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第1节 植物细胞工程
第1课时：植物细胞工程的基本技术
学习目标
1.简述植物组织培养和植物体细胞杂交的原理和过程。(生命观念)
2.“结合菊花的组织培养”的实验操作，尝试设计植物组织培养技术的流程简图。（科学探究）
3.查阅资料，尝试探究植物生长素和细胞分裂素使用比例对植物组织培养的影响。(社会责任)
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
动物细胞工程
植物细胞工程
原理
操作水平
目的
植物组织培养
植物体细胞杂交
1.细胞工程的概述
分类
兰花
灰绿色
世上最贵的兰花,没有之一
！
市场价格：
1500万每株！
【资料】
利用兰花芽的细胞经组织培养，可以培育为成熟植株。
中国科学院华南植物园华南农业植物遗传育种和分子改良重点实验室吴坤林、曾宋君等科研人员完成的“一种火焰兰一次成苗快速繁殖方法及培养基”获得国家发明专利授权。
讨论：
1.为什么利用植物的体细胞（如芽细胞）就能培养出完整植株？
2.是否所有的植物细胞都适合进行植物的组织培养？
正常的植物体细胞具有该生物生长发育和繁殖所需的全套遗传物质，具有全能性。
不是；没有细胞核的筛管细胞无全能性，不适合进行植物的组织培养。
1.细胞全能性
一般来说，生物体的每一个细胞含有控制该生物发育的全部基因
原因
生物体内细胞并不都表现全能性
原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达
体现全能性的标志
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能
不体现全能性的实例：
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
高等植物成熟的筛管细胞、哺乳动物成熟的红细胞因失去了核遗传物质，所以不具备全能性
种子发育成植株，体现了植物种子的全能性。（ ）
胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株。（ ）
受精卵发育成个体。（ ）
胚胎干细胞分化成其他种类的细胞。（ )
×
√
√
√
注意：具有全能性≠表现出全能性。
①不同细胞的全能性：
受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞（卵细胞＞精子）＞体细胞
②不同生物的细胞全能性：
植物细胞＞动物细胞
③体细胞的全能性：
幼嫩的细胞＞衰老的细胞
分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞
分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞
全能性大小的比较
但是高度分化的生殖细胞的全能性大于体细胞的全能性
一般来说，细胞分化程度越高，全能性 ；
随着细胞分化程度的不断提高，细胞的分裂能力和细胞的全能性 。
越低
逐渐降低
（动物细胞具有全能性，但目前只有细胞核能体现全能性）
【思考】配子中染色体数比正常体细胞减少了一半，为什么配子还有全能性？
在体细胞中染色体成对存在，配子染色体数虽然减半，但仍含有完整的染色体组，具有控制生物性状的全部基因。
——如何才能让细胞表现出全能性？
植物组织培养技术011、概念：指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。3、大致过程：2、理论基础：植物细胞的全能性脱分化
再分化
脱分化：
已分化细胞，失去其特有结构和功能而转变成未分化的细胞的过程。
愈伤组织：
细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、不定形的薄壁组织团块。
再分化：
愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。
注意：过程中涉及的生命活动只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化。
该培养过程一般不需要光照
注意：过程中涉及的生命活动：既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。
需要给予适当光照，诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
植物组织培养技术01已分化的细胞未分化的细胞(愈伤组织)不定形的薄壁组织团块。脱分化：愈伤组织：相关概念（芽、根等器官）再分化：外植体：指离体培养的植物器官、组织或细胞。外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽完整植株未分化的细胞已分化的细胞(愈伤组织)脱分化关键操作和再分化 启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素是 。
使用比例 实验结果
有利于根的分化
有利于芽的分化
促进愈伤组织的形成
生长素/细胞分裂素比值高
生长素和细胞分裂素
生长素/细胞分裂素比值低
生长素/细胞分裂素比值适中
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。它们的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向。
比较内容 脱分化 再分化
过程 外植体→愈伤组织 愈伤组织→幼苗
形成体特点 排列疏松、高度液泡化、 不定形的薄壁细胞 有根、芽
需要条件 ①离体； ②适宜的营养； ③生长素/细胞分裂素的比例适中； ④不需光照（避光,有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织） ①离体；
②适宜的营养；
③生长素/细胞分裂素的比例高或低诱导生根或生芽；
④需光照（诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用）
脱分化与再分化的比较
1.实验原理：
①植物细胞一般具有______；
全能性
②在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过______和______，形成________，长出_______，进而发育成__________；
脱分化
再分化
胚状体
芽和根
完整的植株
③植物激素中______和__________是启动_________、______和______的关键激素，它们的_____、_____等都会影响植物细胞的发育方向；
生长素
细胞分裂素
细胞分裂
脱分化
再分化
浓度
比例
2.实验目的：
①了解植物组织培养的基本原理；
②了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量的比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响；
③尝试进行植物组织培养。
探究·实践
菊花的组织培养
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。它们的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向。
探究·实践
菊花的组织培养
植物激素的作用：
思考：决定植物脱分化、再分化的关键激素？
细胞分裂素
生长素
芽分化
愈伤组织
根分化
巧记：高根低芽中愈伤
生长素用量 / 细胞分裂素用量 结果
比值≈1
比值＞1
比值＜1
促进根的分化
促进芽的分化
促进愈伤组织的形成
生长素作用：用于诱导细胞的 和 的分化；
细胞分裂素作用：促进组织细胞的分裂或促进 的分化。
伸长生长
根
芽
材料用具
①外植体：
幼嫩的菊花茎段
(细胞分裂旺盛，容易诱导形成愈伤组织)
②体积分数为70%的酒精：
对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液:
对外植体进行消毒
④无菌水:
清洗外植体
⑤培养基（参见本书附录1）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）；
灭菌方法为：
湿热灭菌法(高压蒸汽灭菌)
植物组织培养常用的培养基配方
P116
⑴培养基名称： ；
⑵物理性质： ；
⑶碳源： 。
包括无机营养成分(水和无机盐)、
有机营养成分(蔗糖、氨基酸、维生素等)、
特定浓度和比例的激素(主要是生长素和细胞分裂素)；
蔗糖的作用：
作为碳源，提供能量，调节渗透压
固体培养基
有机碳源(蔗糖)
MS培养基
固体培养基
葡萄糖和果糖在与蔗糖提供相同数量碳源的前提下，其造成的渗透压可能过高。
问题1：植物是自养生物，为什么用于植物组织培养的MS培养基中需要加入蔗糖等有机物作为碳源？
通常植物体本身进行光合作用产生糖类，不需要外部供给糖，但植物组织培养利用的是离体组织或细胞，在其脱分化过程中不能进行光合作用合成糖类，因此必须在培养基中添加糖类，作为碳源和能源物质，同时维持细胞的渗透压。
问题2：同微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
微生物培养基以有机营养为主。
与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，含有植物生长必需的大量元素和微量元素，还需要添加植物激素。
菊花的组织培养
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
防止杂菌生长。
一方面杂菌与培养物竞争营养；
另一方面杂菌产生有害物质危害培养物。
为什么进行无菌操作？
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
双手和超净工作台台面:
用酒精擦拭
外植体:
将酒精和次氯酸钠溶液清洗干净
为什么？
菊花的组织培养
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成
0.5～1cm长的小段。
双手和超净工作台台面:
用酒精擦拭
外植体:
菊花的组织培养
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
接种外植体时，不要倒插！
（将“形态学上端”朝上）
生长素的极性运输有关；
生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。
【注意】
接种操作应在酒精灯火焰旁进行，但注意塑料的瓶口不可灼烧；
菊花的组织培养
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
置于黑暗
有光时，容易分化成其他组织，如维管组织，而不易形成愈伤组织。
若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？
为什么？
愈伤组织中不含有叶绿体；培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。
菊花的组织培养
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
培养15~20天后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
置于光照！
每日需要给予适当时间和强度的光照(芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照)
如何诱导？
生长素比例多
诱导生芽：
生长素比例少
诱导生根：
思考1：为什么要先诱导生芽，再诱导生根呢？
①根的质地较硬，更换培养基时可能会导致根的损伤或断裂
②若先生根后面就不易生芽，维管束等对接不上，影响后续生根过程中物质的运输和分配提供便利。
菊花的组织培养
消毒
取材
接种
脱分化
再分化
移栽
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。
用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。
每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
炼苗！
移栽！
观察！
讨论：培育的试管苗能直接移栽露地吗？
在移栽前一般需要炼苗,目的是提高组培苗对外界环境条件的适应性。
菊花的组织培养
若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性；
植物组织培养中细胞表现出全能性的条件
（2）离体（最关键）:
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；
②对培养基和器械进行灭菌；
③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行；
（4）适宜的培养条件:
（5）适宜浓度和比例的激素:
（6）适宜的营养条件:
温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）；
光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。
包括有机营养成分、无机营养成分、适宜浓度和比例的激素
主要是生长素和细胞分裂素
（3）严格的无菌条件:
（1）细胞的结构完整、活性正常
课堂小结
植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同
植物体细胞杂交技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为两种生物之间存在着天然的生殖隔离
植物体细胞杂交技术
1.过程：
植物细胞融合 + 植物组织培养
（1）去除细胞壁
去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
方法：酶解法
酶解法原理：植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成；酶具有专一性
原生质体
植物体细胞杂交技术
1.过程：
植物细胞融合 + 植物组织培养
（2）原生质体间的融合
①原理：细胞膜具有一定的的流动性
②方法：
物理法：电融合法、离心法等
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法等
注意：去除细胞壁和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。将细胞放在等渗或略大于的溶液中，防止原生质体吸水而涨破，保持原生质体正常。
原生质体融合
酶解法去壁
植物体细胞杂交技术
马铃薯细胞
番茄细胞
正在融合的原生质体
马铃薯原生质体
番茄原生质体
植物体细胞杂交完成的标志
原理：植物细胞的全能性
再分化
杂种植株
移栽
移栽后的植株
脱分化
愈伤组织
植物组织培养
杂种细胞
原生质体融合成功的标志
再生出细胞壁
植物细胞融合
原理：细胞膜的流动性
筛选
人工诱融
酶解法去壁
1.过程：
植物细胞融合 + 植物组织培养
植物体细胞杂交技术
在此基础上，科学家们利用植物体细胞杂交技术，又相继培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种。我国科学家还在木本植物的体细胞杂交方面培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
名称 植物组织培养 植物体细胞杂交
原理 细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性
过程
注意 事项 ①取材：选取有形成层的部位最容易诱导形成愈伤组织； ②光照：在愈伤组织分化出芽和叶时，一定要有光照，以利于叶片内叶绿素的合成 ①去壁方法：酶解法，所用的酶是纤维素酶和果胶酶；
②人工诱导融合的方法：
物理法：电融合法、离心法等；
化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等
联系 植物体细胞杂交技术包括植物细胞融合和植物组织培养两个过程，植物组织培养是植物体细胞杂交的一个环节，融合的体细胞只有通过植物组织培养才能发育成完整的个体 课堂小结
植物体细胞的杂交技术
植物细胞工程的基本技术
去除细胞壁
再生细胞壁
纤维素酶果胶酶
植物细胞A、B
原生质体A、B
融合的原生质体
杂种细胞
原理：植物细胞的全能性
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
(根、芽)
完整植株
物理法：
化学法：
电融合法、离心法等
聚乙二醇（PEG）融合法等
菊花的组织培养技术
愈伤组织
脱分化
杂种植株
再分化
植物组织培养技术
流程
(1)植物体细胞杂交技术的目的是获得杂种细胞(　　)
(2)植物体细胞杂交利用了植物组织培养技术(　　)
(3)植物原生质体融合的原理是植物细胞的全能性(　　)
(4)利用物理法或化学法可以直接诱导两个植物细胞融合(　　)
判断正误
×
获得杂种植株；
√
×
细胞膜具有流动性；
×
应先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得具有活力的原生质体，
再用物理法或化学法诱导原生质体融合；
【从社会中去】手指植物：植物组织的新宠
“手指植物”通常培育在装有彩色固体培养基的小玻璃瓶中，只要保证充足的光照和适宜的温度，不需要额外补充水分或营养物质，它们就能在玻璃瓶中生长三四个月之久。
学习了本节课之后，你也可以尝试制作“手指植物”。如果有商店正在出售这种植物，你还可以做个市场调查，了解它们的销售情况和经济效益。

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