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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
科技探索之路
动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
发酵工程
目录 /CONTENTS
01
02
动物细胞培养的条件
干细胞培养及应用
微生物的纯培养
03
习题检测
机体给体内的细胞提供了哪些适宜的条件使其能够维持正常的生命活动
动物细胞培养实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养，你认为体外培养动物细胞需要满足哪些条件
【合作探究】
一、动物细胞培养的条件
任务一
阅读教材P43—44，结合选择性必修一所学内容思考以下问题：
机体给体内的细胞提供了哪些适宜的条件使其能够维持正常的生命活动
动物细胞培养实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养，你认为体外培养动物细胞需要满足哪些条件
提供了两个方面的条件:
营养条件：如糖类、氨基酸、无机盐等;
环境条件：如温度、pH、渗透压等。
动物细胞培养的条件
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒环境
适宜的温度、PH、渗透压
适宜的气体环境
营养条件
其他条件
将细胞所需的________按
其_____和_________严格
配制而成的培养基。
营养物质
种类
所需量
使用合成培养基时，通常需加入____等一些天然成分
血清
①已知成分
(1)已知成分：
(2)未知成分：
合成培养基
(液体培养基)
概念：
成分：
糖类、氨基酸、无机盐、
维生素等
营养
1
血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；
血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；
血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附；
因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
营养
1
资料：
人们对所需营养物质尚未全部研究清楚，因此需要加一些天然成分
(1)对______和____________进行_____处理；
(2)在________下进行操作；
(3)还需要______________。
培养液
所有培养用具
灭菌
无菌环境
定期更换培养液
在细胞培养液中添加一定量的抗生素
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
如何防止培养过程中的微生物污染？
定期更换培养液的目的是什么？
2
无菌、无毒的环境
多数动物细胞生存的适宜pH为________
(1)适宜的温度：
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
哺乳动物细胞培养的温度多以_ __________为宜；
维持适宜渗透压的目的______________________
(2)适宜的pH：
(3)适宜的渗透压：
3
温度PH和渗透压
动物细胞培养所需气体主要有___和____
用培养皿或松盖培养瓶,
在含有 ___和___ _的混合气体的__________
O2
CO2
细胞代谢所必需的
维持培养液的pH
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
(1)组成
不同气体的作用是什么？
(2)培养仪器
（95%）O2:
（5%）CO2：
4
气体环境
动物细胞培养的基本操作过程是什么？
过渡
根据动物细胞培养的概念初步构建动物细胞培养的流程
培养前，为什么要将组织分散成单个细胞
怎样将组织分散成单个细胞
细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是为什么 怎样解决这一问题
阅读教材“动物细胞培养的过程”，思考、回答下列问题：
二、动物细胞培养流程
【自主学习】
任务二
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
传代培养
放入CO2培养箱中培养
二、动物细胞培养流程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
(1)取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
(2)取材原因:
其细胞生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强。
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
1
取动物组织
(2)培养前分散成单个细胞原因
(1)方法:
机械法、胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）等处理
分散成单个细胞便于从培养液中获得营养，排出代谢废物，利于继续培养。
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
2
分散成单个细胞
将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞
胃蛋白酶不可以，pH不适宜
细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞，要控制好时间。
(3)胰蛋白酶的作用：
(4)胃蛋白酶可以吗？理由：
(5)用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
2
分散成单个细胞
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②贴壁生长类：
(1)操作方法：
(2)体外培养的动物细胞类型
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
3
制细胞悬液培养
细胞贴壁过程
贴壁生长与接触抑制
细胞贴壁与接触抑制
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附
(1)细胞贴壁:
悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；
(2)接触抑制:
贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞停止分裂增殖的现象
形成一层细胞
可形成多层细胞
肿瘤细胞失去接触抑制，适宜条件下在培养液可以无限增殖下去。
细胞悬液
细胞贴壁、接触抑制
细胞贴壁与接触抑制
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
判断依据：是否分瓶！
(1)原代培养：
(2)传代培养：
指动物组织经处理后的初次培养
分瓶后的细胞培养。
(3)分瓶传代培养的原因：
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
4
原代培养传代培养
用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，再用离心法收集
制成细胞悬液分瓶培养
收集细胞
加培养液
①悬浮培养的细胞:
②贴壁细胞:
直接用离心法收集
(3)传代培养操作流程
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
4
原代培养传代培养
有关动物细胞培养的问题
思考 讨论
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养 为什么
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
提示：
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分无机营养成分植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
植物激素
血清
有关动物细胞培养的问题
思考 讨论
2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处
植物组织培养 动物细胞培养
特殊环境条件
结果
是否体现细胞的全能性
过程
相同点 再分化需光
气体环境
一般获得新的植株
获得大量细胞
是
否
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽
幼苗
完整植株
移栽成活
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
有关动物细胞培养的问题
思考 讨论
什么是干细胞？它有哪些类型？这些类型各有怎样的特点和哪些方面的应用？
科学家是怎样获得诱导多能干细胞（IPS细胞）的？
这种细胞与胚胎干细胞相比，有哪些应用优势？
干细胞用于临床治疗可能存在什么问题？
你如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
三、干细胞培养及其应用
阅读教材中“干细胞培养及其应用”的内容，思考、回答下列问题。
【自主学习】
任务三
(3)分布：
(4)分类：
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
(2)特点：
体积较小，细胞核大，核仁明显。
干细胞
(1)概念：
受精卵
原始胚胎干细胞
囊胚
胎儿
成人
胚胎干细胞
成体干细胞
目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
(1)来源：
(2)作用：
(3)成果：
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
1
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
(1)来源：
(2)分类：
(3)作用：
(骨髓外周血和脐带血中)
(神经系统中)
(睾丸中)
成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞
神经干细胞
造血干细胞
精原干细胞
血细胞
精原细胞
分化
分化
分化
神经细胞
2
成体干细胞
2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
(1)诱导多能干细胞的概念
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
3
诱导多能干细胞
资料：
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
3
诱导多能干细胞
(2)诱导iPS细胞及其应用
病人
神经细胞
肌肉细胞
血细胞
造血干细胞
体细胞
器官
① 诱导iPS细胞形成正常神经干细胞，可以治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾
② 诱导iPS细胞形成正常造血干细胞，移植后可恢复病人的造血和免疫功能。病（如帕金森病、阿尔兹海默症等）。
③ 诱导iPS细胞形成心肌细胞等，可以治疗心血管疾病。
3
诱导多能干细胞
(2)诱导iPS细胞及其应用
(3)诱导多能干细胞优点：
①诱导过程无须破坏胚胎；
3
诱导多能干细胞
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
本节小结
练习与应用
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
一.概念检测
×
√
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二.拓展应用

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