL 10倍稀释的细菌悬液涂布在固体培养基上，平均长出了25个菌落，则该样本中每克土壤约有产脲酶的细菌__________个。
综合强化
无菌水
稀释
2.5×105
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(3)通常筛选菌种时可以通过观察______特征对细菌进行初步鉴定。在筛选产脲酶的细菌时，还可以在培养基中添加______作为指示剂，产脲酶的细菌在培养基中生长一段时间后，菌落周围指示剂将变成____色。
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菌落
酚红
红
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综合强化
14.一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可用一定方法选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
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综合强化
(1)现有1 L土壤浸出液，为了对土壤中的细菌进行计数，各取0.1 mL已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养。接种需选择图1工具中的____(填字母)进行实验操作。计数结束记录上述三个培养皿中的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液中菌体数为___________个。
B
5.6×108　
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综合强化
常用稀释涂布平板法对土壤中细菌进行计数，稀释涂布平板法要用B(涂布器)进行操作。每升土壤浸出液中菌体数为(55＋56＋57)÷3÷
0.1×103×103＝5.6×108(个)。
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综合强化
(2)在培养基上形成的菌落中，有透明圈菌落利用的氮源主要是__________，据此可筛选出目的菌。实验结果如图2所示，图中A～E五种菌株中，____是最理想菌株，判断依据是_______________________________。
该除草剂
E
透明圈直径与菌落直径比值最大
要筛选降解该除草剂的菌体，培养基中应该以该除草剂作为唯一氮源。图中E菌株透明圈(降解圈)直径与菌落直径比值最大，故是最理想的菌株。
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综合强化
(3)在无菌操作下，可将最理想的单菌落用接种环取出，再用_______法接种至斜面培养基中。
划线
菌种保藏时，可将单菌落取出用划线法接种在斜面培养基中。
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14作业2　目标微生物的分离和纯化
(分值：100分)
第1～2题，每题5分；第3～13题，每题6分，共76分。
题组一　纯化和分离微生物的方法
1．采用平板法培养微生物的过程中，使微生物均匀分布在培养基上需要用到的工具是(　　)
A．接种环 B．涂布器
C．接种针 D．胶头滴管
2．如图表示培养和分离X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是(　　)
A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B．步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后进行平板划线
C．步骤③应多个方向划线，使菌种逐渐分散，培养后出现单菌落
D．步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行计数
3．(2024·台州高二期中)如图为平板划线法接种微生物的示意图，下列说法错误的是(　　)
A．观察或比较各种细菌菌落形态的最佳区域是④
B．划线时要注意不能将④区域的划线与①区域相连
C．每次划线后，都应将接种环放在酒精灯火焰上灼烧
D．划线结束时即可看到划线末端出现不连续单菌落
4．若在固体培养基上用稀释涂布平板法接种细菌，看到的培养结果不可能是(　　)
5．稀释涂布平板法是微生物培养的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是(　　)
A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落
C．需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
6．(2024·浙江四校高二联考)下列有关微生物纯培养的叙述，正确的是(　　)
A．可用稀释涂布平板法和平板划线法对微生物进行分离和计数
B．在酒精灯火焰附近将冷却至室温的培养基倒入培养皿
C．平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数不同
D．配制培养基的步骤为计算→称量→溶解→灭菌→调pH
题组二　接种、培养并分离酵母菌
7．下列依次表示倒平板、接种的位置以及平板划线法接种的路径的示意图，其中错误的是(　　)
8．接种、培养并分离酵母菌最常用的方法是平板划线法或稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述，错误的是(　　)
A．均将酵母菌接种在固体培养基的表面
B．获得的每一个菌落均是由一个细胞生长繁殖而来的子细胞集团
C．都应在酒精灯火焰附近操作，以防止杂菌污染
D．稀释分散菌种的原理不同，但均能达到纯化酵母菌的目的
9．在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无菌操作。图中符合无菌操作要求的有(　　)
①三角瓶口通过火焰，并在火焰旁将培养基倒入灭菌培养皿　②盛菌种的试管口在火焰上灼烧　③接种前灼烧接种环　④接种前培养皿在火焰上灼烧　⑤靠近火焰接种
A．①②③④ B．①②③⑤
C．①③④⑤ D．②③④⑤
10．(2024·浙江大学附中高二期中)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下列有关叙述不正确的是(　　)
A．对配制的培养基进行高压灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．采用平板划线法对获得的菌株进行计数
D．根据菌落的形态和颜色等进行初步判断
11．(2024·浙江余姚中学高二月考)纸片扩散法是药敏试验中一种常用的方法。取少量大肠杆菌的培养液，均匀涂在培养皿内的培养基上，再放上4片含有链霉素(抗生素的一种)的圆形滤纸，然后在无菌适宜条件下培养12～16 h，滤纸片周围出现抑制大肠杆菌生长的环圈(简称抑菌圈，如图)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图1中的培养基需冷却至60 ℃左右时再倒平板，该操作需要在酒精灯旁完成
B．图2中所示培养基的放置方式能防止水分过快蒸发和冷凝水珠冲散菌落
C．图3培养皿上大肠杆菌的接种方式为稀释涂布平板法，Ⅳ号纸片上抗生素浓度最高
D．图3所示的抑菌圈内出现大肠杆菌菌落的原因是链霉素使其发生了基因突变
12．如图所示为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果。下列相关说法正确的是(　　)
A．该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的
B．在操作时，为防止杂菌污染，需进行严格的消毒和灭菌
C．该种微生物有可能是H5N1病毒
D．该培养基上的菌落分布不均匀，代表纯培养失败
13．(2024·宁波效实中学高二期中)野生型伤寒沙门氏菌(his＋)可合成组氨酸，某种突变体丧失了这种能力，必须在添加组氨酸的培养基上才能生长，称为组氨酸营养缺陷型(his)。现用两种方法接种，甲为平板划线法，乙为稀释涂布平板法。下列叙述正确的是(　　)
A．两种方法所用培养基均为液体培养基
B．甲接种方法可用于对微生物的分离和计数
C．乙接种方法可用于对微生物的分离和计数
D．his菌株接种在不含组氨酸的培养基上能长出菌落
14．(每空3分，共9分)使用特定的接种技术可以得到目标微生物的单菌落，实现对目标微生物的分离。回答下列问题：
(1)一般情况下，培养基都可以为微生物的生存提供________________________________等。
(2)实验前需要确定培养基灭菌是否彻底，具体的操作是_____________________________。
(3)下面是四种菌落的分布情况，其中属于通过稀释涂布平板法得到的是________(多选)。
15．(每空3分，共15分)某研究小组从黄色短杆菌(能合成L－亮氨酸)中筛选L－亮氨酸缺陷型(不能合成L－亮氨酸)突变菌株，实验流程如图所示。回答下列问题：
(1)培养基灭菌常用的方法是_______________________________________________。
(2)过程①的接种方法是____________________。过程②接种时，先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因是_____________________。
(3)培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因是______________________。若培养皿B的培养基中含有L－亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L－亮氨酸，培养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养皿______(填“B”或“C”)中选取目的菌落。
答案精析
1．B
2．C　[步骤①倒平板操作时，倒好后待平板冷却凝固，然后将其倒过来放置，A错误；步骤②将接种环在火焰上灼烧后冷却至室温再蘸取菌液进行平板划线，B错误；步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行分离纯化，得到单菌落，但不可用来计数，D错误。]
3．D　[划线结束后，将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养一定时间后，方可看到划线末端出现不连续单菌落，D错误。]
4．D
5．B　[稀释涂布平板法操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，以获得单菌落，A正确；只有稀释度足够高的菌液才可在培养基表面形成单菌落，若稀释度不够大，细菌聚集在一起，得不到单菌落，B错误；操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防杂菌污染，D正确。]
6．C　[稀释涂布平板法和平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但平板划线法不能用于计数，A错误；在酒精灯火焰附近将冷却至60 ℃左右的培养基倒入培养皿，B错误；平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数比划线次数多一次，因为划线完之后为避免污染还需再灼烧一次，C正确；配制培养基的步骤为计算→称量→溶解→调pH→灭菌，D错误。]
7．D
8．B　[用稀释涂布平板法分离酵母菌时，如果稀释度不够大，获得的菌落就可能是由多个细胞繁殖形成的，B错误。]
9．B
10．C　[培养基通常采用高压(蒸汽)灭菌法进行灭菌，A正确；使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，可以防止杂菌污染，B正确；平板划线法无法对获得的菌株进行计数，应该采用稀释涂布平板法对获得的菌株进行计数，C错误；菌落形态包括菌落的大小、形状、光泽、质地、颜色和透明程度等，每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征，故可根据菌落的形态和颜色等进行初步判断，D正确。]
11．D　[对培养液进行灭菌后需先冷却再倒平板，倒平板时应在酒精灯旁进行，可以尽可能减少培养基污染，A正确；接种后的培养基需要倒置，这样可以防止培养基中水分过快蒸发，同时防止冷凝形成的水珠倒流冲散菌落，B正确；图3所示为稀释涂布平板法进行接种，纸片上的抗生素浓度越大，所形成的抑菌圈就越大，故Ⅳ号纸片上的抗生素浓度最高，C正确；图3所示Ⅳ号的抑菌圈中出现了少数几个菌落，说明这几个菌落具有抗药性，抗药性的获得是由于这些细菌发生了基因突变，抗生素只是将具有抗药性突变的细菌从中筛选出来，D错误。]
12．B　[题图最可能是采用平板划线法进行接种的，A错误；病毒无细胞结构，必须寄生在活细胞中才能生存，因此病毒不能用培养基直接培养，C错误；平板划线法中随划线次数的增加，菌落密度逐渐减小，因此分布不均匀，D错误。]
13．C　[甲是平板划线法，乙是稀释涂布平板法，两种方法都是在固体培养基上进行接种的操作，A错误；平板划线法可用于对微生物的分离纯化，但不能计数，B错误；稀释涂布平板法可用于对微生物的分离和计数，C正确；由题意可知，野生型伤寒沙门氏菌可合成组氨酸，his菌株突变体丧失了这种能力，必须在添加组氨酸的培养基上才能生长，D错误。]
14．(1)水、碳源、氮源、无机盐和生长因子　(2)将未接种的培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落出现　(3)ABC
15．(1)高压蒸汽灭菌法　(2)稀释涂布平板法　培养皿B、C中的菌种接种位置相同　(3)便于观察菌落特征和分离目的菌株　B
解析　(2)根据过程①所得培养基中菌落的分布结果可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法。(3)为了便于观察菌落特征和分离目的菌株，培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基。在不含L－亮氨酸培养基中，突变菌株不能生长，而在含L－亮氨酸培养基中能够生长，因此从培养皿B中的菌落中可挑选出突变菌株。作业3　微生物的数量测定和选择培养
(分值：100分)
第1～12题，每题6分，共72分。
题组一　微生物的数量测定
1．某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)(　　)
A．2.34×108个 B．2.34×109个
C．234个 D．23.4个
2．下列关于教材中用显微镜计数法测定酵母菌的数量的叙述，正确的是(　　)
A．对于压在方格边缘线上的酵母菌的处理方法是计数四条边及其顶角的酵母菌数
B．对酵母菌计数时，用滴管吸取静置的培养液滴满血细胞计数板的方格区
C．若血细胞计数板的大方格体积为2 mm×2 mm×0.1 mm，加入稀释10倍的培养液后镜检，大方格内酵母菌数为M，则10 mL培养液中酵母菌的总数约为2.5M×105个
D．某同学按对角线方位计数5个中方格菌数分别为10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌数是0.48
3．(2024·杭州高二联考)人们在研究、利用微生物时，需用无菌技术获取纯种微生物，并对其进行计数或保存。下列相关叙述正确的是(　　)
A．可用稀释涂布平板法在显微镜下对酵母菌细胞进行计数
B．血细胞计数板若先加液体再加盖玻片则会导致计数结果偏大
C．获得单菌落后，利用涂布法接种至斜面培养基中保存
D．接种、分离后，使用过的器皿需先经洗涤再彻底灭菌
4．丙草胺是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其计数(如图所示)，以期为修复污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述错误的是(　　)
A．将培养基调至酸性时，有利于降解菌的生长繁殖
B．利用该方法的计数结果往往比显微镜计数法偏小
C．用以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培养可以提高降解菌的浓度
D．5 号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为 1.7×109个
题组二　微生物的选择培养
5．分离土壤中分解尿素的细菌，可选用的培养基是(　　)
选项 尿素 琼脂糖 葡萄糖 硝酸盐
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
6．(2024·嘉兴高二期末)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。
下列叙述错误的是(　　)
A．步骤②的液体培养基含有的唯一氮源是尿素
B．步骤③的平板培养基是加入了适量尿素的LB固体培养基
C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，期待获得能分解尿素的细菌的单菌落
D．步骤④挑取③中菌落分别接种，可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力
7．通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是(　　)
A．将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
B．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数
C．取104、105、106倍的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上
D．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
8．“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中，配制LB全营养培养基的目的是(　　)
A．作为实验组，分离尿素分解菌
B．作为对照组，检测培养基灭菌是否彻底
C．作为对照组，观察尿素分解菌在含有酚红培养基上的菌落形态
D．作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量
9．某同学依据如图操作步骤，从土壤中分离能分解尿素的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是(　　)
A．尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂
B．以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌
C．利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率
D．两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2＝乙1/乙2)
10．(2024·嘉兴高二期中)益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。研究小组尝试检测某品牌益生菌中的活菌含量，实验步骤为制备培养基→调节 pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是(　　)
A．培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
B．经高压灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
C．对该品牌益生菌进行计数时，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
D．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
11．(2024·杭州高二期末)营养缺陷型菌株是突变后代谢过程中某些合成反应不能正常进行的菌株。如图是科研人员利用影印法(用无菌的丝绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上)初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程。下列叙述错误的是(　　)
A．可用接种环从斜面中取出保存的菌种，然后诱变处理以获得想要的营养缺陷型菌株
B．①过程接种方法为稀释涂布平板法，接种后的培养皿不能立即进行倒置培养
C．进行②过程的顺序是先将丝绒布“复印”至完全培养基上，再“复印”至基本培养基上
D．氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落中挑选
12．金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下列是某研究小组测定自来水中金黄色葡萄球菌浓度的实验操作，错误的是(　　)
A．在金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，其作用是有利于金黄色葡萄球菌的筛选
B．在制作血平板时需等平板冷却后，才可加入血液，以防止高温破坏血细胞
C．现将10 mL菌液依次稀释成10－1、10－2、10－3、10－4四个稀释样液，再取四个稀释样液各0.1 mL分别接种到4个血平板上，所用方法是稀释涂布平板法
D．若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为3.6×106个
13．(16分)产脲酶的细菌可分解尿素。为筛选产脲酶的菌株，科研人员开展了相关研究。回答下列问题：
(1)为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一___________________，尿素的灭菌方法是___________________________________________________________。
(2)称取1 g土壤样品，加入99 mL__________中，制备成土壤细菌悬液。若用稀释涂布平板法计数细菌的个数，要使所得估计值更接近实际值，应严格操作，多次重复，还应保证对待测样品________的比例恰当。取0.1 mL 10倍稀释的细菌悬液涂布在固体培养基上，平均长出了25个菌落，则该样本中每克土壤约有产脲酶的细菌________个。
(3)通常筛选菌种时可以通过观察________特征对细菌进行初步鉴定。在筛选产脲酶的细菌时，还可以在培养基中添加________作为指示剂，产脲酶的细菌在培养基中生长一段时间后，菌落周围指示剂将变成________色。
14．(12分)一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可用一定方法选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)现有1 L土壤浸出液，为了对土壤中的细菌进行计数，各取0.1 mL已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养。接种需选择图1工具中的______(填字母)进行实验操作。计数结束记录上述三个培养皿中的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液中菌体数为______________个。
(2)在培养基上形成的菌落中，有透明圈菌落利用的氮源主要是__________，据此可筛选出目的菌。实验结果如图2所示，图中A～E五种菌株中，______是最理想菌株，判断依据是________________________________________________________________________。
(3)在无菌操作下，可将最理想的单菌落用接种环取出，再用________法接种至斜面培养基中。
答案精析
1．B　[据题意分析可知，每毫升样品中的菌落数＝234÷0.1×106＝2.34×109(个)。]
2．C　[对于压在一个方格边缘上的酵母菌的处理方法是只计数每一小方格上方和左侧线条上的酵母菌数(即“数上不数下”“数左不数右”)，A错误；对酵母菌计数时，用滴管吸取振荡均匀的培养液滴满血细胞计数板的方格区，B错误；血细胞计数板的大方格体积＝2×2×0.1＝0.4(mm3)，其中酵母菌数为M，则10 mL培养液中酵母菌数＝M÷0.4×1 000×10×10＝2.5M×105(个)，C正确；某同学按对角线方位计数5个中方格(血细胞计数板规格为25×16，即每个中方格有16个小方格)菌数分别为10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌数＝(10＋11＋8＋10＋9)÷5÷16＝0.6，D错误。]
3．B　[可用血细胞计数板在显微镜下对酵母菌直接计数或用稀释涂布平板法间接计数，A错误；应该先盖盖玻片再滴加培养液，若先向血细胞计数板的计数室中加培养液再加盖玻片会造成统计结果偏大，B正确；获得单菌落后，可挑取菌落，利用划线法接种至斜面培养基中保存，C错误；接种、分离后，使用过的器皿需先经高压灭菌后再洗涤，以免造成环境污染，D错误。]
4．A　[细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，A错误；该计数方法为稀释涂布平板法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故计数结果比显微镜计数法偏小，B正确；若以丙草胺作为唯一氮源，则只有具有降解丙草胺能力的菌株能够存活，故可以提高降解菌的浓度，C正确；根据5号试管的数据可知，每克土壤中菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，D正确。]
5．C
6．B　[步骤②为选择培养，该液体培养基中含有的唯一氮源是尿素，A正确；步骤③的平板培养基应该是以尿素作为唯一氮源的固体培养基，其目的是筛选出分解尿素的微生物，而LB固体培养基中本身就含有氮源，B错误；步骤③采用稀释涂布平板法接种，其目的是通过梯度稀释获得能分解尿素的细菌的单菌落，C正确；尿素在分解过程中会产生氨，进而会导致培养基中pH发生变化，故可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力，D正确。]
7．B　[培养细菌时，要将培养皿倒置，可防止水分过度挥发和冷凝水滴落到培养基表面，并在37 ℃恒温培养24～48小时，A正确；选择菌落数在30～300个的3个平板进行计数，求其平均值，B错误。]
8．D　[配制LB全营养培养基的目的是作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量，以区分选择培养基是否具有选择作用，D正确。]
9．C　[尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂糖和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素溶液用过滤除菌，B错误；两种步骤获得的菌落比值关系为甲1/甲2＞乙1/乙2，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变大，D错误。]
10．C　[由题意可知，益生菌主要在肠道内发挥调节功能，所以其代谢类型是厌氧型，因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢，A正确；经高压灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置，防止水分过度挥发和冷凝水对培养基造成污染，B正确；由于在平板上两个或多个细菌可能会形成一个菌落，所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小，C错误；若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养，如果出现了菌落，则说明培养基被污染，D正确。]
11．C　[可用接种环从斜面中取出保存的菌种，放在摇床上振荡培养然后诱变处理以获得想要的营养缺陷型菌株，A正确；由接种后的菌落分布情况可推测该过程接种的方法为稀释涂布平板法，为防止培养液滴落，接种后的培养皿不能立即进行倒置培养，B正确；进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布“复印”至基本培养基上，再“复印”至完全培养基上，C错误；在基本培养基中氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，比较基本培养基和完全培养基中的菌落可知，氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落中挑选，D正确。]
12．D　[由于金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，7.5%NaCl在不影响金黄色葡萄球菌生长的同时还抑制其他菌的生长，因此，金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，有利于金黄色葡萄球菌的筛选，A正确；若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为(35＋36＋37)÷3÷10－3÷0.1×1 000＝3.6×108(个)，D错误。]
13．(1)氮源　用已高压灭菌的G6玻璃砂漏斗过滤除菌　(2)无菌水　稀释　2.5×105　(3)菌落　酚红　红
14．(1)B　5.6×108　(2)该除草剂　E　透明圈直径与菌落直径比值最大　(3)划线
解析　(1)常用稀释涂布平板法对土壤中细菌进行计数，稀释涂布平板法要用B(涂布器)进行操作。每升土壤浸出液中菌体数为(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108(个)。(2)要筛选降解该除草剂的菌体，培养基中应该以该除草剂作为唯一氮源。图中E菌株透明圈(降解圈)直径与菌落直径比值最大，故是最理想的菌株。(3)菌种保藏时，可将单菌落取出用划线法接种在斜面培养基中。(共64张PPT)
第一章 发酵工程
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第1课时
目标微生物的分离和纯化
学习目标
1.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。
2.尝试分离和纯化酵母菌。
内容索引
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
课时对点练
二、活动：接种、培养并分离酵母菌
采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
一
梳理　教材新知
1.单菌落：在　　　培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养获得的由__________分裂形成的、 的、有一定形态构造的子细胞集团。
固体
一个细胞
肉眼可见
2.目标微生物分离和纯化的两种方法
微生物
连续平行
扇形
梯度稀释
固体
涂布器
划线的尾部
稀释度适当
多次连续平行
提醒　(1)扇形划线：从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。
(2)多次连续平行划线：划线分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。
(3)稀释涂布平板法：接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记。
(1)采用划线的方法接种时，每划一条线前接种环都要灼烧灭菌(　　)
(2)多次连续平行划线时，接种环已灭菌，整个划线过程中不再灭菌
(　　)
(3)与平板划线法相比，稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的效果更好(　　)
√
×
√
任务一：微生物的分离和纯化的原理
1.多次连续平行划线法的操作中，在进行第二次及之后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因：划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要　　，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步　　　，最终能得到由　　　细胞繁殖而来的菌落。
探究　核心知识
少
减少
单个
2.为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
提示　最后一次划线已经将菌种稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了菌种的数目，达不到纯化的效果。
3.稀释涂布平板法也是常用的微生物分离和纯化方法。某同学欲通过稀释涂布平板法了解某牛奶中大肠杆菌的含量，进行了相关的实验操作。请分析回答下列问题：
(1)如何获得该牛奶的10倍、100倍、1 000倍稀释液？
提示　向1 mL牛奶中加入9 mL无菌水，获得10倍稀释液；再取1 mL 10倍稀释液，加入9 mL无菌水，获得100倍稀释液；取1 mL的100倍稀释液加入9 mL无菌水，获得1 000倍稀释液。
(2)接种前，该同学将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，这样做的目的是什么？
提示　避免涂布器上可能存在的微生物污染培养基，影响实验结果。
(3)该同学应如何确定哪些菌落是大肠杆菌的单菌落？
提示　根据大肠杆菌菌落特有的形状、大小、颜色、边缘、表面光滑与否等特征进行确定。
核心归纳
平板划线操作中三种灼烧的目的
项目 目的
蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种
每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端
划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
1.(2024·宁波北仑中学高二期中)在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列有关叙述错误的是
A.操作过程中，接种环蘸取菌液1次，至少
　需灼烧5次
B.连续划线的目的是获得单个细胞形成的菌落
C.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
D.图甲中的a区域为划线的起始区域
√
落实　思维方法
操作过程中，接种环蘸取菌液1次，划线了4次，至少需灼烧5次，A正确；
连续划线可以将聚集的菌种逐步稀释，以便获得由单个细胞生长繁殖成的单菌落，B正确；
为了防止空气中杂菌的污染，蘸取菌液和划线都要在酒精灯火焰旁进行，C正确；
分析图乙可知，a对应的区域出现了单菌落，d对应区域菌落最多，因此a区域应该为划线的最终区域，d区域为划线的起始区域，D错误。
2.图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是
A.图甲中涂布前要将涂布器灼烧，
　冷却后才能涂布菌液
B.对于浓度较高的菌液，若图甲中
　的最高稀释倍数仅为102，则所
　得到的菌落不一定是由单个的细胞繁殖而成的
C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落
D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外)
√
平板划线法中多次划线的目的是降低菌种浓度，经过连续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符合要求，C错误。
活动：接种、培养并分离酵母菌
二
1.目的要求
(1)用　　　　　法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用　　　培养基大量扩增酵母菌。
梳理　教材新知
平板划线
液体
2.方法步骤
底部
灼烧灭菌
培养容器内壁
稀释
中央
不接
种菌液
斜面
(1)用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上(　　)
(2)用接种环取出菌种后需马上塞上装菌种试管的棉塞，然后再划线
(　　)
(3)用固体培养基更容易大量扩增酵母菌(　　)
√
×
×
任务二：酵母菌培养过程的注意事项和结果分析
1.如何判断培养基是否被杂菌污染？
探究　核心知识
提示　培养未接种的培养基，观察是否有菌落生长。如果有，说明培养基被杂菌污染。
2.如果培养基出现不同颜色特征的菌落，你认为出现的原因是什么？
提示　可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等。
3.仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎么进行进一步鉴定？
提示　不能。
可以利用生化实验及显微镜观察来进一步鉴定，如①挑取单菌落接入糖水中，培养一段时间检查是否能产生酒味；
②接入面团中观察能否发面；
③挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别。
4.判断液体培养基中接种酵母菌成功的依据是什么？
提示　和对照组相比，培养基变浑浊。
5.平板倒置的目的是什么？
提示　防止水分过度挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基。
6.制作平板和平板划线法接种时，哪些操作可防止杂菌污染？
提示　(1)倒平板：①要使三角瓶的瓶口通过酒精灯火焰；②不要让培养基溅在培养皿内壁与皿盖上；③用拇指和食指将培养皿打开一条缝隙，将培养基倒入，立即盖上皿盖。
(2)平板划线法接种：①在酒精灯火焰旁划线；②接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧；③取菌液前后，要将试管口通过酒精灯火焰；④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养皿表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
核心归纳
(1)培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明培养基未被污染。
(2)在接种酵母菌的固体培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在固体培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
实验结果的分析
3.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是
A.对比观察培养基的成分是否相同
B.对比分析培养基是否被杂菌污染
C.没必要放入未接种的培养基
D.为了下次接种时再使用
√
落实　思维方法
对未接种的培养基进行培养，起到对照作用，可确定培养基是否被杂菌污染。
4.平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是
A.每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次
B.划线分离结束后接种环无需再进行灭菌
C.在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行
D.划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
√
划线分离时，菌种只蘸取一次，A错误；
划线分离结束后，接种环仍需进行灼烧灭菌，B错误；
微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确；
划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　纯化和分离微生物的方法
1.采用平板法培养微生物的过程中，使微生物均匀分布在培养基上需要用到的工具是
A.接种环 B.涂布器
C.接种针 D.胶头滴管
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对点训练
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2.如图表示培养和分离X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是
A.步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B.步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后进行平板划线
C.步骤③应多个方向划线，使菌种逐渐分散，培养后出现单菌落
D.步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行计数
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对点训练
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对点训练
步骤①倒平板操作时，倒好后待平板冷却凝固，然后将其倒过来放置，A错误；
步骤②将接种环在火焰上灼烧后冷却至室温再蘸取菌液进行平板划线，B错误；
步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行分离纯化，得到单菌落，但不可用来计数，D错误。
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3.(2024·台州高二期中)如图为平板划线法接种微生物的示意图，下列说法错误的是
A.观察或比较各种细菌菌落形态的最佳区域是④
B.划线时要注意不能将④区域的划线与①区域相连
C.每次划线后，都应将接种环放在酒精灯火焰上灼烧
D.划线结束时即可看到划线末端出现不连续单菌落
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划线结束后，将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养一定时间后，方可看到划线末端出现不连续单菌落，D错误。
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4.若在固体培养基上用稀释涂布平板法接种细菌，看到的培养结果不可能是
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对点训练
在利用样方法调查种群密度时需注意随机取样、样方的大小和数量合适，调查数据取平均值，A、B、D三项都符合样方法的原则，结果偏差小，C不符合随机取样，结果偏差大，故选C。
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5.稀释涂布平板法是微生物培养的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落
C.需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
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对点训练
稀释涂布平板法操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，以获得单菌落，A正确；
只有稀释度足够高的菌液才可在培养基表面形成单菌落，若稀释度不够大，细菌聚集在一起，得不到单菌落，B错误；
操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防杂菌污染，D正确。
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6.(2024·浙江四校高二联考)下列有关微生物纯培养的叙述，正确的是
A.可用稀释涂布平板法和平板划线法对微生物进行分离和计数
B.在酒精灯火焰附近将冷却至室温的培养基倒入培养皿
C.平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数不同
D.配制培养基的步骤为计算→称量→溶解→灭菌→调pH
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稀释涂布平板法和平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但平板划线法不能用于计数，A错误；
在酒精灯火焰附近将冷却至60 ℃左右的培养基倒入培养皿，B错误；
平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数比划线次数多一次，因为划线完之后为避免污染还需再灼烧一次，C正确；
配制培养基的步骤为计算→称量→溶解→调pH→灭菌，D错误。
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题组二　接种、培养并分离酵母菌
7.下列依次表示倒平板、接种的位置以及平板划线法接种的路径的示意图，其中错误的是
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8.接种、培养并分离酵母菌最常用的方法是平板划线法或稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述，错误的是
A.均将酵母菌接种在固体培养基的表面
B.获得的每一个菌落均是由一个细胞生长繁殖而来的子细胞集团
C.都应在酒精灯火焰附近操作，以防止杂菌污染
D.稀释分散菌种的原理不同，但均能达到纯化酵母菌的目的
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用稀释涂布平板法分离酵母菌时，如果稀释度不够大，获得的菌落就可能是由多个细胞繁殖形成的，B错误。
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9.在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无菌操作。图中符合无菌操作要求的有
①三角瓶口通过火焰，并在火焰旁将培养基倒入灭菌培养皿　②盛菌种的试管口在火焰上灼烧　③接种前灼烧接种环　④接种前培养皿在火焰上灼烧　⑤靠近火焰接种
A.①②③④ B.①②③⑤　　C.①③④⑤ D.②③④⑤
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10.(2024·浙江大学附中高二期中)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下列有关叙述不正确的是
A.对配制的培养基进行高压灭菌
B.使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C.采用平板划线法对获得的菌株进行计数
D.根据菌落的形态和颜色等进行初步判断
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培养基通常采用高压(蒸汽)灭菌法进行灭菌，A正确；
使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，可以防止杂菌污染，B正确；
平板划线法无法对获得的菌株进行计数，应该采用稀释涂布平板法对获得的菌株进行计数，C错误；
菌落形态包括菌落的大小、形状、光泽、质地、颜色和透明程度等，每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征，故可根据菌落的形态和颜色等进行初步判断，D正确。
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11.(2024·浙江余姚中学高二月考)纸片扩散法是药敏试验中一种常用的方法。取少量大肠杆菌的培养液，均匀涂在培养皿内的培养基上，再放上
4片含有链霉素(抗生素的一种)的圆形滤纸，然后在无菌适宜条件下培养12～16 h，滤纸片周围出现抑制大肠杆菌生长的环圈(简称抑菌圈，如图)。
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下列相关叙述错误的是
A.图1中的培养基需冷却至
　60 ℃左右时再倒平板，
　该操作需要在酒精灯旁完成
B.图2中所示培养基的放置方式能防止水分过快蒸发和冷凝水珠冲散菌落
C.图3培养皿上大肠杆菌的接种方式为稀释涂布平板法，Ⅳ号纸片上抗生
　素浓度最高
D.图3所示的抑菌圈内出现大肠杆菌菌落的原因是链霉素使其发生了基因
　突变
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对培养液进行灭菌后需先冷却再倒平板，倒平板时应在酒精灯旁进行，可以尽可能减少培养基污染，A正确；
接种后的培养基需要倒置，这样可以防止培养基中水分过快蒸发，同时防止冷凝形成的水珠倒流冲散菌落，B正确；
图3所示为稀释涂布平板法进行接种，纸片上的抗生素浓度越大，所形成的抑菌圈就越大，故Ⅳ号纸片上的抗生素浓度最高，C正确；
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图3所示Ⅳ号的抑菌圈中出现了少数几个菌落，说明这几个菌落具有抗药性，抗药性的获得是由于这些细菌发生了基因突变，抗生素只是将具有抗药性突变的细菌从中筛选出来，D错误。
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12.如图所示为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果。下列相关说法正确的是
A.该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的
B.在操作时，为防止杂菌污染，需进行严格的消毒
　和灭菌
C.该种微生物有可能是H5N1病毒
D.该培养基上的菌落分布不均匀，代表纯培养失败
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题图最可能是采用平板划线法进行接种的，A错误；
病毒无细胞结构，必须寄生在活细胞中才能生存，因此病毒不能用培养基直接培养，C错误；
平板划线法中随划线次数的增加，菌落密度逐渐减小，因此分布不均匀，D错误。
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13.(2024·宁波效实中学高二期中)野生型伤寒沙门氏菌(his＋)可合成组氨酸，某种突变体丧失了这种能力，必须在添加组氨酸的培养基上才能生长，称为组氨酸营养缺陷型(his)。现用两种方法接种，甲为平板划线法，乙为稀释涂布平板法。下列叙述正确的是
A.两种方法所用培养基均为液体培养基
B.甲接种方法可用于对微生物的分离和计数
C.乙接种方法可用于对微生物的分离和计数
D.his菌株接种在不含组氨酸的培养基上能长出菌落
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甲是平板划线法，乙是稀释涂布平板法，两种方法都是在固体培养基上进行接种的操作，A错误；
平板划线法可用于对微生物的分离纯化，但不能计数，B错误；
稀释涂布平板法可用于对微生物的分离和计数，C正确；
由题意可知，野生型伤寒沙门氏菌可合成组氨酸，his菌株突变体丧失了这种能力，必须在添加组氨酸的培养基上才能生长，D错误。
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14.使用特定的接种技术可以得到目标微生物的单菌落，实现对目标微生物的分离。回答下列问题：
(1)一般情况下，培养基都可以为微生物的生存提供__________________
__________________等。
(2)实验前需要确定培养基灭菌是否彻底，具体的操作是______________
___________________________________________________________。
水、碳源、氮源、
无机盐和生长因子
养基放在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落出现
将未接种的培
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(3)下面是四种菌落的分布情况，其中属于通过稀释涂布平板法得到的是_______(多选)。
ABC
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15.某研究小组从黄色短杆菌(能合成L－亮氨酸)中筛选L－亮氨酸缺陷型(不能合成L－亮氨酸)突变菌株，实验流程如图所示。回答下列问题：
(1)培养基灭菌常用的方法是_________________。
高压蒸汽灭菌法
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(2)过程①的接种方法是_______________。过程②接种时，先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因是_________________________________。
稀释涂布平板法
培养皿B、C中的菌种接种位置相同
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根据过程①所得培养基中菌落的分布结果可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法。
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(3)培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因是__________
_____________________。若培养皿B的培养基中含有L－亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L－亮氨酸，培养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养皿____(填“B”或“C”)中选取目的菌落。
便于观察菌
落特征和分离目的菌株
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综合强化
为了便于观察菌落特征和分离目的菌株，培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基。在不含L－亮氨酸培养基中，突变菌株不能生长，而在含L－亮氨酸培养基中能够生长，因此从培养皿B中的菌落中可挑选出突变菌株。
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