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基因表达载体的构建
获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
基因表达载体的构建
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
基因表达载体的作用：
① 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
② 使目的基因能够表达和发挥作用。
☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
基因表达载体的构建
使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
黏
黏
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
病毒介导法
显微注射法
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
将目的基因导入受体细胞
资料卡
花粉管通道法
花粉管通道法：在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞
资料卡
农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
②原理：
将目的基因导入受体细胞
转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
将目的基因导入受体细胞
例1.该过程经过____次拼接、____次导入？
(1)第一次拼接
___________________________
(2)第二次拼接
___________________________
___________________________
(3)第一次导入
___________________________
(4)第二次导入
___________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
将目的基因导入受体细胞
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
资料卡
Ca2+处理法
微生物（常用大肠杆菌）
将目的基因导入受体细胞
资料卡
显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。
将目的基因注射到动物受精卵中
显微注射
将目的基因导入受体细胞
资料卡
病毒介导法
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
将目的基因导入受体细胞
腺病毒载体新冠疫苗的制备
将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。
接种疫苗，责无旁贷！
将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因
是否转录
是否翻译
鉴定:
个体生物学水平鉴定
1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
方法1:
DNA分子杂交
过程:
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。
（一）检测
基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。
　 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
提示：
①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；
②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
目的基因的检测与鉴定
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
DNA分子杂交技术
DNA分子杂交(Sorthern Blot)流程图
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
方法2：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
目的基因的检测与鉴定
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
提取RNA
转基因生物
标记的基因探针
方法1：PCR扩增
方法2：RNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
(Western Blot)流程图
目的基因的检测与鉴定
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR、核酸分子杂交技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
检测内容及方法
小结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
1.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA的复制需要引物
3.设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
4.需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链DNA数量的增多而被消耗
5.PCR扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的核苷酸序列设计的
6.两引物间固定长度(等长)的DNA序列在PCR扩增3次后首先出现
7.复制方向:是沿子链5’→3’，从引物的3’端延伸子链
8.如果需要在引物上加限制酶的识别序列：需要在引物的5’加
9.在引物的5’端设计两种限制酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向正确连接
10.如果引物中GC含量较高，可适当提高退火温度
11.设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物
12.设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率
13.引物设计不能太短：防止非目的基因的获得
14.退火温度过高，得不到产物的原因：引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）
15.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多
16.变性温度过低会导致双链不能充分解开；
17.退火温度过高会导致引物不能充分与模板链结合，导致目标产物的量减少
引物的设计

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