资源简介

(共49张PPT)
§3-1 重组DNA技术的基本工具
基因工程
抗虫棉
棉花细胞
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
基因工程
抗虫基因
提取
苏云金芽孢杆菌（简称Bt）
(有抗虫特征)
考
点
别 名 基因拼接技术
或DNA重组技术
操作环境 生物体外
操作对象 基 因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
结 果 人类需要的基因产物
原 理 基因重组（广义）
基因工程的概念考点解析：
优点：
定向改造生物体的性状（目的性强)
基因重组的三种类型
①减数第一次分裂前期：同源染色体上的非等位基因重组
②减数第一次分裂后期：非同源染色体上的非等位基因重组
③基因工程操作导致的基因重组
①不同生物的DNA能够进行拼接吗？
②Bt基因在棉花细胞中能够表达？
①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界共用一套遗传密码
理论基础
苏云
金杆菌
Bt基因
普通棉
花DNA
抗虫棉
提取
导入
表达
能，
①DNA的基本组成单位相同
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
到社会中去
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
基因进入受体细胞的载体
【易错警示】工具酶≠工具
基因工程的基本工具
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
1.来源：
2.种类：
主要来自原核生物
限制酶
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
3.作用特点：
专一性
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
限制酶
限制酶
切割的是什么？
两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
氢键自动断开
4.识别序列：
EcoR Ⅰ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
Sma Ⅰ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamH Ⅰ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
Taq Ⅰ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链5’往3’读的顺序完全一致。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
黏性末端　　　　
黏性末端
EcoRI限制酶的切割
只能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开。
一.重组DNA技术的基本工具----限制酶
平末端　　　平末端
SmaI限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开
一.重组DNA技术的基本工具----限制酶
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
5.切割结果：
产生黏性末端或平末端
推断限制酶切一次：
断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，
消耗 分子水。
两
2
2
两
6. 种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约
4000种限制性内切酶(限制酶)。
EcoRⅠ
SmaⅠ
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
练习：流感嗜血杆菌的d菌株
( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ:
-G
-CCTAG
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
GATCC-
G-
Bgl Ⅱ:
EcoR Ⅰ:
-G
-CTTAA
AATTC-
G-
形成的黏性末端（从5’往3’读）
Hind Ⅲ:
-A
-TTCGA
AGCTT-
A-
-A
-TCTAG
GATCT-
A-
同
尾
酶
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
思考
同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同限制酶切割，产生的黏性末端可能相同，也可能不同。
技巧：图片倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割
下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( )
① ②
③ 　　　 　④
　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
B
一.重组DNA技术的基本工具----限制酶
①判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割
②两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两个片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点
-G
-CCTAG
GATCT-
A-
GATCC-
G-
请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
①
②
③
3
若为同种限制酶，则切割形成的黏性末端及切割位点应相同。
【P71旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。
【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
1.作用：
2.种类：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合____________ 缝合__________和_______________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率低)
磷酸二酯键
注意：不是连接氢键
（氢键的形成不需要酶的催化）
E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
两DNA片段要具有相同的黏性末端才能拼起来
DNA聚合酶的作用
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
A A T T G
A
A
A
T
T
不是，连接的对象不同
A
DNA聚合酶
A
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
一.重组DNA技术的基本工具--DNA连接酶
旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用对象 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
DNA
DNA片段
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将DNA切成两个片段，形成
黏性末端或平末端
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成新的DNA分子
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
思考3：Bt基因是否可以直接导入到棉花细胞（受体细胞）？为什么？
否，目的基因直接导入受体细胞可能会被细胞中的酶降解或不能复制、表达。
思考4：有没有什么DNA分子可以进入宿主细胞并复制表达？
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.作用：
2.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
3.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
标记基因
其基因属于细胞质基因。
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
标记基因：①抗生素抗性基因②荧光蛋白基因
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
4.运载体需具备的条件：
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制
或整合到受体DNA上，随受体DNA同
步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点，
便于插入（携带）目的基因；
③具有标记基因，便于筛选含有重组
DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切位点，你会用它做载体吗？
如何确定目的基因是否进入受体细胞了？
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
标记基因的筛选原理
思考·讨论：重组DNA分子
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
1、剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
2、你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
3、你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
4、从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割____次此DNA分子，产生____个黏性末端。
2
4
链状DNA分子
1个酶切割位点，若用限制酶完全切割完后形成____个DNA片段
2个酶切割位点，若用限制酶完全切割完后形成____个DNA片段
环状DNA分子
1个酶切割位点，若用限制酶完全切割完后形成____个DNA片段
2个酶切割位点，若用限制酶完全切割完后形成____个DNA片段
2
3
2
1
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。
产生相同末端，便于连接。
5.目的基因是要与运载体结合的，那如何
处理质粒？
★重组质粒的形成：
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
思考讨论
思考：
1.如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
①目的基因-目的基因连接
③目的基因-质粒连接
②质粒-质粒连接
④目的基因自身环化
⑤质粒自身环化
结论：为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒
双酶切法
技能提升
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了
。但是使用该法缺点是容易发生
以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和载体
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
两
4
思考讨论
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
思考讨论
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
DNA的粗提取与鉴定
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
1.实验原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，
DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
DNA的粗提取与鉴定
2.材料用具
（1）材料：
富含DNA的材料(如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等)、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
（2）用具：
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA
3.方法步骤
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
①研磨的目的：
②研磨时间不宜太长：
③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：
④研磨不宜太用力
DNA的粗提取与鉴定
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
3.方法步骤
（2）过滤获取含DNA的上清液
DNA的粗提取与鉴定
可能含有核蛋白、多糖等杂质
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
过滤能用滤纸代替吗？
低温放置几分钟的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
③使蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
（3）冷却酒精析出DNA
3.方法步骤
DNA的粗提取与鉴定
（4）DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
水浴加热
对照组
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
3.方法步骤
DNA的粗提取与鉴定
4.结果分析
DNA的粗提取与鉴定
鉴定结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变色，影响鉴定效果。
1.怎么确认实验提取出来的是DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比
较浅，说明什么问题？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
4.进一步探究
DNA的粗提取与鉴定
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；
用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
5.进一步探究
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA的粗提取与鉴定
5.进一步探究
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
练习与应用
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2．在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A．大肠杆菌的质粒 B．切割DNA分子的酶
C．DNA片段的黏性末端 D．用来识别特定基因的DNA探针
C
A
【扩展应用】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ, XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用

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