资源简介

（4）基因工程
——高二生物学浙科版（2019）选择性必修三期末易错题集训
【易错点分析】
1.限制酶的选择与使用
易错点：不能正确选择限制酶，不理解限制酶对目的基因和载体的切割作用及结果。
分析：构建基因表达载体时，需选择合适的限制酶。要依据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点，以及是否会破坏目的基因和标记基因等来确定。例如，不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，否则会破坏目的基因；为避免目的基因和质粒的自身连接、目的基因和质粒反向连接，可使用两种限制酶分别切割目的基因和质粒。
2.与 DNA 分子相关的酶的作用
易错点：混淆限制酶、DNA 连接酶、RNA 聚合酶、解旋酶、DNA 聚合酶等的作用。
分析：限制酶用于切割 DNA 分子，产生黏性末端或平末端；DNA 连接酶用于连接 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键；RNA 聚合酶用于转录过程，以 DNA 为模板合成 RNA；解旋酶用于解开 DNA 双螺旋结构；DNA 聚合酶用于 DNA 复制过程，以亲代 DNA 为模板合成子代 DNA。
3.PCR 技术相关问题
易错点：对 PCR 技术中引物的设计、复性温度的选择等理解不到位。
分析：引物是依据目的基因的已知序列设计的，应选择目的基因每条链的 3' 端对应序列，依据碱基互补配对原则设计，且自身及一对引物之间不应存在互补序列，否则会影响引物与模板的复性结合。复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链。
4.基因表达载体的构建
易错点：混淆启动子、起始密码子，终止子、终止密码子，对基因表达载体的组成及各部分的作用理解不清晰。
分析：启动子是一段特殊结构的 DNA 片段，位于基因的上游，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA；起始密码子是 mRNA 上决定第一个氨基酸的密码子。终止子是基因中的一段 DNA 序列，能使转录终止；终止密码子是 mRNA 上终止翻译的信号。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，各部分协同作用，保证目的基因在受体细胞中稳定存在并正确表达。
5.目的基因导入受体细胞的方式
易错点：对不同生物受体细胞导入目的基因的方法理解混淆，如农杆菌转化法、花粉管通道法、显微注射法等的适用范围和原理。
分析：农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物，利用农杆菌可将目的基因导入植物细胞；花粉管通道法是我国科学家独创的介导植物基因转化的方法，在植物受粉后的特定时期，将外源 DNA 溶液涂于柱头上，利用花粉管通道将外源 DNA 导入受精卵细胞；显微注射法常用于将目的基因导入动物细胞，如受精卵。
6.目的基因的检测与鉴定
易错点：不能准确区分目的基因检测和鉴定的不同方法及原理，如分子水平的检测和个体水平的鉴定。
分析：检测目的基因是否导入受体细胞，常用 DNA 分子杂交技术，用放射性同位素等标记的目的基因作探针，与受体细胞中的 DNA 进行杂交。检测目的基因是否转录出 mRNA，采用分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与 mRNA 杂交。检测目的基因是否表达出蛋白质，用抗原 — 抗体杂交技术。个体水平的鉴定，如检测转基因植物是否具有抗病、抗虫等特性，可通过接种相应病原体或害虫进行观察。
【易错点练习】
1.1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列叙述错误的是( )
A.限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列
B.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.用限制酶酶切获得一个外源基因时，若得到两个切口，有4个磷酸二酯键被断开
D.DNA连接酶能连接同种限制酶切开的两个DNA片段，重新形成磷酸二酯键
2.DNA重组技术可以赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品.在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A.所有的限制酶都具有专一性,不同限制酶切割产生的黏性末端都不同
B.限制酶和DNA连接酶分别能催化磷酸二酯键的断裂和形成
C.用限制酶酶切获得一个外源基因时产生2个切口,有2个磷酸二酯键被断开
D.DNA连接酶可以将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构
3.Sau3A I和BamH I的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是( )
限制酶 识别序列和切割位点
BamH I G↓GATCC
Sau3A I ↓GATC
A.两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同
B.能被Sau3A I识别的DNA位点均能被BamH I识别
C.该DNA分子上有2个BamH Ⅰ不能识别但Sau3A Ⅰ能识别的酶切位点
D.该DNA分子经Sau3AⅠ和BamH Ⅰ共同切割后可形成6个片段
4.育种工作者将苏云金芽孢杆菌中的B毒蛋白基因导入到植物细胞中培育出某种抗虫农作物,部分流程如图所示。下列有关说法错误的是( )
A.用PCR扩增Bt毒蛋白基因时,可选择5'-CTACIG-3'和5'-GCGGAT-3'组合的引物
B.选择培养基A和选择培养基B中分别添加的抗生素是潮霉素和氨苄青霉素
C.含有B毒蛋白基因的菌落是1、3和5
D.可利用抗原一抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出Bt毒蛋白
5.研究人员通过PCR扩增质粒pDNR-LIB中的sacB基因,该基因是一种常见的反选择标记基因(在含蔗糖的培养基中,该基因的表达产物将蔗糖转化,转化产物不利于宿主菌生长)。tetA是四环素抗性基因,利用基因工程技术将sacB基因插到质粒pAH162上,构建含有tetA-sacB双重选择系统的重组质粒,即pAH162-sacB,具体过程如图所示。将pAH162-sacB导入大肠杆菌验证其双重选择作用。下列分析错误的是( )
A.将sacB基因插入到pAH162上需要的限制酶是BamH I、EcoR I
B.需用处理大肠杆菌细胞使其能主动吸收周围环境中的DNA分子
C.为保证正向连接，PCR时应在sacB基因上游引物的5'端添加BamH I识别序列
D.大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
6.某实验小组进行了“DNA的粗提取与鉴定”实验，实验流程如图所示。下列说法正确的是( )
A.溶液甲是NaCl溶液，加入它的目的是溶解DNA
B.溶液乙在使用时需用50~60℃水浴加热5 min
C.实验也可用鸡血、猪血等动物组织作为材料
D.粗提取的DNA中含有RNA、蛋白质等杂质
7.基因工程需要多种酶的参与。下列有关叙述正确的是( )
A.限制酶主要存在于原核细胞中,可识别DNA或RNA上的核苷酸序列
B.DNA连接酶不能识别DNA上的核苷酸序列,连接具有黏性末端的DNA片段的过程中会发生碱基互补配对
C.解旋酶可破坏磷酸二酯键和氢键,用于在DNA复制过程中解开DNA双螺旋
D.成熟mRNA经逆转录酶催化形成的DNA能直接转录翻译合成蛋白质
8.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得,第一轮加诱变引物和常规引物,第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物,如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变的过程,其中引物箭头代表子链延伸方向。下列说法错误的是( )
A.第一轮PCR中,至少需要2个循环才能获得相应的大引物
B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C.扩增的定点诱变产物通常需连接启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
D.为了使两轮PCR在同一支试管中进行,设计引物时应考虑不同的复性温度
9.研究人员利用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下图所示(图中a链和6链分别是相应基因转录的模板链)。下列说法正确的是( )
A.利用PCR扩增sGFP时需解旋酶打开DNA双链，b链的黏性末端碱基序列(5 →3 )为AGCT
B.应将目的基因插入到复制原点，以保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达
C.先将目的基因导入农杆菌，再将农杆菌放置于含有潮霉素的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌
D.最终通过抗原—抗体杂交技术检测绿色荧光以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌
10.如图为构建尚麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中Npt Ⅱ基因编码新霉素磷酸转移酶,该酶作用可赋予生物抗卡那霉素的特性,GUS基因表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
A.构建重组质粒时需要的限制酶有Pst I、Xho I和EcoR I
B.在培养基中添加卡那霉素可初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织,不能选择呈现蓝色的组织进行培养
D.为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
11.下列将目的基因导入受体细胞的方法，不合理的是( )
A.利用显微注射法将目的基因导入受精卵，培育了超级小鼠
B.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
C.可利用含目的基因的噬菌体侵染玉米细胞来培育转基因玉米
D.用Ca2+处理大肠杆菌，有利于大肠杆菌细胞吸收环境中的DNA
12.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合成酶的作用,从而使植物多种代谢途径受影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性,除掉杂草的同时也会令作物受损,培育抗草甘膦作物是解决该问题的办法之一。研究人员向矮牵牛中转入外源EPSP合成酶基因,下列关于流程的叙述错误的是( )
A.用限制酶和DNA连接酶处理含目的基因的DNA片段和Ti质粒时,涉及磷酸二酯键的断裂和形成
B.载体Ti质粒上的抗生素合成基因通常作为对重组DNA分子鉴定和筛选的标记基因
C.基因表达载体组件中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录
D.利用农杆菌转化法可以将含有目的基因的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上
13.下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是( )
A.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出Mrna
B.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C.可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D.抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
14.基因表达载体的构建是基因工程的核心图示为某基因工程中构建基因表达载体(P3)的过程,其中tetr为四环素抗性基因,ampr为氨苄青霉素抗性基因,EcoR V为限制酶。下列有关基因表达载体(P3)的叙述,错误的是( )
A.构建过程需要限制酶、DNA连接酶等
B.P3上应具有启动子、终止子、复制原点等
C.可采用PCR和电泳技术进行进一步的鉴定与验证
D.可在含氨苄青霉素的选择培养基上大量复制并表达
15.EGFR是一种表皮生长因子受体，由信号肽区（可保证蛋白质在细胞中的定向运输）、胞外区、跨膜区和胞内区组成。当表皮生长因子与其胞外区结合后，可引起一系列基因活化，进而导致肿瘤细胞增殖，但EGFR缺失胞内区后形成的DNEGFR虽也可与表皮生氏因子结合，却不会引起相应的基因活化。图1为EGFRcDNA结构及其对应的蛋白质的功能区,研究人员利用人结肠癌组织、pEGFP-N1质粒、大肠杆菌、cos-7细胞（-种常用的动物细胞系）等做了一系列实验，以探究DNEGFR基因在细胞中的表达和定位情况,基本流程如图2所示。
（1）研究人员从人结肠癌组织中提取总RNA,用______酶处理获得cDNA。图2中过程②应选择图1中的引物______（填数字）进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物______端加入使用的限制酶的识别序列。
（2）图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，以便根据绿色荧光蛋白的位置确定_______。结合EGFR基因指导合成的蛋白质的各部分的功能，推测EGFP序列需在DNEGFR序列的______（填“上游”或“下游”），原因是_______。
（3）过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌和重组质粒混匀后培养在含有______（填抗生素）的培养基上，进行过程④和过程⑤的目的是______。
（4）过程⑥进行时需要提供的气体环境为_______。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时荧光应主要分布在______部位。
16.科研人员构建了可表达WRK10-MYC融合蛋白的重组农杆菌Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，该质粒的部分结构如图1所示，其中Kan为卡那霉素抗性基因，Hyg为潮霉素抗性基因,MYC标签序列编码标签短肽MYC,WRK10蛋白为转录因子,可与图2中PIF4基因启动子某区段结合并激活该基因的转录。
(1)位于Ti质粒不同位置的卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的作用分别是______。图中启动子的方向与对应基因转录的方向一致,从编码链的角度分析Pl和P2方向不同的原因是_____。
(2)已知利用LP和RP扩增结果为大带，BP和RP扩增结果为小带。可用图中二引物进行两次PCR的方法坚定转基因植物后代中的纯合转基因植株。T-DNA插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，则纯合转基因植株PCR检测结果为_____(填“大带”“大带和小带”或“小带”)。
(3)为了探究WRK10蛋白与PIF4基因启动子结合的具体区段(如图2所示)，科研工作者利用短肽MYC抗体处理了对应的基因表达产物，后经一系列过程,得到图3所示的结果，由此推测转基因植株体内WRK10蛋白在_________条件下能够结合PIF4基因启动子的_________区段从而激活该基因的表达。MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是_________。
答案以及解析
1.答案：B
解析：限制酶具有专一性，识别特定核苷酸序列并切割DNA，A项正确。质粒是存在于细菌细胞质中的一种小型环状DNA分子，能够自主复制，但并非只存在于细菌中，B项错误。限制酶切割DNA形成两个切口，每个切口断开两个磷酸二酯键，共四个，C项正确。DNA连接酶连接两个DNA斤段，形成磷酸二酯键，D项正确。因此，错误的描述是B项。
2.答案：B
解析：所有的限制酶都具有专一性,但不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同,A错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断裂,而DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成,将DNA片段连接起来,B正确；用限制酶酶切获得一个外源基因时产生2个切口,有4个磷酸二酯键被断开,C错误；DNA连接酶的功能是将两个DNA片段连接起来,将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构的是DNA聚合酶,D错误。
3.答案：C
解析：A、BamH I和Sau3A I两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A错误；
B、分析表格可知，BamH I的识别序列为GGATCC，Sau3A I的识别序列为GATC，由此可知，能被BamH Ⅰ识别的序列中包含了被Sau3A I识别的序列，所以能被BamH Ⅰ识别的序列也一定能被Sau3A I识别，但能被Sau3A I识别的DNA位点不一定能被BamH I识别，B错误；
C、分析题意，某DNA分子经Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段，由此可知，该DNA分子上有2个BamH Ⅰ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点，C正确；
D、该DNA分子上有4个Sau3A I的酶切位点，有2个BamH I的酶切位点，但是BamH I识别序列中包含Sau3A I的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。
故选C。
4.答案：C
解析：由图可以看出Bt毒蛋白基因上边那条链的3'端序列为3'-CGCCTA-5',则PCR扩增时对应引物为5'-GCGGAT-3',下边那条链的3'端序列为3'-GATGAC-5',则PCR扩增时对应的引物为5'-CTACTG-3',所以用PCR扩增B毒蛋白基因时,可选择5'-CTACTG-3'和5'-GCGGAT-3'组合的引物,A正确；由图可知,目的基因插入质粒会破坏氨苄青霉素抗性基因,但不会破坏潮霉素抗性基因,重组质粒导入农杆菌中,农杆菌可在添加潮霉素的培养基中生长,但不能在添加氨苄青霉素的培养基中生长,在选择培养基A上1~5菌落均生长,说明选择培养基A中加入的是潮霉素,在选择培养基B上有部分菌落(2、4菌落)未生长,说明选择培养基B中添加的是氨苄青霉素,B正确；由选择培养基B可知,菌落2和4死亡,说明其被插入了毒蛋白基因,破坏了氨苄青霉素抗性基因,从而无法在含氨苄青霉素的培养基中生长,故含有B毒蛋白基因的菌落是2和4,C错误；根据抗原和抗体特异性结合的原理,可用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出B毒蛋白,D正确。
5.答案：D
解析：从PCR扩增到pAH162-sacB构建完成共需耐高温的DNA聚合酶、BamH I、EcoR I、DNA连接酶4种酶的参与；导入重组质粒前，需用处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；为保证正向连接，PCR时应在sacB基因上游引物的5'端添加BamH I识别序列；具有双重选择系统的大肠杆菌在含四环素的培养基中生长，在含蔗糖的培养基中不生长。
6.答案：D
解析： DNA可与Na+形成DNA钠盐，DNA钠盐不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质能溶于酒精，可用酒精将DNA与蛋白质等初步分离，加入溶液甲后获得白色丝状物主要为DNA，故溶液甲为体积分数为95%的冷酒精，A错误；溶液乙为二苯胺试剂，使用时需要进行沸水浴加热，B错误；猪为哺乳动物，其成熟的红细胞无细胞核，DNA含量少，故猪血不适合用作此实验的材料，C错误；粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖和RNA等杂质，D正确。
7.答案：B
解析：限制酶主要存在于原核细胞中,只能识别双链DNA分子上的核苷酸序列,A错误;DNA连接酶不能识别DNA上的核苷酸序列,DNA连接酶作用过程中,具有黏性末端的两个DNA片段的黏性末端会自发互补配对,B正确;在DNA复制过程中,解旋酶可破坏氢键,使DNA双螺旋解开,C错误;成熟mRNA经逆转录酶催化形成的DNA缺少启动子和终止子,不能直接转录翻译合成蛋白质,D错误。
8.答案：B
解析：第一轮PCR中,需要先用诱变引物合成一条链,再用这条链合成互补链(第二轮PCR的大引物),即至少需要2个循环才能获得相应的大引物,A正确；除第一轮PCR产物的一条链用作第二轮PCR的大引物外,第二轮PCR还需加入另一种常规引物,以便进行另一条链的延伸,B错误；若要使得扩增的定点诱变产物可以表达出蛋白质,则扩增的定点诱变产物需连接启动子和终止子等结构,以便进行基因的转录和翻译,C正确；两轮PCR所用的引物不同,为了使两轮PCR在同一支试管中进行,引物设计时应考虑不同的复性温度,第二轮PCR中有大引物.所以复性温度应该比第一轮的高,D正确。
9.答案：C
解析：利用PCR扩增sGFP时，高温可将DNA双链打开，A项错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入到构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达，B项错误；先将目的基因导入农杆菌，再将转化后的农杆菌放置于含有潮霉素的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌，C项正确；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度，筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌，绿色荧光可以直接观察到，不用通过抗原—抗体杂交技术，D项错误。
10.答案：A
解析：
由图分析可知,构建重组质粒时需要的限制酶有Pst I、Xho I、Hind Ⅲ(或BamH I)和EcoR I,A错误;由题图可知,在构建重组质粒时,质粒中的pst Ⅱ基因保留下来作为标记基因,GUS基因被切除,因此在培养基中添加卡那霉素可初步筛选导入重组质粒的农杆菌,B正确;构建重组质粒时,GUS基因被切除,无法使细胞中底物呈蓝色,呈现蓝色的组织说明细胞中含有GUS基因,则该细胞中导入的是不含目的基因的空白质粒,因此不能选择呈蓝色的愈伤组织进一步培养,C正确;启动子若为除草剂诱导型启动子,则在无除草剂的环境中A基因不表达,在有除草剂的环境中A基因可表达,将减少细胞物质和能量浪费,D正确。
11.答案：C
解析：培育转基因动物时，常用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中，A合理;我国利用花粉管通道法将抗虫基因导入棉花细胞中，培育了转基因抗虫棉，B合理；噬菌体是细菌病毒，不能侵染植物，所以不能利用含目的基因的噬菌体侵染玉米细胞来培育转基因玉米，C不合理；用Ca2+处理大肠杆菌，可使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，D合理。
12.答案：B
解析：用限制酶和DNA连接酶处理含目的基因的DNA片段和Ti质粒时,涉及DNA片段之间的磷酸二酯键的断裂和形成,A正确;载体Ti质粒上的抗生素抗性基因通常作为对重组DNA分子鉴定和筛选的标记基因,B错误;基因表达载体组件中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录,C正确;农杆菌中的T-DNA可转移到受体细胞内并整合到受体细胞染色体的DNA上,将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,可以将含有目的基因的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,D正确。
13.答案：C
解析：A、检测到受体细胞含有目的基因的表达产物才能标志基因工程操作的成功，A错误；
B、目的基因是否转录和翻译的检测方法依次是分子杂交技术、抗原抗体杂交技术，B错误；
C、可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质，C正确；
D、抗虫、抗病鉴定可用于确定转基因生物是否具备相关性状，属于个体水平的检测，D错误。
故选C。
14.答案：D
解析：基因表达载体构建过程需要限制酶(切割含目的基因的DNA片段和载体)、DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体)等,A正确；图示基因表达载体包括目的基因、标记基因,此外还应具有启动子、终止子、复制原点等,B正确；根据目的基因序列设计引物,以获得的基因表达载体为模板进行PCR,对PCR产物进行电泳鉴定,从而可将含有目的基因片段的基因表达载体筛选出来,C正确;据图可知,构建过程中四环素抗性基因被破坏,故可用氨苄青霉素抗性基因作标记基因,但该基因表达载体需要在受体细胞中才能大量复制并表达,D错误。
15.答案：（1）逆转录；1和3；5'
（2）DNEGFR蛋白在细胞中的位置；下游；若EGFP序列位于DNEGFR序列上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置
（3）卡那霉素；获得更多的重组质粒
（4）95%空气和5%的CO2;细胞膜
解析：（1）通过RNA获得cDNA，需用逆转录酶处理。图2中过程②的目的是获得只控制合成信号肽段、胞外区、跨膜区三个部分的DNEGFRcDNA，因此应选择图1中的引物1和引物3进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物5'端加入使用的限制酶的识别序列。
（2）图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，使得EGFP和DNEGFR同时表达，即以绿色荧光蛋白的位置来确定DNEGFR蛋白在细胞中的位置。若EGFP序列在DNEGFR序列的上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置。
（3）过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌与重组质粒混匀，培养在含有卡那霉素的培养基上。由图2可知，进行过程④和过程⑤的目的是获得更多的重组质粒。
（4）过程⑥是对转染后的动物细胞进行培养，此过程通常需要提供的气体环境为95%空气（满足细胞代谢对氧气的需求）和5%的CO2（维持培养液的pH）。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时，荧光应主要分布在细胞膜部位。
16.答案：（1）卡那霉素抗性基因可用于筛选成功转化的农杆菌；潮霉素抗性基因可用于筛选成功转化的植物细胞潮霉素抗性基因的编码链是b链，WRK10基因的编码链是a链
（2）小带
（3）红光；W12；与MYC抗体结合，便于对WRK10蛋白的表达进行检测、示踪
解析：（1）农杆菌转化法培育转基因植物的过程首先是构建可表达WRK10-MYC融合蛋白的重组Ti质粒，将其导入农杆菌细胞中，然后用含有重组Ti质粒的农杆菌去侵染植物细胞，筛选成功转化的植物细胞并培育出转基因植株。分析图1，卡那霉素抗性基因Kan位于T-DNA外部，说明其位于重组Ti质粒上，卡那霉素加入培养基中用于筛选成功导入Ti质粒的农杆菌。然后用成功转化的农杆菌去侵染植物细胞，将T-DNA整合到植物细胞染色体的DNA上，从图中分析，潮霉素抗性基因Hyg位于T-DNA中，可以和目的基因一同整合到植物细胞的DNA上，因此培养基中加入潮霉素可用于筛选成功导入了目的基因的植物细胞。基因转录的方向是5'→3'，而启动子的方向与对应基因转录的方向一致，故P1和P2方向不同的原因是潮霉素抗性基因的编码链是b链（或Hyg基因所对应的编码链是b链），WRK10基因的编码链是a链。
（2）分析图1可知，BP位点在T-DNA片段上，又因T-DNA插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，故纯合转基因植株PCR检测结果为BP和RP扩增的小带。
（3）分析图3，红光处理下的W12区段中MYC抗体阳性组PIF4基因表达量最高，说明WRK10蛋白（转录因子）在红光条件下与PIF4基因启动子的W12区段结合，从而激活该基因的表达。MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是与MYC抗体结合，便于对WRK10蛋白的表达进行检测、示踪。

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