资源简介

(共30张PPT)
基因工程及其技术
1.简述PCR的原理、条件及过程
2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物
3.掌握基因工程的基本操作程序
【学习目标】
目 录
聚合酶链式反应（PCR）技术
01
03
基因工程的基本操作程序
利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
02
01
聚合酶链式反应（PCR）技术
聚合酶链式反应（PCR）技术
1.含义：聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术
2.原理：DNA半保留复制
3.操作步骤：在向PCR管中加入一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等后，设置好反应程序，启动PCR仪，自动完成反应步骤
PCR仪
聚合酶链式反应（PCR）技术
4.反应步骤
(1) 变性：在约 94 ℃高温下，作为模板的双链 DNA 解旋（变性）为两条单链DNA
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
变性
双螺旋解开
聚合酶链式反应（PCR）技术
(2) 退火：反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对
5’
3’
3’
5’
复性
3’
5’
两种引物
3’
5’
聚合酶链式反应（PCR）技术
(3) 延伸：反应体系的温度回升到约72℃（Taq酶催化作用的最适反应温度），4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链
5’
3’
3’
5’
延伸
3’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
聚合酶链式反应（PCR）技术
完成上述第一次循环后，PCR 仪会按设定接着进行第二次、第三次......循环
第二次循环产物
第三次循环产物
聚合酶链式反应（PCR）技术
5.PCR技术的应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学领域，如：病原体鉴定、遗传病诊断 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用
02
利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
聚合酶链式反应（PCR）技术
1.实验目的
(1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段
(2)关注PCR技术的应用
(3)学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术
2.实验原理
(1)扩增DNA片段的过程包括变性、退火和延伸等步骤的多次循环
(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的2n 倍
聚合酶链式反应（PCR）技术
(3)PCR反应体系包括：DNA模板、反应缓冲液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、Taq酶等
(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的不同温度
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。
聚合酶链式反应（PCR）技术
（5）PCR和体内DNA复制的差异
PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3’端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 高温解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
聚合酶链式反应（PCR）技术
3.实验器材和试剂
(1)器材：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)、微量取液器、PCR管、枪头等
(2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等
PCR仪
微量离心管
聚合酶链式反应（PCR）技术
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
2.5mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 4ul
10umol/l 的引物I 2ul
10umol/l 的引物II 2ul
H2O 35ul
Taq酶 1U
模板DNA 1ul
（1）采用微量取液器，在0.2mLPCR管内配制50μL反应体系
① 94℃ 预变性 5min
② 94℃ 变性 1min
③ 55℃ 退火 1min
④ 72℃ 延伸 2min
⑤ 重复步骤②~④，30个循环 ⑥ 72℃延伸7~10min （2）按下述程序进行扩增
4.实验步骤
聚合酶链式反应（PCR）技术
进行此实验需要配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶液(1×TAE)、50μL PCR扩增产物和6μL凝胶加样缓冲液等试剂，操作时维持恒压80V1.5～2h
（3）电泳分析
电泳鉴定实验时，采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。
聚合酶链式反应（PCR）技术
（1）Marker（M）：标准样，一个已知分子质量的DNA样品作为对照，用来确定待测样品中DNA的相对分子质量。
(2)DNA荧光条带:
①条带的有无:代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。若无条带，常见原因有:无DNA模板，引物设计不合适
②条带的亮度:代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多
③条带的位置:常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑的越快，DNA的分子质量越小
产物鉴定
聚合酶链式反应（PCR）技术
1.在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
提示　可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2.试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
提示　变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
聚合酶链式反应（PCR）技术
3.复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
03
基因工程的基本操作程序
蓝色妖姬
转基因蓝玫瑰
蓝色妖姬并不是真正的蓝玫瑰，而是用白玫瑰或白月季染成蓝色的，真正的蓝玫瑰是一种转基因的玫瑰品种。
基因工程的基本操作程序
三色紫罗兰
白玫瑰
思考：真正的蓝玫瑰培育过程是怎样的呢？
转基因蓝玫瑰
导入
目的基因
受体细胞
蓝色素基因
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
（1）通过化学合成法直接合成目的基因
① 对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪直接人工合成
② 全基因或较大基因可以使用半合成的方法降低成本
DNA合成仪
基因工程的基本操作程序
（2）通过基因文库获取目的基因
① 基因组文库：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体
特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝，整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因
筛选方法：一般采用核酸探针杂交的方法
基因工程的基本操作程序
② cDNA文库：从组织细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库
特点：含有某种生物的部分基因
课堂小结
基因工程及其技术
聚合酶链式反应（PCR）技术
利用PCR技术扩增DNA片段
并完成电泳鉴定
基因工程的基本操作
过程：变性、退火、延伸
原理：DNA半保留复制
获取目的基因
电泳、结果鉴定与分析
PCR技术
随堂小测
1.下列有关基因工程基本操作程序的叙述，正确的是( )
A.目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA
B.基因组文库的基因含有某物种的部分基因
C.若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过化学方法合成
D.抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞
解析：A、DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的DNA单链，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞中，A错误；B、基因组文库的基因含有某物种的全部基因，cDNA文库的基因含有某物种的部分基因，B错误；C、若目的基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成，C正确；D、运载体上的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误。
C
2.如图是蛋白质工程中改造目的基因的一种技术路线。S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区；外切核酸酶III只能从DNA双链的3'末端逐个水解单核苷酸，可以产生不同长度的5'突出末端。下列叙述错误的是( )
A.步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段
B.步骤二、三分别使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段
D.质粒载体2中目的基因片段N的长度有多种
解析：步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段，可防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，A正确；外切核酸酶III只能从DNA双链的3'末端逐个水解单核苷酸，可以产生不同长度的5'突出末端，由图可知，步骤二应使用外切核酸酶III，步骤三应使用S1核酸酶，B错误；T4 DNA连接酶可连接平末端，故步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段，C正确；质粒载体2中目的基因片段N的长度有多种，因为外切核酸酶III处理后可以获得不同长度的5'突出末端，D正确。
B
3.荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针（一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段），当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A.该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量
B.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
C.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物
D.该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键
解析：A、利用荧光定量PCR技术可以进行DNA的含量测定，模板DNA越多，荧光信号越强，而新冠病毒的核酸为RNA，无法直接用该技术检测，A错误；B、荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分子，一共会生成1+2+4=7个荧光分子，B错误；C、1个双链DNA分子经过5轮循环一共会形成32个DNA分子，即形成64条链，其中62条链都是新合成的，一共需要消耗31对引物，C错误；D、子链延伸时DNA聚合酶可在子链的3'端不断添加脱氧核苷酸，从而形成磷酸二酯键，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶可以利用5'-3'外切酶活性水解DNA单链探针的一端，使其有关基团出现荧光，D正确。
D

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