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(共33张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
一、选择培养基
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
从生物与环境的关系上分析，为什么科学家会想到去热泉中寻找栖热菌？
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2.筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
一、选择培养基
实验室筛选微生物的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度和PH值等），同时抑制或阻止其它微生物的生长
筛选方法：
用选择培养基筛选
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
3.选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤加多环芳烃（石油主要成分）为唯一碳源
能消除石油污染的微生物
一、选择培养基
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法：必须要对土样充分稀释后，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
1.微生物选择培养获取纯培养物的方法
优点：分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
缺点：操作步骤繁琐，容易被杂菌污染
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
稀释涂布平板法的操作过程
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
②取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
2.稀释涂布平板法的操作过程
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
稀释涂布平板法的操作过程
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
缺点：统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
②计数原则
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
③计算公式：每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
例题1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
某同学在对土壤中高效降解化合物A的细菌进行分离计数时，在3个平板培养基上分别接种稀释倍数为10６的菌液分别为155,160,177个，则每毫升原菌液中上述分解化合物Ａ的细菌的数量约为 。
1.64X109
不能区分死菌与活菌；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
三、微生物的数量测定
2.直接计数 —显微镜直接计数法
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
2.实验设计
（1）土壤取样
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
到什么地方去取土？
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
（2）培养基的制备
②配方：
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
碳源和氮源分别是什么？
从物理性质上看，属于 培养基？
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
（3）样品的稀释
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
2.实验设计
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
稀释涂布平板法的操作过程
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
②取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
2.实验设计
（4）稀释涂布平板法接种
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
稀释涂布平板法的操作过程
1、每一稀释度下至少要涂布 个平板
2、如何判断制作的培养基是否被污染？
3、如何判断选择培养基是否必挥了筛选作用？
3
将未接种的空白培养基在适宜温度下培养，看是否有菌落生长
取一个牛肉膏蛋白胨培养基接种同样菌液作对照，若选则培养基上长出的菌落数比牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落少，则说明选择培养基发挥了筛选作用。
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如 等。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果，防止 。
（5）微生物的培养与观察
2.实验设计
因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
菌落数目稳定
形状、大小和颜色
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验流程
土壤取样
样品的稀释与涂布平板
培养与观察
计数
配制培养基
①实验组：1—3组接种的选择培养基
第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基
②对照组：第5组不涂布稀释液的选择培养基
第6组牛肉膏蛋白胨培养基
③实验结果：前3组实验组分离得到；
第4组得到多种菌落；
第5,6组正常情况下无菌落。
3.注意事项
用以分离并计数能分解尿素的细菌
用以判断选择培养基是否具有选择作用
用以验证培养基中是否含有杂菌
用以验证培养基中是否含有杂菌
单菌落
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①无菌操作
②做好标记
③规划时间
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
如
在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
4.操作提示
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
思考2：在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
思考1：样品的稀释操作是否成功？
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
Ⅰ.系列稀释操作
a.编号为101～106试管中分别盛有 水。
b.用移液管吸取 培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。
c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
9 mL无菌
1 mL
知识巩固
例题2.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是____________________________________________________________ 。
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果重复性差
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
pH升高，酚红指示剂变红
补充拓展：
脲酶阴性
脲酶阳性
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法：
是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
课题延伸
选择培养基
特殊成分
加入某种化学物质
目的
抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长
用途
举例
鉴别培养基
加入某种指示剂
发生特定颜色反应
分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌
伊红—美蓝培养基
鉴定大肠杆菌
选择培养基和鉴别培养基
课题延伸
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
土壤中纤维素分解菌的分离
原理：刚果红是一种染料，能与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不能与纤维素水解生成的纤维二糖和葡糖糖发生这种反应。当我们在含纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物，而当纤维素被 纤维素分解菌分解后，红色复合物无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。
方法：刚果红染色法
实验方案：
土壤取样
样品的稀释
将样品涂布在含有刚果红的固体培养基上
挑选产生透明圈的菌落
选择培养
取样：富含纤维素的环境中
目的：增大目的菌株的浓度
培养基：液体
功能：选择培养基
培养：振荡摇匀
谢谢

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