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微专题2　PCR技术中引物的设计、选择与计算
题型1　PCR技术中引物的设计原则
例1 (2021·湖北卷，16改编)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高退火的温度
例2 (2024·精诚联盟高二联考)设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)。如下图所示，相关叙述错误的是(　　)
A.引物Ⅰ与引物Ⅱ因局部碱基互补配对而失效
B.引物Ⅰ′因自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
C.引物中G＋C的含量越高，变性时所需温度就越高
D.PCR过程中所使用的解旋酶和DNA聚合酶均应耐高温
题型2　PCR技术中引物的选择原则
例3 (2024·A9协作体联盟联考)利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①～④中选择扩增P基因的合适引物组合(　　)
A.①② B.①③
C.②③ D.②④
例4 (2024·东城区高二期末)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将来自杨树的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，进行PCR扩增时应选择的引物组合是(　　)
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
题型3　PCR中有关引物数量的计算规律
(假定PCR开始时只有1个模板DNA分子)
循环次数 1 2 3 … n
产物DNA分子数 2 4 8 … 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 … 2n
含有引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 … 2n－1
同时含有引物A和B的DNA分子数 0 2 6 … 2n－2
消耗引物数量 2 6 14 … 2n＋1－2
两条链等长的DNA分子数 0 0 2 … 2n－2n
例5 利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
从理论上推测，下列叙述错误的是(　　)
A.从第3轮循环开始，产物中才开始出现双链等长的DNA片段
B.第4轮循环产物中，含有引物A的DNA片段占比为15/16
C.第5轮循环产物中，同时含引物A和B的DNA片段占比为15/16
D.完成前6轮循环，共消耗引物数量为128个
例6 RT－PCR是将RNA逆转录(RT)成cDNA(与mRNA互补的DNA单链)和聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是(　　)
A.过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同
B.图中A、B两种引物的核苷酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同
C.图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D.过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
微专题2　PCR技术中引物的设计、选择与计算
例1　D　[PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的退火温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。]
例2　D　[PCR过程中不使用解旋酶，D错误。]
例3　A
例4　B
例5　D　[完成第6轮循环，共产生26个DNA分子片段，共含有27条单链，其中两条旧链不含引物，因此共需引物27－2＝126(个)，D错误。]
例6　D　[过程Ⅰ是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以mRNA为模板逆转录合成cDNA的过程，催化该过程的酶是逆转录酶，存在的碱基配对方式是U—A、A—T、C—G、G—C；过程Ⅱ是DNA单链复制过程，是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以DNA单链为模板合成DNA单链的过程，催化该过程的酶为TaqDNA聚合酶，该过程中存在的碱基配对方式是A—T、G—C、T—A、C—G，A、B、C错误；过程Ⅱ中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26＝64(条)，新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需要加入引物的数量为63个，D正确。](共13张PPT)
微专题2
PCR技术中引物的设计、选择与计算
题型1　PCR技术中引物的设计原则
例1 (2021·湖北卷，16改编)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高退火的温度
D
解析：PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；
延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；
延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；
在一定温度范围内，选择较高的退火温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
例2 (2024·精诚联盟高二联考)设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)。如下图所示，相关叙述错误的是(　　)
D
A.引物Ⅰ与引物Ⅱ因局部碱基互补配对而失效
B.引物Ⅰ′因自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
C.引物中G＋C的含量越高，变性时所需温度就越高
D.PCR过程中所使用的解旋酶和DNA聚合酶均应耐高温
解析：PCR过程中不使用解旋酶，D错误。
题型2　PCR技术中引物的选择原则
例3 (2024·A9协作体联盟联考)利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①～④中选择扩增P基因的合适引物组合(　　)
A
A.①② B.①③
C.②③ D.②④
例4 (2024·东城区高二期末)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将来自杨树的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，进行PCR扩增时应选择的引物组合是(　　)
B
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
题型3　PCR中有关引物数量的计算规律
(假定PCR开始时只有1个模板DNA分子)
循环次数 1 2 3 … n
产物DNA分子数 2 4 8 … 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 … 2n
含有引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 … 2n－1
同时含有引物A和B的DNA分子数 0 2 6 … 2n－2
消耗引物数量 2 6 14 … 2n＋1－2
两条链等长的DNA分子数 0 0 2 … 2n－2n
例5 利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
从理论上推测，下列叙述错误的是(　　)
A.从第3轮循环开始，产物中才开始出现
双链等长的DNA片段
B.第4轮循环产物中，含有引物A的DNA
片段占比为15/16
C.第5轮循环产物中，同时含引物A和B的DNA片段占比为15/16
D.完成前6轮循环，共消耗引物数量为128个
解析：完成第6轮循环，共产生26个DNA分子片段，共含有27条单链，其中两条旧链不含引物，因此共需引物27－2＝126(个)，D错误。
D
例6 RT－PCR是将RNA逆转录(RT)成cDNA(与mRNA互补的DNA单链)和聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是(　　)
D
A.过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同
B.图中A、B两种引物的核苷酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同
C.图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D.过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
解析：过程Ⅰ是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以mRNA为模板逆转录合成cDNA的过程，催化该过程的酶是逆转录酶，存在的碱基配对方式是U—A、A—T、C—G、G—C；过程Ⅱ是DNA单链复制过程，是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以DNA单链为模板合成DNA单链的过程，催化该过程的酶为TaqDNA聚合酶，该过程中存在的碱基配对方式是A—T、G—C、T—A、C—G，A、B、C错误；过程Ⅱ中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26＝64(条)，新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需要加入引物的数量为63个，D正确。
A.过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同
B.图中A、B两种引物的核苷酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同
C.图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D.过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个专题特训2 PCR技术中引物的设计、选择与计算
(时间：30分钟分值：36分)
选择题：第1～9题，每小题4分，共36分。
题型1　PCR技术中引物的设计原则
1.(2024·台州高二期末)数字PCR技术是一种核酸分子绝对定量技术，其原理如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
应根据目的基因的两端已知序列设计两种引物
PCR每一循环包括变性、退火和延伸三个过程
PCR结束后有靶分子的反应单位能检测出荧光
每个反应单位中都需要加入解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶
2.RTPCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某生物兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是(　　)
PCR过程主要涉及的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶
一般情况下，引物A和B的长度越长，则PCR循环步骤中的退火温度设定就越低
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA的分子大小有关
实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
题型2　PCR技术中引物的选择原则
3.(2024·环大罗山联盟)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
4.(2024·绿谷联盟)PCR技术应用广泛，研究者设计了与目的基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了一个碱基)，并按如图方式依次进行4次PCR扩增，从而实现对目的基因的定点诱变。图中所示的4次PCR都涉及引物的选择，以下有关PCR1、PCR2、PCR3、PCR4选择的引物的组合中错误的是(　　)
注：图中“”为碱基序列变化点。
选项 引物A 引物B 引物C 引物D
A PCR1 √ √ × ×
B PCR2 × × √ √
C PCR3 √ × √ ×
D PCR4 √ × × √
注：√表示选择，×表示不选择。
A B C D
5.为研究拟南芥植株E基因的功能，科研人员将TDNA插入E基因中，导致其发生突变，突变后的基因记为e。为验证某拟南芥植株的基因型，科研人员根据基因E和TDNA的序列，设计了三种引物，引物的结合位置如图所示。已知完整的E基因和TDNA整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的PCR扩增。科研人员提取该植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合及“Ⅱ＋Ⅲ”组合进行PCR，两种引物组合均能完成扩增。拟南芥植株的基因型为(　　)
Ee EE
ee EE或Ee
题型3　PCR中有关引物数量的计算规律
6.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则(　　)
需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
应向反应体系中加入解旋酶、Taq DNA聚合酶、缓冲液等
理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
7.为获得Gata3GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是(　　)
据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
分析图乙可知，4号小鼠为Gata3GFP融合基因纯合小鼠
图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为3/8
8.RTPCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的PCR相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。以下说法错误的是(　　)
设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列
GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的Taq DNA聚合酶和引物A等
过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n－1个引物B
9.荧光定量PCR技术可定量检测样本中的DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当子链延伸至探针处时会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，荧光监测系统随时接收荧光信号的变化，如图所示。下列说法错误的是(　　)
在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多
1个DNA分子经过3次循环会得到8个两条链等长的DNA分子
PCR所用引物1和引物2均是由脱氧核苷酸组成的
人工设计合成的引物1的碱基序列不能与引物2的互补配对
专题特训2　PCR技术中引物的设计、选择与计算
1．D　[由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增，A正确；PCR技术中的每个循环由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，B正确；荧光的出现是荧光探针水解导致的，荧光探针首先与模板DNA的相应区段结合(靶分子)，随着DNA复制延伸至荧光探针部位，导致荧光探针的水解进而产生荧光，显然每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子，C正确；PCR技术不需要解旋酶，每个反应单位中都需要加入耐高温的Taq DNA聚合酶，D错误。]
2．B　[PCR过程主要涉及的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶，A正确；一般情况下，引物A和B的长度越长，引物与模板DNA之间的非特异性结合的概率越大，因此需要更高的退火温度，B错误；实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正确。]
3．D　[在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的5′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮循环前都加入，D错误。]
4．C　[根据题意和图示分析，经过4次PCR技术后获得了新的基因，这是一种定点的基因突变技术。通过PCR扩增目的DNA片段时，Taq DNA聚合酶催化子链沿引物的3′端延伸，DNA新链合成的方向为5′→3′，即引物的方向为5′→3′，结合图示PCR1、PCR2的产物可知，PCR1使用的引物为A、B，PCR2使用的引物为C、D，第3次PCR时，两条单链可互为引物，故PCR3不需要使用引物，PCR4结束后得到的是完整的长段DNA，结合引物的方向为5′→3′，因此选用的是A、D两种引物。]
5．A　[根据题干“已知完整的基因E和T－DNA整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的PCR扩增”，且e的产生是T－DNA插入基因E中，因此当拟南芥的基因型为EE时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合可以获得PCR产物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，不能获得PCR产物；当拟南芥的基因型为Ee时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合和引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，都能获得PCR产物；当拟南芥的基因型为ee时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合不能获得PCR产物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，能获得PCR产物；即该拟南芥植株的基因型为Ee，A正确。]
6．D　[只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正确。]
7．C　[Gata3－GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小。用引物1和引物3进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物。选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，没有整合GFP基因时，则片段较小，因此，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2，A错误；2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3－GFP融合基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B错误；图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动Gata3和GFP基因的转录，进而可编码相应的蛋白质，C正确；若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，获得的DNA片段总数为24＝16(个)，其中等长片段的数目为24－2×4＝8(个)，可见其所占的比例为1/2，D错误。]
8．C　[引物是一段能与目的基因互补配对的脱氧核苷酸序列，设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列，A正确；G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键，所以GC含量越高的引物，退火温度越高，B正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，C错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA的半保留复制可知，理论上需要2n－1个引物B，D正确。]
9．B　[当子链延伸至探针处时会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，则检测到的荧光信号越强，说明合成的子链越多，消耗的引物就越多，A正确；1个DNA分子经过3次循环得到两条链等长的DNA分子数量为23－2×3＝2(个)，B错误；PCR所用引物1和引物2均是由脱氧核苷酸组成的单链，可以与模板DNA的两端碱基互补配对，C正确；人工设计合成的引物1的碱基序列不能与引物2的互补配对，否则可能引起两种引物之间的碱基互补配对，进而不能与模板DNA配对，则不能进行PCR，D正确。](共21张PPT)
专题特训2　
PCR技术中引物的设计、选择与计算
(时间：30分钟　满分：36分)
D
题型1　PCR技术中引物的设计原则
1.(2024·台州高二期末)数字PCR技术是一种核酸分子绝对定量技术，其原理如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A.应根据目的基因的两端已知序列设计两种引物
B.PCR每一循环包括变性、退火和延伸三个过程
C.PCR结束后有靶分子的反应单位能检测出荧光
D.每个反应单位中都需要加入解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶
解析：由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增，A正确；
PCR技术中的每个循环由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，B正确；
荧光的出现是荧光探针水解导致的，荧光探针首先与模板DNA的相应区段结合(靶分子)，随着DNA复制延伸至荧光探针部位，导致荧光探针的水解进而产生荧光，显然每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子，C正确；
PCR技术不需要解旋酶，每个反应单位中都需要加入耐高温的Taq DNA聚合酶，D错误。
A.应根据目的基因的两端已知序列设计两种引物
B.PCR每一循环包括变性、退火和延伸三个过程
C.PCR结束后有靶分子的反应单位能检测出荧光
D.每个反应单位中都需要加入解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶
2.RT－PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某生物兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是(　　)
B
A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶
B.一般情况下，引物A和B的长度越长，则PCR循环步骤中的退火温度设定就越低
C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA的分子大小有关
D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
解析：PCR过程主要涉及的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶，A正确；
一般情况下，引物A和B的长度越长，引物与模板DNA之间的非特异性结合的概率越大，因此需要更高的退火温度，B错误；
实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正确。
A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶
B.一般情况下，引物A和B的长度越长，则PCR循环步骤中的退火温度设定就越低
C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA的分子大小有关
D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
题型2　PCR技术中引物的选择原则
3.(2024·环大罗山联盟)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
D
A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所
选限制酶的识别序列
B.环化阶段，可选用E.coli DNA连
接酶或T4 DNA连接酶
C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D.PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
解析：在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；
T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；
PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的5′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；
PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮循环前都加入，D错误。
A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B.环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D.PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
4.(2024·绿谷联盟)PCR技术应用广泛，研究者设计了与目的基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了一个碱基)，并按如图方式依次进行4次PCR扩增，从而实现对目的基因的定点诱变。图中所示的4次PCR都涉及引物的选择，以下有关PCR1、PCR2、PCR3、PCR4选择的引物的组合中错误的是(　　)
C
注：图中“ ”为碱基序列变化点。
注：√表示选择，×表示不选择。
选项 引物A 引物B 引物C 引物D
A PCR1 √ √ × ×
B PCR2 × × √ √
C PCR3 √ × √ ×
D PCR4 √ × × √
解析：根据题意和图示分析，经过4次PCR技术后获得了新的基因，这是一种定点的基因突变技术。通过PCR扩增目的DNA片段时，Taq DNA聚合酶催化子链沿引物的3′端延伸，DNA新链合成的方向为5′→3′，即引物的方向为5′→3′，结合图示PCR1、PCR2的产物可知，PCR1使用的引物为A、B，PCR2使用的引物为C、D，第3次PCR时，两条单链可互为引物，故PCR3不需要使用引物，PCR4结束后得到的是完整的长段DNA，结合引物的方向为5′→3′，因此选用的是A、D两种引物。
5.为研究拟南芥植株E基因的功能，科研人员将T－DNA插入E基因中，导致其发生突变，突变后的基因记为e。为验证某拟南芥植株的基因型，科研人员根据基因E和T－DNA的序列，设计了三种引物，引物的结合位置如图所示。已知完整的E基因和T－DNA整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的PCR扩增。科研人员提取该植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合及“Ⅱ＋Ⅲ”组合进行PCR，两种引物组合均能完成扩增。拟南芥植株的基因型为(　　)
A
A.Ee B.EE
C.ee D.EE或Ee
解析：根据题干“已知完整的基因E和T－DNA整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的PCR扩增”，且e的产生是T－DNA插入基因E中，因此当拟南芥的基因型为EE时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合可以获得PCR产物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，不能获得PCR产物；当拟南芥的基因型为Ee时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合和引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，都能获得PCR产物；当拟南芥的基因型为ee时，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合不能获得PCR产物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合时，能获得PCR产物；即该拟南芥植株的基因型为Ee，A正确。
A.Ee B.EE
C.ee D.EE或Ee
题型3　PCR中有关引物数量的计算规律
6.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则(　　)
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、Taq DNA聚合酶、缓冲液等
D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
D
解析：只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；
扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B错误；
不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；
理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正确。
7.为获得Gata3－GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是(　　)
C
A.据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B.分析图乙可知，4号小鼠为Gata3－GFP融合基因纯合小鼠
C.图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D.若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为3/8
解析：Gata3－GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小。用引物1和引物3进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物。选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，没有整合GFP基因时，则片段较小，因此，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2，A错误；
2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3－GFP融合基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B错误；
图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动Gata3和GFP基因的转录，进而可编码相应的蛋白质，C正确；
若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，获得的DNA片段总数为24＝16(个)，其中等长片段的数目为24－2×4＝8(个)，可见其所占的比例为1/2，D错误。
A.据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B.分析图乙可知，4号小鼠为Gata3－GFP融合基因纯合小鼠
C.图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D.若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为3/8
8.RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的PCR相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。以下说法错误的是(　　)
C
A.设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列
B.GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的Taq DNA聚合酶和引物A等
D.过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n－1个引物B
解析：引物是一段能与目的基因互补配对的脱氧核苷酸序列，设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列，A正确；
G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键，所以GC含量越高的引物，退火温度越高，B正确；
过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，C错误；
过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA的半保留复制可知，理论上需要2n－1个引物B，D正确。
A.设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列
B.GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度
C.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的Taq DNA聚合酶和引物A等
D.过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n－1个引物B
9.荧光定量PCR技术可定量检测样本中的DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当子链延伸至探针处时会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，荧光监测系统随时接收荧光信号的变化，如图所示。下列说法错误的是(　　)
B
A.在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多
B.1个DNA分子经过3次循环会得到8个两条链等长的DNA分子
C.PCR所用引物1和引物2均是由脱氧核苷酸组成的
D.人工设计合成的引物1的碱基序列不能与引物2的互补配对
解析：当子链延伸至探针处时会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，则检测到的荧光信号越强，说明合成的子链越多，消耗的引物就越多，A正确；
1个DNA分子经过3次循环得到两条链等长的DNA分子数量为23－2×3＝2(个)，B错误；
PCR所用引物1和引物2均是由脱氧核苷酸组成的单链，可以与模板DNA的两端碱基互补配对，C正确；
人工设计合成的引物1的碱基序列不能与引物2的互补配对，否则可能引起两种引物之间的碱基互补配对，进而不能与模板DNA配对，则不能进行PCR，D正确。
A.在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多
B.1个DNA分子经过3次循环会得到8个两条链等长的DNA分子
C.PCR所用引物1和引物2均是由脱氧核苷酸组成的
D.人工设计合成的引物1的碱基序列不能与引物2的互补配对

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