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(共28张PPT)
第1节 基因工程及其技术
【学习目标】
1.简述基因工程的发展历程
2.阐明基因工程所需的三种基本工具的作用
目录
基因工程是在多学科基础上发展而来的
壹
基因工程的基本工具
贰
积极思维
1982年，美国科学家帕米特（R. D. Palmiter，1942—）等人采用显微注射法，将带有大鼠生长激素基因的重组DNA分子导入小鼠受精卵内，将其培育成早期胚胎后再植入代孕小鼠体内继续发育。
小鼠妊娠并成功分娩出携带有大鼠生长激素基因的小鼠。在同样生长条件下，这种转入大鼠生长激素基因的小鼠生长快、体型大，成鼠的体重是同一胎中普通小鼠的1.8倍，有“巨型小鼠”之称。
普通小鼠（左）和巨型小鼠（右）
巨型小鼠与普通小鼠在基因组成上有什么不同？
尝试描述培育巨型小鼠的主要过程？
基因工程是在多学科基础上发展而来的
壹
基因工程是在多学科基础上发展而来的
1.1957年，美国科学家科恩伯格等首次在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶
2.1967年，罗思和海林斯基发现转运工具——质粒(细菌除拟核外还有一种具有自我复制能力的环状DNA分子)；同年，科学家又发现了DNA连接酶
基因工程
3.1970年，特明和巴尔的摩在RNA“肿瘤”病毒中发现了逆转录酶；同年，史密斯等人从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的限制性内切核酸酶
4.1972年，伯格领导的研究小组在世界上首次实现了DNA分子体外重组
5.1973年，科恩领导的研究小组，将大肠杆菌不同的质粒重组，并转化大肠杆菌，获得了成功
基因工程
7.1976年，科学家用质粒为载体，将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌，并于1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子
6.科恩和博耶合作，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段与大肠杆菌的质粒进行重组，再用重组质粒转化大肠杆菌，成功转录出相应的mRNA，这说明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达
8.1977年，桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对完整基因组的核苷酸排列顺序进行测定
基因工程的基本工具
贰
基因工程的基本工具
基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
“分子搬运工”
“分子剪刀”
“分子黏合剂”
DNA重组技术需要的基本工具包括
基因工程的基本工具
1.“分子剪刀”——限制性内切核酸酶（又称限制酶）
（1）特点：特异性（专一性）很强
（2）作用：识别DNA 分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开
（3）切割方式：错位切和平切
基因工程的基本工具
①错位切：在DNA 分子两条链的不同部位进行切割，切割后形成的两个DNA 分子片段的末端均留下一段游离的单链，这种单链称为黏性末端。
例：限制酶EcoR I的错位切产生由4个脱氧核苷酸组成的黏性末端
基因工程的基本工具
②平切：在 DNA 分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成平末端。
例：限制酶Hae III的平切结果
基因工程的基本工具
在基因工程中，科学家常根据需要，采用一定的限制酶识别DNA分子上的不同序列并进行切割。切割后的DNA分子会形成3′端黏性末端、5′端黏性末端或平末端。
限制酶 识别序列与切割部位 产生的末端类型
Bbu Ⅰ 5‘-GCATGC-3’ 3’-CGTACG-5’ 3‘端黏性末端
Hind Ⅲ 5‘-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’端黏性末端
Not Ⅰ 5‘-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCC-5’ 5’端黏性末端
EcoR Ⅰ 5‘-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 5’端黏性末端
Hpa Ⅰ 5‘-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’ 平末端
Alu Ⅰ 5‘-AGCT-3’ 3’-TCGA-5 平末端
基因工程的基本工具
1.限制酶主要存在于原核生物中，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示　限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
2.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示　含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
基因工程的基本工具
2.“分子黏合剂”——DNA 连接酶
①两个具有黏性末端的DNA分子的连接
a.通过碱基互补配对原则可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来
b.DNA分子基本骨架之间的磷酸二酯键通过DNA连接酶的作用连接
②DNA连接酶的分布及作用
a.分布：广泛存在于各种生物体内
b.作用：在DNA复制、修复以及体内外重组过程中起着重要作用
基因工程的基本工具
限制酶和DNA连接酶的作用示意图
基因工程的基本工具
③种类
种类 来源 作用
E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 可以用于连接具有黏性末端的DNA分子
T4 DNA连接酶 T4噬菌体 可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子
基因工程的基本工具
④与DNA相关的几种酶的比较
比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA
分子局部解
旋为单链
基因工程的基本工具
1.下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题：
(1)图中限制酶切割后产生黏性末端的是哪些酶？产生平末端的是哪些酶？如果是黏性末端，请画出切割后的末端。
提示　酶1、酶2切割后为黏性末端，酶3、酶4切割后为平末端；酶1切割后的末端为：
酶2切割后的末端为：
基因工程的基本工具
(2)酶1与酶2切割后产生的片段能用DNA连接酶连接起来吗？如能连接，说明什么？
提示　能；由此说明只要限制酶切割后产生的黏性末端互补(或相同)就可以用DNA连接酶连接起来
2.基因工程中能将DNA连接酶替换为DNA聚合酶吗？为什么？
提示　不能；DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸加到DNA片段上，而DNA连接酶是将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
基因工程的基本工具
3.“分子搬运工”——载体
将外源基因导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。
（1）种类：质粒（最早被应用）、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等
（2）载体应该具有的 DNA 序列
序列 原因
复制原点 使外源基因在受体细胞中稳定复制和遗传
标记基因 用于鉴定和选择重组DNA分子
多种限制酶的切割位点 供外源基因的插入
基因工程的基本工具
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
基因工程的基本工具
质粒的特点、本质及作为载体所具备的条件
(1)特点：质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的环状双链DNA分子
(2)本质：质粒是独立于真核细胞的细胞核或原核细胞的拟核DNA之外的小型DNA分子，不是细胞器
(3)质粒作为载体所具备的条件
条件 原因
稳定存在并能自我复制(有复制原点) 目的基因稳定存在且数量可扩大
有多种限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的鉴定和选择
无毒害作用 避免受体细胞受到损伤
课堂小结
基因工程及其技术
基因工程是在多学科基础上发展而来的
基因工程的基本工具
“分子搬运工”
“分子黏合剂”
“分子剪刀”
限制酶
DNA连接酶
载体
随堂检测
1.用人的胰岛素基因制成DNA探针检测下列物质，不能形成杂交分子的是( )
A.人胰岛α细胞的mRNA B.人肝细胞的DNA
C.人胰岛α细胞中的DNA D.人胰岛β细胞的mRNA
解析：人胰岛α细胞、人胰岛B细胞和肝细胞中都有胰岛素基因,但该基因只有在胰岛B细胞中表达。用人的胰岛素基因制成的DNA探针既可以与胰岛素基因杂交形成杂交分子,又可以与胰岛素基因转录产生的mRNA杂交形成杂交分子。
A
2.在基因工程操作中限制性内切核酸酶是不可缺少的工具。下列关于限制性内切核酸酶的叙述，错误的是( )
A.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA
B.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取
C.限制性内切核酸酶的活性受温度和pH等因素的影响
D.一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
解析：A、限制性内切核酸酶也只能识别和剪切DNA,A错误； B、限制性内切核酸酶主要来自原核生物，B正确；C、酶的活性受温度和pH等因素的影响，C正确； D、一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D正确。故选：A。
A
3.DNA重组技术需要使用多种工具酶，下图为4种限制性内切核酸酶的切割位点示意图。下列叙述正确的是( )
A.限制性内切核酸酶的识别序列只能由6个核苷酸组成
B.Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接
C.Sma Ⅰ和EcoR V切割的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接
D.Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段连接后，仍能被Spe Ⅰ和Xba Ⅰ识别切割
解析：A、多数限制酶识别的序列是6个核苷酸组成的，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，A错误；B、Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段有相同的黏性末端，可以用T4 DNA连接酶连接，B正确；C、由图可知，Sma Ⅰ和EcoR V切出的为平末端，应用T4 DNA连接酶连接，C错误；D、由图可知，Spe Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列不同，Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段连接后，若为Spe Ⅰ切割的两个片段连接，则不能被Xba Ⅰ切割，反之亦然，D错误。
B

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