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(共23张PPT)
微生物的选择培养与计数
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
（一）选择培养基
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
举例
2.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（一）选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的
培养基，叫做选择培养基。
不加有机碳源
不加氮源
3.选择培养基举例
自养微生物
酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
固氮微生物
加入青霉素
加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
（一）选择培养基
能消除石油污染的微生物
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
见P18页培养基配方
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，
判断依据是_________________________________；
该类培养基的主要用途为_____________________；
2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，
目的是为了获得_____________________；
3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；
培养基一的碳源为________，氮源为________；
培养基二的碳源为________，氮源为________。
培养基一 牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二 KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体
添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2%
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
讨论：
稀释涂布平板法
1.原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
（二）微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
2.样品梯度稀释：
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
灼
⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。
涂
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
3.取样涂布平板：
滴
③取0.1ml菌液（不超过 ），滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
浸
放入37℃恒温箱中培养1～2d
4.培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
（三）微生物的数量测定
稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
1)原理：
2)计数原则：
一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
1.稀释涂布平板法：
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。（重复实验，减少误差）。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。
⑤分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
实例分析：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
3)计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
2.显微镜直接计数：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）
探究-实践
(四）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素的立体结构
提出问题
1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
土壤取样
制备培养基
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
基础知识
1.土壤取样
1）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的 潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3 8cm的土壤层。
2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2.制备培养基
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
3.样品的稀释
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
4.微生物的培养与观察
30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
实验设计
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
4.微生物的培养与观察
操作提示
2）无菌操作
3）做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
4）制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的_________,稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
连续划线
梯度稀释
主要步骤 _________操作
接种工具 _______
平板示 意图
平板划线
涂布器
(五）两种接种方法的比较
梯度稀释和涂布平板操作
接种环
课题小结
叮当！下课啦！

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