资源简介 第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序[课标内容] 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。微考点大突破考点一 重组DNA技术的基本工具 1.基因工程的概念(1)手段:基因工程是指按照人们的愿望,通过__________等技术,赋予生物新的遗传特性。(2)目的:创造出更符合人们需要的新的生物类型和__________。(3)水平:DNA分子水平。(4)基础:生物化学、分子生物学和微生物学等学科。(5)意义:克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造生物的__________。提醒 基因工程的理论基础2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”。提醒 ①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶——“分子缝合针”。(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”。(1)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。(源自选择性必修3 P70)()(2)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(源自选择性必修3 P71)()(3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端,在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。(源自选择性必修3 P71)()(4)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键,形成重组DNA。(源自选择性必修3 P72)()(5)载体质粒通常以抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(源自选择性必修3 P72)()将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中,需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请回答下列问题:(1)请用图示法写出限制酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶 请说明理由。答:__________________________________________________________________。限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则:如图中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则,如图所示。(3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。(4)巧用“同尾酶”:“同尾酶”指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其“同尾酶”替换,以获得相同的黏性末端。(5)根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。能力 辨析基因工程的基本工具(考查科学思维)1.(2025·连云港模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是( )项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况① 能生长 不能生长② 能生长 能生长③ 不能生长 能生长A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是bC.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶2.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题:(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中______________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是______________________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能__________;质粒DNA分子上有__________,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是____________________________________________。(4)表达载体含有启动子,启动子是指____________________________________________。与DNA有关的几种酶的比较考点二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因。①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变__________或获得__________等的基因,主要是指______________的基因。②筛选目的基因的方法。a.从已知______________清晰的基因中进行筛选。b.利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。(2)利用PCR获取和扩增目的基因。①原理:__________。②条件:基本条件。参与的组分 在DNA复制中的作用解旋酶 (体外用__________代替) 打开DNA双链DNA母链 提供DNA复制的模板__________ 合成DNA子链的原料__________ 催化合成DNA子链引物 使DNA聚合酶能够从引物的__________端开始连接脱氧核苷酸③过程。④结果:每次循环后目的基因的量增加一倍,即成__________形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。⑤PCR产物的鉴定:常采用__________来鉴定。提醒 ①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的。①使目的基因在__________中稳定存在,并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用。(3)基因表达载体的构建过程。提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目 本质 位置 功能启动子 DNA片段 目的基 因上游 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA终止子 DNA片段 目的基 因下游 使转录在所需要的地方停下来起始 密码子 mRNA上三个 相邻的碱基 mRNA 首端 翻译的起始信号(编码氨基酸)终止 密码子 mRNA上三个 相邻的碱基 mRNA 尾端 翻译的结束信号(不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞受体 细胞 导入 方法 内容植物 细胞 花粉管 通道法 用微量注射器将含__________的DNA溶液直接注入______中等农杆菌 转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的__________可携带目的基因整合到受体细胞的__________DNA上动物 细胞 _______________技术 常用受体细胞:__________原核 细胞 Ca2+处 理法 用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态提醒 ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌。第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T DNA导入受体细胞。②导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的检测与鉴定(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(选择性必修3 P77“相关信息”)()(2)PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列,该技术既可以扩增DNA又可以直接扩增mRNA。(选择性必修3 P79“旁栏思考”)()(3)构建基因表达载体是转基因工程的核心工作,唯一不需要进行碱基互补配对的过程是将目的基因导入受体细胞。(源自选择性必修3 P80)()(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,它是RNA聚合酶识别和结合的部分,有了它才能驱动DNA的复制过程。(源自选择性必修3 P80)()(5)可以将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中,就可获得具有理想性状的转基因植物。(选择性必修3 P80“旁栏思考”)()(6)转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(选择性必修3 P81“资料卡”)()(7)应用PCR技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否存在及其是否表达。(源自选择性必修3 P82)()Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因,筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题:(1)什么是引物 DNA复制时为什么需要引物 答:____________________________________________。(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗 答:____________________________________________。(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录,科研人员提取棉花细胞中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA,原因是什么 答:____________________________________________。(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示,若一个Bt抗虫蛋白基因在PCR中经过n轮循环,理论上得到多少个DNA分子 含引物的DNA分子多少个 含引物A(或B)的DNA分子多少个 同时含两种引物的DNA分子多少个 共需要消耗多少个引物 含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个 含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个 答:________________________________________________________________________________________。1.体内DNA复制与PCR技术的比较PCR技术 体内DNA复制原则 碱基互补配对条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料延伸方向 新链都是从5'端向3'端延伸解旋方式 90℃以上高温解旋 解旋酶催化场所 PCR扩增仪 主要在细胞核延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶温度 控制温度,需要在不同温度下进行 细胞内温和条件过程结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA2.引物设计应注意的问题(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点。(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):每种引物内部不能发生局部碱基互补配对;两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因:防止引物自身折叠。②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。(5)两种引物都结合在DNA模板链的3'端;脱氧核苷酸连接在引物的3'端进行延伸。3.农杆菌转化法分析(1)构建基因表达载体需要两种工具酶:限制酶和DNA连接酶。(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,有利于重组质粒的导入。(3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。4.如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入了四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种:含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。(3)筛选方法:将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。能力一 PCR的过程和应用分析(考查科学思维)1.(2024·黑吉辽卷,T7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是( )A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来2.(2024·浙江1月选考,T22)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜,具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能,在克隆M、N基因基础上,转化锌吸收缺陷型酵母,进行细胞学鉴定。回答下列问题:(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物__________为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增,PCR每个循环第一步是进行热变性处理,该处理的效果类似于生物体内__________的作用效果。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子因为含__________而带负电荷,凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口;当2个PCR产物相对分子质量接近时,若延长电泳时间,凝胶中这2个条带之间的距离会__________。回收DNA片段,连接至克隆载体,转化大肠杆菌,测序验证。(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,然后利用______________连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______________________。(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,直接在固体培养基进行__________培养,活化后接种至液体培养基,采用__________以扩大菌体数量,用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平,无显著差异。(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6,将菌液用______________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6,然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上,培养2天,菌落生长情况如图。该实验中阴性对照为__________。由实验结果可初步推测:转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是__________,依据是________________________________________。[注] OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高;空载体为未插入M、N基因的表达载体。能力二 基因工程的基本操作程序分析(考查科学思维、科学探究)3.(2023·全国乙卷,T38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题:(1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为__________;②为__________,其作用是____________________________________________。(2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是____________________________________________(答出1点即可)。(3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是__________________________________________________________________。4.(2024·湖南卷,T21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:图a图b图c(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用__________去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用__________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。(2)单倍体育种。常用__________的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是____________________________________________。(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用__________酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中__________的诱导作用最强。②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:____________________________________________。考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理。(2)方法步骤(以洋葱为例)。提醒 加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。2.DNA片段的扩增(1)原理:DNA的__________原理。(2)PCR实验的操作步骤。提醒 ①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。3.DNA片段的电泳鉴定(1)原理。①电泳的原理:DNA分子具有______________,在一定的pH下,这些基团可以带上__________。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷__________的电极移动。②鉴定的原理:PCR的产物一般通过__________来鉴定,在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关;凝胶中的DNA分子通过__________,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。(2)过程。(3)结果分析与评价。①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________________________。②进行电泳鉴定的结果应该是__________条条带。如图所示,该片段大小约为__________bp。提醒 电泳时,DNA的相对分子质量越大,迁移速率越慢;DNA的相对分子质量越小,迁移速率越快。能力一 DNA的粗提取与鉴定(考查科学探究)1.(2023·广东卷,T11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色2.(2024·山东卷,T13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰能力二 DNA片段的扩增及电泳鉴定(考查科学探究)3.(2023·福建卷,T4)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是 ( )A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNAD.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA4.(2023·浙江6月选考,T19)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3 GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。甲乙下列叙述正确的是( )A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3 GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子微真题重体悟 1.(2024·湖南卷,T5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )A.限制酶失活,更换新的限制酶B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶2.(2024·江西卷,T12)γ 氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脱羧是高效生产γ 氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L 谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA,构建了以L 谷氨酸钠为底物高效生产γ 氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( )A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB.E.coliB发酵生产γ 氨基丁酸时,L 谷氨酸钠的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ 氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒3.(2024·山东卷,T5)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( )反应管 加入的单链DNA① 5'—G C C G A T C T T T A T A—3' 3'—G A C C G G C T A G A A A—5'② 5'—A G A G C C A A T T G G C—3'③ 5'—A T T T C C C G A T C C G—3' 3'—A G G G C T A G G C A T A—5'④ 5'—T T C A C T G G C C A G T—3'A.①② B.②③C.①④ D.③④4.(2024·贵州卷,T21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)野生型 + + +野生型 - - -突变体 + - -转基因菌株 + + +回答下列问题:(1)据表可推测__________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是__________。检测NV酶活性时,需测定的指标是________________________________________(答出1点即可)。(2)表中突变体由T DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与__________(填“T DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度__________(填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是__________________________________________________________________。(3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入__________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是____________________________________________。5.(2024·广东卷,T21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。图1回答下列问题:(1)研究者优化了培养基的______________(答出两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2,载体的部分结构见图3)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为__________,理由是____________________________________________。图2注:基因1编码酪氨酸酶,基因2编码T7RNAP N端-nMag,基因3编码pMag-T7RNAP C端。图3(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为____________________________________________(答出两点)。(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是____________________________________________。(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路:____________________________________________。第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序微考点·大突破考点一教材解读1.(1)转基因 (2)生物产品 (5)遗传性状2.(1)原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 磷酸二酯键(2)限制酶 (3)环状 噬菌体 一个至多个 自我复制 受体DNA 标记教材基础辨析 (1)× (2)× (3)√ (4)× (5)×教材素材拓展 提示 (1)限制酶Nhe Ⅰ:限制酶EcoR Ⅰ:(2)用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒,应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因能力提升1.C 解析 质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A项错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B项错误;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D项错误。2.答案 (1)EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段解析 (1)T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,题图中四种限制酶切割后的DNA片段都可以用T4 DNA连接酶进行连接。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。考点二教材解读1.(1)①受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 ②a.结构和功能 (2)①DNA半保留复制 ②高温 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 3' ③两种引物 耐高温的DNA聚合酶 ④指数 ⑤琼脂糖凝胶电泳2.(1)①受体细胞 (2)启动子 标记基因3.目的基因 子房 T DNA 染色体 显微注射 受精卵4.目的基因 杂交带教材基础辨析 (1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)× (6)√ (7)×教材素材拓展提示 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链,因此复制DNA时应加入两种引物(2)不需要,只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)(3)引物是依据Bt抗虫蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)(4)经过n轮循环,得到2n个DNA分子,含引物的DNA分子2n个,含引物A(或B)的DNA分子数(2n-1)个,同时含两种引物的DNA分子(2n-2)个,共需要消耗(2n+1-2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个,含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n-2n)个能力提升1.A 解析 琼脂糖凝胶浓度太高会影响DNA片段的迁移,浓度太低则会导致分辨率降低,因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小,A项正确;凝胶载样缓冲液中的指示剂可避免DNA分子迁移出凝胶,起到指示电泳进程的作用,不能指示DNA分子的具体位置,B项错误;DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在同一电场作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长移动速率越慢,C项错误;凝胶中的DNA分子通过染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。2.答案 (1)根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2)DNA连接酶 热变性使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出 (3)划线 振荡培养 (4)梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多解析 (1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达,说明锌转运蛋白基因在该种植物根部细胞可转录出mRNA,再以mRNA为模板翻译出锌转运蛋白,所以进行锌转运蛋白基因M、N克隆时,可以该植物根为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。PCR中热变性处理时温度超过了90 ℃,双链DNA解旋为2条单链,该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基团,故带负电荷。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小等有关,当2个PCR产物相对分子质量接近时,电泳时间过短会导致2个PCR产物分离不完全,而延长电泳时间可使2个PCR产物即凝胶中相应2个条带之间的距离变长。(2)构建重组表达载体时,先分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,以得到相同的黏性末端或平末端,再利用DNA连接酶连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证重组转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是若转化成功,则大肠杆菌的DNA中含有M、N基因,热变性会使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出。(3)菌株一般低温保存于固体培养基上,故取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,可直接在固体培养基上进行划线培养。有氧条件下,酵母菌可以大量繁殖,故活化后接种至液体培养基,可采用振荡培养以扩大菌体数量。(4)可采用梯度稀释法对菌液逐级稀释。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载体,其不含M、N基因。由“OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高”及题图中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6),锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组酵母菌数量明显多于锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体组,可知,转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是N。3.答案 (1)终止子 启动子 被RNA聚合酶识别并结合,驱动GFP突变基因的转录(2)密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同(3)选择合适的运载体,利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和运载体连接起来,构建基因表达载体,之后将基因表达载体导入酵母菌,检测酵母菌是否会发黄色荧光解析 (1)一个基因表达载体的组成,除了目的基因,还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停下来,位于基因的下游,也是一段有特殊序列结构的DNA片段。(2)结合题中信息可知,将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现有的大肠杆菌发绿色荧光,即GFP蛋白的荧光颜色,推测发绿色荧光的可能原因是密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。(3)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌,之后检测酵母菌是否发黄色荧光,如果发黄色荧光,则可证明YFP基因能在真核细胞中表达,否则,不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。4.答案 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2)花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3)①HindⅢ和BamHⅠ 交链格孢 ②利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL解析 (1)植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。原生质体融合后形成杂种细胞,给予适宜的条件培养杂种细胞,并添加生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养;鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目为百合植株根尖有丝分裂中期的一半,则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点,若要获得pL并将其连接到质粒上,可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切,以替换Ti质粒中的启动子,从而达到根据GUS酶活性反映病原微生物对启动子pL活性的影响的目的。根据题图c的结果可知,交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高,可确定其诱导作用最强。②欲提高百合B中L基因的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。考点三实验基础1.(1)不溶于 2 mol/L 二苯胺 (2)研磨 上清液 95% 一个方向 2 mol/L 二苯胺 5 min 蓝色2.(1)热变性 (2)微量移液器 离心管 底部 PCR仪3.(1)①可解离的基团 正电荷或负电荷 相反 ②琼脂糖凝胶电泳大小和构象 染色 (2)电泳 凝胶载样 紫外灯 (3)①可以在波长为300 nm的紫外灯下直接观察到DNA条带 ②一 750能力提升1.D 解析 裂解的目的是使细胞破裂释放出DNA等物质,A项正确;DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质等,DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除,B项正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质,可反复多次以提高DNA的纯度,C项正确;将DNA溶于NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,沸水浴五分钟,待冷却后,溶液能呈现蓝色,D项错误。2.A 解析 DNA的提取过程中可以不使用离心机,可将过滤好的研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,直接取上清液放入烧杯中,A项正确,B项错误;鉴定过程需要沸水浴加热,DNA分子在高温下会解螺旋,双螺旋结构会发生改变,C项错误;加热是唯一变量,设置一个加二苯胺不加DNA的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D项错误。3.C 解析 为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,但移液器不需要,A项错误;在将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时,应先加样,然后接通电源,B项错误;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,因此取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后,析出的白色丝状物即粗提取的DNA,C项正确;鉴定DNA时,需要把白色丝状物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴,D项错误。4.B 解析 由题图甲可知,Gata3基因与GFP基因共用一个启动子,且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质,A项错误;由于启动子在左侧,基因在右侧,转录基因时,先转录Gata3基因,再转录GFP基因,且翻译的方向是沿mRNA的5'→3',因此翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白,B项正确;由题图乙可知,大片段包含GFP基因编码区片段,小片段不包含GFP基因编码区片段,则2号小鼠是Gata3 GFP基因纯合子,4号小鼠是野生型,C项错误;若用引物1和引物3进行PCR,杂合子和Gata3 GFP基因纯合子均能扩增出条带,仅有Gata3基因时无法扩增出条带,不利于区分杂合子和纯合子,D项错误。微真题·重体悟1.B 解析 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B项错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,因此应更换为正常质粒DNA,C项正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。2.A 解析 分析题图可知,可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB,A项正确;由题意知,L 谷氨酸钠是生产γ 氨基丁酸的底物,不能用来供能,B项错误;将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ 氨基丁酸的菌株E.coliB,E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ 氨基丁酸,C项错误;选择限制酶时需考虑多种条件,如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等,同时在设计特异性引物时,还需要在其5'端设计限制酶酶切位点,以便构建重组质粒,根据题干提供的信息,无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ,D项错误。3.D 解析 反应管②和④虽然只有一种单链,但是单链含回文序列,可以同种单链之间发生互补,四个反应管中单链DNA互补配对情况如图所示:由图分析可知,D项正确。4.答案 (1)蔗糖 催化蔗糖转化成葡萄糖 单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少量) (2)NV基因 > 与野生型相比,突变体是由T DNA插入NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添而引起的,因此突变体相应基因的序列更长 (3)突变体 突变体的T DNA上会存在相应的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测解析 (1)据题表中野生型菌株的两组结果对比分析可知,如果培养液中添加了蔗糖,NV基因就会表达形成NV酶,否则没有NV酶的形成,由此推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析题表可知,当蔗糖和NV酶同时存在时,培养液中就会出现葡萄糖,由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。酶的活性可以用单位时间单位体积反应物的减少量或生成物的增加量表示,因此NV酶的活性可以用单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少量)表示。(2)根据题意,突变体是由T DNA随机插入野生型菌株,使NV基因发生了突变产生的,说明T DNA插入了NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添,即突变体中NV基因突变后的序列比野生型的NV基因序列更长,所以用与NV基因配对的引物进行扩增,扩增的结果是突变体扩增片段的长度更长。(3)为了进一步验证NV基因的功能,在突变体(NV基因突变)细胞中,转入NV基因,以便将转基因植株与突变体(NV基因突变)的结果进行对比。由于突变体的T DNA上会存在原有的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测,因此在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因。5.答案 (1)碳源、氮源 (2)PT7、PBAD、PBAD 基因2、3可正常表达出无活性产物,蓝光照射时再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表达 (3)选择含有重组质粒的驹形杆菌,杀死其他杂菌避免污染 (4)蓝光照射诱导nMag和pMag结合,激活T7RNAP,从而与特异型启动子PT7结合,酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素 (5)将酪氨酸酶基因换成合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素解析 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等,研究者培养工程菌,需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件。(2)依据题图2及题干信息可知,为实现蓝光控制染色,应该先合成无活性的T7RNAP,故基因2、3的上游应连接通用型启动子。在蓝光诱导下合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素,实现蓝光控制染色。此过程中酪氨酸酶需要特异性合成,因此基因1上游应连接仅被T7RNAP识别的PT7启动子。(3)将携带大观霉素抗性基因的光控表达载体导入驹形杆菌,会获得未成功导入的菌株和成功导入的工程菌株,长时间培养时也可能感染其他杂菌,在培养液中加入大观霉素(抗生素)可以筛选出工程菌株,同时也能抑制其他杂菌的生长,提高工程菌的生产效率。(4)详见答案。(5)为获得不同颜色图案的BC膜,可以利用题述光控基因表达载体,将酪氨酸酶基因换成控制合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素。(共131张PPT)第42讲第九单元 生物技术与工程基因工程的基本工具和基本操作程序课标内容1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。微考点 大突破内容索引微真题 重体悟考点一 重组DNA技术的基本工具考点二 基因工程的基本操作程序考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定考点一 重组DNA技术的基本工具微考点/大突破第一部分1.基因工程的概念(1)手段：基因工程是指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和_________。(3)水平：DNA分子水平。(4)基础：生物化学、分子生物学和微生物学等学科。(5)意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的_________。转基因生物产品遗传性状提醒 基因工程的理论基础2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”。原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键提醒 ①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶——“分子缝合针”。限制酶(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”。环状噬菌体一个至多个自我复制受体DNA标记教材基础辨析(1)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。(源自选择性必修3 P70)( )(2)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(源自选择性必修3 P71)( )(3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。(源自选择性必修3 P71)( )××√(4)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(源自选择性必修3 P72)( )(5)载体质粒通常以抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(源自选择性必修3 P72)( )××教材素材拓展将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请回答下列问题：(1)请用图示法写出限制酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。限制酶Nhe Ⅰ： 限制酶EcoR Ⅰ：(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶 请说明理由。答：_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒，应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则：如图中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则，如图所示。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。(4)巧用“同尾酶”：“同尾酶”指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其“同尾酶”替换，以获得相同的黏性末端。(5)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。能力 辨析基因工程的基本工具(考查科学思维)1.(2025·连云港模拟)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入 (插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是( )项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况① 能生长 不能生长② 能生长 能生长③ 不能生长 能生长A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A项错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B项错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D项错误。解析2.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中__________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是______________。EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ磷酸二酯键(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能____________；质粒DNA分子上有__________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________________________________________________________________________________。自我复制限制酶切割位点将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中，能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞(4)表达载体含有启动子，启动子是指_________________________________________________。RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段(1)T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，题图中四种限制酶切割后的DNA片段都可以用T4 DNA连接酶进行连接。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键，将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体，质粒DNA分子上必须有复制原点，才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制；且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因，可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞，以达到筛选目的。 (4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。解析与DNA有关的几种酶的比较考点二 基因工程的基本操作程序微考点/大突破第一部分1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因。①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变_____________或获得______________等的基因，主要是指____________的基因。②筛选目的基因的方法。a.从已知____________清晰的基因中进行筛选。b.利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。受体细胞性状预期表达产物编码蛋白质结构和功能(2)利用PCR获取和扩增目的基因。①原理：_________________。②条件：基本条件。参与的组分 在DNA复制中的作用解旋酶 (体外用______代替) 打开DNA双链DNA母链 提供DNA复制的模板DNA半保留复制高温______________ 合成DNA子链的原料____________________ 催化合成DNA子链引物 使DNA聚合酶能够从引物的______端开始连接脱氧核苷酸4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶3'③过程。两种引物④结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成________形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。⑤PCR产物的鉴定：常采用_________________来鉴定。耐高温的DNA聚合酶指数琼脂糖凝胶电泳提醒 ①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的。①使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。受体细胞(2)基因表达载体的组成及作用。启动子标记基因(3)基因表达载体的构建过程。项目 本质 位置 功能启动子 DNA片段 目的基 因上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止子 DNA片段 目的基 因下游 使转录在所需要的地方停下来起始 密码子 mRNA上三个 相邻的碱基 mRNA 首端 翻译的起始信号(编码氨基酸)终止 密码子 mRNA上三个 相邻的碱基 mRNA 尾端 翻译的结束信号(不编码氨基酸)提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比3.将目的基因导入受体细胞受体细胞 导入方法 内容植物 细胞 花粉管 通道法 用微量注射器将含_________的DNA溶液直接注入______中等农杆菌 转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的________可携带目的基因整合到受体细胞的________DNA上目的基因子房T-DNA染色体动物 细胞 ____________技术 常用受体细胞：________原核 细胞 Ca2+处 理法 用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态显微注射受精卵提醒 ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌。第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。4.目的基因的检测与鉴定目的基因杂交带教材基础辨析(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(选择性必修3 P77“相关信息”)( )(2)PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，该技术既可以扩增DNA又可以直接扩增mRNA。(选择性必修3 P79“旁栏思考”) ( )(3)构建基因表达载体是转基因工程的核心工作，唯一不需要进行碱基互补配对的过程是将目的基因导入受体细胞。(源自选择性必修3 P80)( )√×√(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部分，有了它才能驱动DNA的复制过程。(源自选择性必修3 P80)( )(5)可以将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞 中，就可获得具有理想性状的转基因植物。(选择性必修3 P80“旁栏思考”)( )(6)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(选择性必修3 P81“资料卡”)( )(7)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否存在及其是否表达。(源自选择性必修3 P82)( )××√×教材素材拓展Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题：(1)什么是引物 DNA复制时为什么需要引物 答：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗 答：________________________________________________________________________________。(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么 答：_______________________________________________________________________________________。不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)引物是依据Bt抗虫蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt抗虫蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子 含引物的DNA分子多少个 含引物A(或B)的DNA分子多少个 同时含两种引物的DNA分子多少个 共需要消耗多少个引物 含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个 含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个 答：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含引物A(或B)的DNA分子数(2n-1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n-2)个，共需要消耗(2n+1-2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n-2n)个1.体内DNA复制与PCR技术的比较 PCR技术 体内DNA复制相同点 原则 碱基互补配对条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料延伸方向 新链都是从5'端向3'端延伸不同点 解旋方式 90℃以上高温解旋 解旋酶催化场所 PCR扩增仪 主要在细胞核延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶温度 控制温度，需要在不同温度下进行 细胞内温和条件不同点 过程 结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA2.引物设计应注意的问题(1)设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。(2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点。(3)使用的一对引物的序列不相同，因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。(4)引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。(5)两种引物都结合在DNA模板链的3'端；脱氧核苷酸连接在引物的3'端进行延伸。3.农杆菌转化法分析(1)构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒的导入。(3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。4.如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌 落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。能力一 PCR的过程和应用分析(考查科学思维)1.(2024·黑吉辽卷，T7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( )A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来琼脂糖凝胶浓度太高会影响DNA片段的迁移，浓度太低则会导致分辨率降低，因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A项正确；凝胶载样缓冲液中的指示剂可避免DNA分子迁移出凝胶，起到指示电泳进程的作用，不能指示DNA分子的具体位置，B项错误；DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在同一电场作用下，DNA片段不一定向负极迁移，一般情况下，DNA片段越长移动速率越慢，C项错误；凝胶中的DNA分子通过染色后，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D项错误。解析2.(2024·浙江1月选考，T22)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆 M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。回答下列问题：(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物________为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内________的作用效果。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含__________而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物相对分子质量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会________。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。根解旋酶磷酸基团变长(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用____________连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌，用PCR快速验证转化是否成功，此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是__________________________________________。(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行________培养，活化后接种至液体培养基，采用__________以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。DNA连接酶热变性使大肠杆菌细胞破裂，DNA流出划线振荡培养(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6，将菌液用____________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6，然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长情况如图。该实验中阴性对照为_________________________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是________，依据是________________________________。梯度稀释锌吸收缺陷型酵母+空载体N转入N基因的这组酵母菌数量多[注] OD600为波长600 nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M、N基因的表达载体。(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达，说明锌转运蛋白基因在该种植物根部细胞可转录出mRNA，再以mRNA为模板翻译出锌转运蛋白，所以进行锌转运蛋白基因M、N克隆时，可以该植物根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。PCR中热变性处理时温度超过了90 ℃，双链DNA解旋为2条单链，该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基团，故带负电荷。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小等解析有关，当2个PCR产物相对分子质量接近时，电泳时间过短会导致2个PCR产物分离不完全，而延长电泳时间可使2个PCR产物即凝胶中相应2个条带之间的距离变长。(2)构建重组表达载体时，先分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，以得到相同的黏性末端或平末端，再利用DNA连接酶连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌，用PCR快速验证重组转化是否成功，此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是若转化成解析功，则大肠杆菌的DNA中含有M、N基因，热变性会使大肠杆菌细胞破裂，DNA流出。(3)菌株一般低温保存于固体培养基上，故取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，可直接在固体培养基上进行划线培养。有氧条件下，酵母菌可以大量繁殖，故活化后接种至液体培养基，可采用振荡培养以扩大菌体数量。(4)可采用梯度稀释法对菌液逐级稀释。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载解析体，其不含M、N基因。由“OD600为波长600 nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高”及题图中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6)，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组酵母菌数量明显多于锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体组，可知，转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是N。解析能力二 基因工程的基本操作程序分析(考查科学思维、科学探究)3.(2023·全国乙卷，T38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题：(1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为_______；②为________，其作用是_________________________________________________。终止子启动子被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录(2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是___________________________________________________________ (答出1点即可)。密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同(3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。选择合适的运载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和运载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测酵母菌是否会发黄色荧光(1)一个基因表达载体的组成，除了目的基因，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。(2)结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，解析发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。(3)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。解析4.(2024·湖南卷，T21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用____________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。纤维素酶和果胶酶生长素和细胞分裂素(2)单倍体育种。常用________________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是______________________________________________________。(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。花药离体培养利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用__________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中___________的诱导作用最强。HindⅢ和BamHⅠ交链格孢②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不 同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：__________________________________________________________________________。利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL(1)植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。原生质体融合后形成杂种细胞，给予适宜的条件培养杂种细胞，并添加生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目为百合植株根尖有丝分裂中期的一半，则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以解析及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并将其连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映病原微生物对启动子pL活性的影响的目的。根据题图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。②欲提高百合B中L基因的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。解析考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定微考点/大突破第一部分1.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理。不溶于2 mol/L二苯胺(2)方法步骤(以洋葱为例)。研磨上清液95%一个方向提醒 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。2 mol/L二苯胺5 min蓝色2.DNA片段的扩增(1)原理：DNA的__________原理。(2)PCR实验的操作步骤。热变性微量移液器离心管提醒 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。底部PCR仪3.DNA片段的电泳鉴定(1)原理。①电泳的原理：DNA分子具有______________，在一定的pH下，这些基团可以带上________________。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷__________的电极移动。②鉴定的原理：PCR的产物一般通过_________________________来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的______________等有关；凝胶中的DNA分子通过________，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。可解离的基团正电荷或负电荷相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象染色(2)过程。电泳凝胶载样紫外灯(3)结果分析与评价。①成功扩增出DNA片段的判断依据是_____________________________________________________。②进行电泳鉴定的结果应该是________条条带。如图所示，该片段大小约为________bp。可以在波长为300 nm的紫外灯下直接观察到DNA条带一750提醒 电泳时，DNA的相对分子质量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子质量越小，迁移速率越快。能力一 DNA的粗提取与鉴定(考查科学探究)1.(2023·广东卷，T11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色裂解的目的是使细胞破裂释放出DNA等物质，A项正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B项正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不 同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C项正确；将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D项错误。解析2.(2024·山东卷，T13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰DNA的提取过程中可以不使用离心机，可将过滤好的研磨液在 4 ℃冰箱中放置几分钟后，直接取上清液放入烧杯中，A项正确，B项错误；鉴定过程需要沸水浴加热，DNA分子在高温下会解螺旋，双螺旋结构会发生改变，C项错误；加热是唯一变量，设置一个加二苯胺不加DNA的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D项错误。解析能力二 DNA片段的扩增及电泳鉴定(考查科学探究)3.(2023·福建卷，T4)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是( )A.实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理B.实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源C.实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNAD.实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，但移液器不需要，A项错误；在将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时，应先加样，然后接通电源，B项错误；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，因此取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后，析出的白色丝状物即粗提取的DNA，C项正确；鉴定DNA 时，需要把白色丝状物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴，D项错误。解析4.(2023·浙江6月选考，T19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是( )A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子由题图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A项错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，且翻译的方向是沿mRNA的5'→3'，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B项正确；由题图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，解析则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C项错 误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D项错误。解析微真题/重体悟第二部分1.(2024·湖南卷，T5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )A.限制酶失活，更换新的限制酶B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A项正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B项错误；质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺 失，会造成限制酶无法进行切割，因此应更换为正常质粒DNA，C项正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D项正确。解析2.(2024·江西卷，T12)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( )A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadBB.E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒分析题图可知，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因 gadB，A项正确；由题意知，L-谷氨酸钠是生产γ-氨基丁酸的底 物，不能用来供能，B项错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C项错误；选择限制酶时需考虑多种条件，如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和解析终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等，同时在设计特异性引物时，还需要在其5'端设计限制酶酶切位点，以便构建重组质粒，根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D项错误。解析3.(2024·山东卷，T5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引 物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( )A.①② B.②③ C.①④ D.③④反应管 加入的单链DNA① 5'—G C C G A T C T T T A T A—3'3'—G A C C G G C T A G A A A—5'② 5'—A G A G C C A A T T G G C—3'③ 5'—A T T T C C C G A T C C G—3'3'—A G G G C T A G G C A T A—5'④ 5'—T T C A C T G G C C A G T—3'反应管②和④虽然只有一种单链，但是单链含回文序列，可以同种单链之间发生互补，四个反应管中单链DNA互补配对情况如图所示：由图分析可知，D项正确。解析4.(2024·贵州卷，T21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株 (转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含 量，结果如表所示(表中“+”表示有，“-”表示无)。检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)野生型 + + +野生型 - - -突变体 + - -转基因菌株 + + +回答下列问题：(1)据表可推测________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是________________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是____________________________________________________________(答出1点即可)。蔗糖催化蔗糖转化成葡萄糖单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少量)(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________ (填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度________(填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。NV基因>与野生型相比，突变体是由T-DNA插入NV基因中，使NV基因发生了碱基对的增添而引起的，因此突变体相应基因的序列更长(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是_________________________________________________________________________________。突变体突变体的T-DNA上会存在相应的标记基因，干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测(1)据题表中野生型菌株的两组结果对比分析可知，如果培养液中添加了蔗糖，NV基因就会表达形成NV酶，否则没有NV酶的形 成，由此推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析题表可知，当蔗糖和NV酶同时存在时，培养液中就会出现葡萄糖，由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。酶的活性可以用单位时间单位体积反应物的减少量或生成物的增加量表示，因此NV酶的活性可以用单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少 量)表示。(2)根据题意，突变体是由T-DNA随机插入野生型菌株，解析使NV基因发生了突变产生的，说明T-DNA插入了NV基因中，使NV基因发生了碱基对的增添，即突变体中NV基因突变后的序列比野生型的NV基因序列更长，所以用与NV基因配对的引物进行扩增，扩增的结果是突变体扩增片段的长度更长。(3)为了进一步验证NV基因的功能，在突变体(NV基因突变)细胞中，转入NV基因，以便将转基因植株与突变体(NV基因突变)的结果进行对比。由于突变体的T-DNA上会存在原有的标记基因，干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测，因此在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因。解析5.(2024·广东卷，T21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。回答下列问题：(1)研究者优化了培养基的____________(答出两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。碳源、氮源(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2，载体的部分结构见图3)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________________，理由是__________________________________________________________________________________________________________________。PT7、PBAD、PBAD基因2、3可正常表达出无活性产物，蓝光照射时再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表达(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_______________________________________________________(答出两点)。(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时 间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________。选择含有重组质粒的驹形杆菌，杀死其他杂菌避免污染蓝光照射诱导nMag和pMag结合，激活T7RNAP，从而与特异型启动子PT7结合，酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶，酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：______________________________________________________________。将酪氨酸酶基因换成合成其他色素酶的基因，催化产生不同的色素(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)依据题图2及题干信息可知，为实现蓝光控制染色，应该先合成无活性的T7RNAP，故基因2、3的上游应连接通用型启动子。在蓝光诱导下合成酪氨酸酶，酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素，实现蓝光控制染色。此过程中酪氨酸酶需要特异性合 成，因此基因1上游应连接仅被T7RNAP识别的PT7启动子。(3)将解析携带大观霉素抗性基因的光控表达载体导入驹形杆菌，会获得未成功导入的菌株和成功导入的工程菌株，长时间培养时也可能感染其他杂菌，在培养液中加入大观霉素(抗生素)可以筛选出工程菌株，同时也能抑制其他杂菌的生长，提高工程菌的生产效率。(4)详见答案。(5)为获得不同颜色图案的BC膜，可以利用题述光控基因表达载体，将酪氨酸酶基因换成控制合成其他色素酶的基因，催化产生不同的色素。解析课时微练(四十二) 基因工程的基本工具和基本操作程序 一、选择题:本题共12小题,在每小题给出的四个选项中,只有一项是符合题目要求的1.(2025·广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法,正确的是( )A.在进行基因工程操作中,被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因2.(2025·南通统考)如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是( )A.三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同B.这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端C.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接D.图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,会增加两个游离的磷酸基团3.(2023·湖北卷,T4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落4.蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋白,有着超强的抗张强度,被称为“生物钢”。某科研小组欲利用转基因大肠杆菌生产蛛丝蛋白。如图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图,其中1~4表示PCR过程中DNA上引物可能结合的位置。下列有关叙述错误的是( )A.若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因,限制酶会破坏4个磷酸二酯键B.若用PCR技术获取目的基因,则图中的1、4分别是2种引物结合的位置C.在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶D.受体细胞一般需先用Ca2+处理,更利于实现转化5.(2025·重庆调研)叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。研究人员以HIV病毒包膜蛋白上的V3环和C4结构域序列的基因作为目的基因,与叶绿体特异性启动子、终止子等序列整合后,构建成基因表达载体,转入叶绿体成功表达出C4V3抗原。下列说法不正确的是( )A.植物生物反应器主要依赖基因工程和细胞工程等现代生物学技术B.构建叶绿体遗传转化体系需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶C.按上述方式构建的基因表达载体使得目的基因只能在叶绿体中表达D.C4V3抗原表达成功与否,可以用凝胶电泳法进行分子水平的检测6.研究人员发现高强度光照下,番茄会通过NPQ(一种光保护机制)散失过多热能,避免高强度光照造成损伤。为研究V基因对NPQ的作用机制,科研人员利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS技术)特异性地使V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强。技术原理如图所示。下列叙述正确的是( )A.本实验中的目的基因应选用V基因,该基因可通过PCR技术获得B.该过程中目的基因整合到特殊农杆菌的T DNA上C.该过程中VIGS技术通过降解V基因的mRNA进而抑制V基因的表达D.V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化7.(2025·湖北模拟)疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。现有6份血样,处理后进行PCR扩增pfcrt基因。产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳结果如图所示。1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是( )[注] 泳道号对应血样号。A.1号和6号_______B.2号和4号C.3号和5号_______D.1号、2号、4号和6号8.(2025·湖北模拟)研究人员利用农杆菌介导法和花粉管通道法培育出转抗寒基因PgLCBF1的月季石榴,主要过程示意图如图。下列说法正确的是( )A.用限制酶XbaⅠ分别切割质粒和抗寒基因产生平末端,便于目的基因插入到质粒B.过程②筛选时,使用的液体培养基需加入新霉素、碳源、氮源和水等物质C.实验中过程③主要目的是使转基因大肠杆菌快速增殖,获得更多的重组质粒D.花粉管通道转化法不需要经过植物组织培养,并且获得的种子一定为转基因种子9.(2025·淮安质检)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶,下列说法正确的是( )A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B.限制酶只能切割双链DNA片段,不能切割烟草花叶病毒的核酸C.只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒,才能形成重组质粒D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,能剪切自身的DNA10.青蒿素是有效的抗疟疾药物,但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况,科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织,获得了黄花蒿的冠瘿组织,改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是( )A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法B.图中P位于基因的首端,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录C.图中还缺少的结构是标记基因,标记基因的作用是表达出目的基因产物D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上可采用PCR技术11.(2024·湖南卷,T15改编)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是( )A.上述PCR反应体系中需加入两种引物B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢C.5'—CTACCCGTGAT—3'为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G12.大丽轮枝菌(一种丝状真菌)是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径,研究人员用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌,培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株,主要过程如图。下列相关叙述错误的是( )A.图中启动子能被RNA聚合酶识别并结合,驱动sGFP基因的持续转录B.被相关限制酶处理后,图中b链上黏性末端的碱基序列(5'→3')为AGCTC.若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP,则5轮后消耗引物数为32个D.③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌,得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP二、非选择题13.(2024·黑吉辽卷,T25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T DNA转移)和不含有Vir基因、含有T DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题:[注] F1~F3,R1~R3表示引物;T DNA LB表示左边界;T DNA RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是________________________________________________________。(2)本操作中获取目的基因的方法是_______和_______。(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是_____________________________________,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是___________________________________。(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用______________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是_______和_______。(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是_______(填选项字母)。A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达C.将1~1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白14.(科学探究)(2025·邯郸模拟)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现,水稻蜡质基因(Wx)编码直链淀粉合成酶。Wx基因模板链第226位碱基为G,此时胚乳中直链淀粉含量最高(表现为非糯性),记为品种G;若该位点突变成T,胚乳中直链淀粉的合成水平会降低(表现为糯性),记为品种T。已知品种G和品种T杂交,后代均表现为非糯性,如图表示品种G和品种T中Wx基因的部分碱基序列,请回答下列问题:(1)研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料进行PCR扩增,若引物1的核苷酸序列为5'—GCTTCACTTCTCTGCTTGTG—3',则引物2的核苷酸序列为5'—_____________________—3'。(2)研究人员对PCR扩增产物经AccⅠ酶(已知AccⅠ酶的识别位点为,两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点)切割后进行______________可以检测出该待测水稻属于哪种品种。若检测结果只观察到长度为_______bp的DNA条带,则表明该水稻为品种T。(3)将品种T的Wx基因与载体结合构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有______________。若利用我国科学家独创的目的基因导入方法获得转基因水稻,此种方法_______(填“需要”或“不需要”)进行植物组织培养,原因是__________________________________。(4)若利用基因工程改造品种G,获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻,可以将Wx基因_______(填“正向”或“反向”)接入质粒,导入品种G的受体细胞进而获得转基因水稻,从_______水平抑制Wx基因表达。课时微练(四十二) 基因工程的基本工具和基本操作程序1.D 解析 在进行基因工程操作中,被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,A项错误;具有一个至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体,B项错误;质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子,C项错误;作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因,D项正确。2.C 解析 根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知,这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端,且长度大小相同,A、B两项正确;用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端,故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接,C项错误;题图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,会断裂两个磷酸二酯键,从而增加两个游离的磷酸基团,D项正确。3.D 解析 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A项正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B项正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C项正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D项错误。4.B 解析 若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因,DNA每条链上会破坏2个磷酸二酯键,共会破坏4个磷酸二酯键,A项正确;由于DNA聚合酶只能从5'→3'延伸子链,题图中的磷酸基团为5'端,羟基为3'端,由引物3'端延伸子链,子链和模板链反向平行,因此根据引物的延伸方向可知题图中与引物结合的部位是2、3,B项错误,在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶,C项正确;受体细胞一般需先用Ca2+处理,使其处于吸收周围环境DNA分子的状态,更利于实现转化,D项正确。5.B 解析 植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞,其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞,因此涉及基因工程和细胞工程技术,A项正确;构建叶绿体遗传转化体系需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶,不需要DNA聚合酶,B项错误;据题意可知,该过程构建的基因表达载体中含有叶绿体特异性启动子,使得目的基因只能在叶绿体中表达,C项正确;凝胶电泳法是一种分离和分析生物分子的技术,主要用于检测DNA、RNA或蛋白质分子的大小和纯度,C4V3抗原表达成功与否,可以用凝胶电泳法进行分子水平的检测,D项正确。6.D 解析 分析题意可知,本实验的目的是研究V基因在高光条件下对NPQ机制的作用,且需要使V基因沉默,故本实验中目的基因应选用基因V的反义基因,A项错误;目的基因与烟草病毒载体形成重组病毒载体,该目的基因没有整合到特殊农杆菌的T DNA上,B项错误;VIGS技术是将反义V基因转录的RNA切割形成小分子RNA,小分子RNA与V基因的mRNA结合,抑制了V基因的翻译过程,C项错误;V基因沉默,发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强,推测V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化,D项正确。7.B 解析 分析题意,疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知,在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点,而敏感性基因组中具有该酶切位点,因此对6份血样处理后进行PCR,产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型,只有一条带的为抗性,所以1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是2号和4号,B项正确,A、C、D三项错误。8.C 解析 题图所示限制酶XbaⅠ切点不在识别序列的中心轴线处,故用限制酶XbaⅠ分别切割质粒和抗寒基因产生黏性末端,A项错误;题图所示过程②筛选时出现了菌落,使用的是固体培养基,B项错误;题图所示实验中过程③需要接种、摇床培养,可判断该步骤使用液体培养基培养,主要目的是使转基因大肠杆菌快速增殖,获得更多的重组质粒,C项正确;花粉管通道转化法不需要经过植物组织培养,但是此方法并不一定将目的基因导入受体细胞,有失败的可能,故获得的种子不一定为转基因种子,D项错误。9.B 解析 DNA连接酶连接的是两个DNA片段,A项错误;限制酶只能切割DNA分子,烟草花叶病毒的核酸是RNA,不能切割,B项正确;用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒,也可能形成相同的黏性末端,进而形成重组质粒,C项错误;限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰,所以不能剪切自身的DNA,D项错误。10.C 解析 将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法,A项正确;题图中P为启动子,位于基因的首端,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录,B项正确;题图中还缺少的结构是标记基因,标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来,C项错误;要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术,D项正确。11.C 解析 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A项错误;电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B项错误;分析电泳结果,以对照个体的一条链为模板复制的子链序列为5'—CTACCCGTGAT—3',模板链序列为5'—ATCACGGGTAG—3',同理患者的子链序列为5'—CTACCTGTGAT—3',模板链序列为5'—ATCACAGGTAG—3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基G突变为A,C项正确,D项错误。12.C 解析 启动子是一段有特殊结构的DNA片段,能被RNA聚合酶识别并结合,驱动基因的持续转录,A项正确;需要利用题述两种限制酶对sGFP片段和质粒进行剪切,题图中质粒大片段的左端的限制酶是HindⅢ,根据HindⅢ识别的碱基序列可知,题图中b链上黏性末端的碱基序列(5'→3')为AGCT,B项正确;若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP,则5轮后消耗引物数为25×2-2=62(个),C项错误;③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌,得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP,因为导入的原始质粒也可以具有抗性,D项正确。13.答案 (1)使蛋白质水解 使蛋白质等溶解在酒精中,DNA不溶于酒精而析出 (2)PCR 人工合成 (3)RNA聚合酶识别并结合的部位 使目的基因在植物细胞中高效表达(保证目的基因的高水平表达) (4)潮霉素B抗性 (5)F3 R2 (6)D解析 (1)细胞中含有DNA、蛋白质等物质,在提取DNA时,加入蛋白酶可以使蛋白质水解,提高粗提取的DNA的纯度。DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质。(2)由题图可知,从苏云金杆菌中利用PCR分离和扩增Bt基因,通过酶切获得1 363~1 848基因序列,通过人工合成的方法合成1~1 362基因序列。(3)启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位,驱动目的基因转录。将两个p35s启动子串联于目的基因上游,使其形成双启动子,可使目的基因在植物细胞中高效表达。(4)由题图可知,在重组的穿梭质粒上只有HygBR(潮霉素B抗性基因)位于T DNA上,其可以随T DNA转移至棉花愈伤组织,并插入棉花细胞的染色体DNA上,故可以用含有潮霉素B的培养基初步筛选成功转化的棉花愈伤组织。(5)目的基因由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848天然序列拼接而成,扩增目的基因时所选引物需与扩增片段两端结合,且延伸方向相反,因此选用引物F3和R2。(6)蛋白质工程是通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质,由题干可知,将人工合成的1~1 362基因序列连接通过酶切获得的1 363~1 848天然序列,实现对原有的抗虫基因的改造,以获得改造的抗虫蛋白,属于蛋白质工程,D项符合题意。14.答案 (1)ATGATTTAACGAGAGTTGAA(2)琼脂糖凝胶电泳 460(3)限制酶和DNA连接酶(或限制性内切核酸酶和DNA连接酶) 不需要 受体细胞是受精卵,受精卵能直接发育成新个体(4)反向 翻译解析 (1)引物的延伸方向为5'→3',故题图所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链,故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同;而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板,故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对,该实验中需设计的引物2为5'-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3'。(2)常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。引物1设计区碱基序列为71位到90位,引物2设计区碱基序列为511位到530位,故若酶切产物只能观察到460 bp的DNA条带,则表明第226位碱基是T,该位点所在序列不能被正常剪切,该水稻为T品种。(3)构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。花粉管通道法是我国独创的一种将目的基因导入受体细胞的方法。其过程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNA导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。因此不需要进行植物组织培养。(4)若利用基因工程改造品种G,获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻,需要破坏Wx基因或者抑制Wx基因表达。将Wx基因“反向”接入质粒,导入品种G的受体细胞,可以从翻译水平抑制Wx基因表达。(共50张PPT)基因工程的基本工具和基本操作程序课时微练(四十二)1567891011121314234一、选择题：本题共12小题，在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的1.(2025·广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A项错误；具有一个至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B项错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C项错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，D项正确。解析15678910111213142342.(2025·南通统考)如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是( ) A.三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同B.这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端C.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接D.图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会增加两个游离的磷酸基团1567891011121314234根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，且长度大小相同，A、B两项正确；用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端，故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接，C项错误；题图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D项正确。解析15678910111213142343.(2023·湖北卷，T4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )1567891011121314234A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落1567891011121314234用HindⅢ酶切后，目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的，故目的基因转录的产物可能不同，A项正确；用PvuⅠ酶切后，TetR未被破坏，无论该质粒是否含有目的基因，都能在含Tet的培养基中存活，B项正确；插入目的基因的重组质粒比空质粒大，故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同，故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C项正确；用SphⅠ酶切后，插入目的基因的质粒上的TetR被破坏，受体菌不能在含Tet的培养基上存活，D项错误。解析15678910111213142344.蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋白，有着超强的抗张强度，被称为“生物钢”。某科研小组欲利用转基因大肠杆菌生产蛛丝蛋白。如图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示PCR过程中DNA上引物可能结合的位置。下列有关叙述错误的是( )1567891011121314234A.若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，限制酶会破坏4个磷酸二酯键B.若用PCR技术获取目的基因，则图中的1、4分别是2种引物结合的位置C.在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶D.受体细胞一般需先用Ca2+处理，更利于实现转化1567891011121314234若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，DNA每条链上会破坏2个磷酸二酯键，共会破坏4个磷酸二酯键，A项正确；由于DNA聚合酶只能从5'→3'延伸子链，题图中的磷酸基团为5'端，羟基为3'端，由引物3'端延伸子链，子链和模板链反向平行，因此根据引物的延伸方向可知题图中与引物结合的部位是2、3，B项错误,在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，C项正确；受体细胞一般需先用Ca2+处理，使其处于吸收周围环境DNA分子的状态，更利于实现转化，D项正确。解析15678910111213142345.(2025·重庆调研)叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。研究人员以HIV病毒包膜蛋白上的V3环和C4结构域序列的基因作为目的基因，与叶绿体特异性启动子、终止子等序列整合后，构建成基因表达载体，转入叶绿体成功表达出C4V3抗原。下列说法不正确的是( )A.植物生物反应器主要依赖基因工程和细胞工程等现代生物学技术B.构建叶绿体遗传转化体系需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶C.按上述方式构建的基因表达载体使得目的基因只能在叶绿体中表达D.C4V3抗原表达成功与否，可以用凝胶电泳法进行分子水平的检测1567891011121314234植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞，其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞，因此涉及基因工程和细胞工程技术，A项正确；构建叶绿体遗传转化体系需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，B项错误；据题意可知，该过程构建的基因表达载体中含有叶绿体特异解析1567891011121314234性启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达，C项正确；凝胶电泳法是一种分离和分析生物分子的技术，主要用于检测DNA、RNA或蛋白质分子的大小和纯度，C4V3抗原表达成功与否，可以用凝胶电泳法进行分子水平的检测，D项正确。解析15678910111213142346.研究人员发现高强度光照下，番茄会通过NPQ(一种光保护机制)散失过多热能，避免高强度光照造成损伤。为研究V基因对NPQ的作用机制，科研人员利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS技术)特异性地使V基因沉默，发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强。技术原理如图所示。下列叙述正确的是( )1567891011121314234A.本实验中的目的基因应选用V基因，该基因可通过PCR技术获得B.该过程中目的基因整合到特殊农杆菌的T-DNA上C.该过程中VIGS技术通过降解V基因的mRNA进而抑制V基因的表达D.V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化分析题意可知，本实验的目的是研究V基因在高光条件下对NPQ机制的作用，且需要使V基因沉默，故本实验中目的基因应选用基因解析1567891011121314234V的反义基因，A项错误；目的基因与烟草病毒载体形成重组病毒载体,该目的基因没有整合到特殊农杆菌的T-DNA上，B项错误；VIGS技术是将反义V基因转录的RNA切割形成小分子RNA，小分子RNA与V基因的mRNA结合，抑制了V基因的翻译过程，C项错误；V基因沉默，发现高强度光照下番茄叶片的损伤明显增强，推测V基因的表达可能促进了NPQ机制的活化，D项正确。解析15678910111213142347.(2025·湖北模拟)疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。现有6份血样，处理后进行PCR扩增pfcrt基因。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。1~6号血样中，来自氯喹抗性患者的是( )15678910111213142341567891011121314234[注] 泳道号对应血样号。A.1号和6号 B.2号和4号C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号分析题意，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自氯喹抗性患者的是2号和4号，B项正确，A、C、D三项错误。解析15678910111213142348.(2025·湖北模拟)研究人员利用农杆菌介导法和花粉管通道法培育出转抗寒基因PgLCBF1的月季石榴，主要过程示意图如图。下列说法正确的是( )1567891011121314234A.用限制酶XbaⅠ分别切割质粒和抗寒基因产生平末端，便于目的基因插入到质粒B.过程②筛选时，使用的液体培养基需加入新霉素、碳源、氮源和水等物质C.实验中过程③主要目的是使转基因大肠杆菌快速增殖，获得更多的重组质粒D.花粉管通道转化法不需要经过植物组织培养，并且获得的种子一定为转基因种子1567891011121314234题图所示限制酶XbaⅠ切点不在识别序列的中心轴线处，故用限制酶XbaⅠ分别切割质粒和抗寒基因产生黏性末端，A项错误；题图所示过程②筛选时出现了菌落,使用的是固体培养基，B项错误；题图所示实验中过程③需要接种、摇床培养，可判断该步骤使用液体培养基培养，主要目的是使转基因大肠杆菌快速增殖，获得更多的重组质粒，C项正确；花粉管通道转化法不需要经过植物组织培养，但是此方法并不一定将目的基因导入受体细胞，有失败的可能，故获得的种子不一定为转基因种子，D项错误。解析15678910111213142349.(2025·淮安质检)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是( )A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸C.只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能剪切自身的DNA1567891011121314234DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B项正确；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，进而形成重组质粒，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。解析156789101112131423410.青蒿素是有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织，获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是( )1567891011121314234A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法B.图中P位于基因的首端，作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录C.图中还缺少的结构是标记基因，标记基因的作用是表达出目的基因产物D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上可采用PCR技术1567891011121314234将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法，A项正确；题图中P为启动子，位于基因的首端，作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录，B项正确；题图中还缺少的结构是标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来，C项错误；要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用PCR技术，D项正确。解析156789101112131423411.(2024·湖南卷，T15改编)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( )1567891011121314234A.上述PCR反应体系中需加入两种引物B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C.5'—CTACCCGTGAT—3'为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G1567891011121314234利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A项错误；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B项错误；分析电泳结果，以对照个体的一条链为模板复制的子链序列为5'—CTACCCGTGAT—3'，模板链序列为5'—ATCACGGGTAG—3'，同理患者的子链序列为5'—CTACCTGTGAT—3'，模板链序列为5'—ATCACAGGTAG—3'，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基G突变为A，C项正确，D项错误。解析156789101112131423412.大丽轮枝菌(一种丝状真菌)是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如图。下列相关叙述错误的是( )1567891011121314234A.图中启动子能被RNA聚合酶识别并结合，驱动sGFP基因的持续转录B.被相关限制酶处理后，图中b链上黏性末端的碱基序列(5'→3')为AGCTC.若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP，则5轮后消耗引物数为32个D.③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP1567891011121314234启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录，A项正确；需要利用题述两种限制酶对sGFP片段和质粒进行剪切，题图中质粒大片段的左端的限制酶是HindⅢ，根据HindⅢ识别的碱基序列可知，题图中b链上黏性末端的碱基序列(5'→3')为AGCT，B项正确；若①是利用PCR扩增出含有限制酶酶切位点的sGFP，则5轮后消耗引物数为25×2-2=62(个)，C项错误；③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP，因为导入的原始质粒也可以具有抗性，D项正确。解析1567891011121314234二、非选择题13.(2024·黑吉辽卷，T25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题:15678910111213142341567891011121314234[注] F1~F3，R1~R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是_______________________________________________。(2)本操作中获取目的基因的方法是_________和_____________。1567891011121314234使蛋白质水解使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出PCR人工合成(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是________________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_________________________________________________________。(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用_____________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是_______和_______。1567891011121314234RNA聚合酶识别并结合的部位使目的基因在植物细胞中高效表达(保证目的基因的高水平表达)潮霉素B抗性F3R2(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______(填选项字母)。A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达C.将1~1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白1567891011121314234D(1)细胞中含有DNA、蛋白质等物质，在提取DNA时，加入蛋白酶可以使蛋白质水解，提高粗提取的DNA的纯度。DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。(2)由题图可知，从苏云金杆菌中利用PCR分离和扩增Bt基因，通过酶切获得1 363~1 848基因序列，通过人工合成的方法合成1~1 362基因序列。(3)启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录。将两个p35s启动子串联于目的基因上游，使解析1567891011121314234其形成双启动子，可使目的基因在植物细胞中高效表达。(4)由题图可知，在重组的穿梭质粒上只有HygBR(潮霉素B抗性基因)位于T-DNA上，其可以随T-DNA转移至棉花愈伤组织，并插入棉花细胞的染色体DNA上，故可以用含有潮霉素B的培养基初步筛选成功转化的棉花愈伤组织。(5)目的基因由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848天然序列拼接而成，扩增目的基因时所选引物需与扩增片段两端结合，且延伸方向相反，因此选用引物F3和R2。1567891011121314234解析(6)蛋白质工程是通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，由题干可知，将人工合成的1~1 362基因序列连接通过酶切获得的1 363~1 848天然序列，实现对原有的抗虫基因的改造，以获得改造的抗虫蛋白，属于蛋白质工程，D项符合题意。1567891011121314234解析14.(科学探究)(2025·邯郸模拟)稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因(Wx)编码直链淀粉合成酶。Wx基因模板链第226位碱基为G，此时胚乳中直链淀粉含量最高(表现为非糯性)，记为品种G；若该位点突变成T，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低(表现为糯性)，记为品种T。已知品种G和品种T杂交，后代均表现为非糯性，如图表示品种G和品种T中Wx基因的部分碱基序列，请回答下列问题:1567891011121314234(1)研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料进行PCR扩增，若引物1的核苷酸序列为5'—GCTTCACTTCTCTGCTTGTG—3'，则引物2的核苷酸序列为5'—________________________________—3'。1567891011121314234ATGATTTAACGAGAGTTGAA(2)研究人员对PCR扩增产物经AccⅠ酶(已知AccⅠ酶的识别位点为，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点)切割后进行__________________可以检测出该待测水稻属于哪种品种。若检测结果只观察到长度为_______bp的DNA条带，则表明该水稻为品种T。1567891011121314234琼脂糖凝胶电泳460(3)将品种T的Wx基因与载体结合构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有_________________________________________________。若利用我国科学家独创的目的基因导入方法获得转基因水稻，此种方法___________(填“需要”或“不需要”)进行植物组织培养，原因是_____________________________________________。1567891011121314234限制酶和DNA连接酶(或限制性内切核酸酶和DNA连接酶)不需要受体细胞是受精卵，受精卵能直接发育成新个体(4)若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，可以将Wx基因_________(填“正向”或“反向”)接入质粒，导入品种G的受体细胞进而获得转基因水稻，从________水平抑制Wx基因表达。1567891011121314234反向翻译(1)引物的延伸方向为5'→3'，故题图所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同；而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3'。(2)常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。引物1设计区碱基序列为71位到90位，引物2设计区碱基序列为511位到530位，故若酶切产物只能解析1567891011121314234观察到460 bp的DNA条带，则表明第226位碱基是T，该位点所在序列不能被正常剪切，该水稻为T品种。(3)构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。花粉管通道法是我国独创的一种将目的基因导入受体细胞的方法。其过程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转解析1567891011121314234基因的新个体。因此不需要进行植物组织培养。(4)若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，需要破坏Wx基因或者抑制Wx基因表达。将Wx基因“反向”接入质粒，导入品种G的受体细胞，可以从翻译水平抑制Wx基因表达。解析1567891011121314234 展开更多...... 收起↑ 资源列表 第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序.docx 第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序.pptx 课时微练(四十二) 基因工程的基本工具和基本操作程序.docx 课时微练(四十二) 基因工程的基本工具和基本操作程序.pptx
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