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第3章 第1节
人教版 选择性必修3
第三章 基因工程
第3章 基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
（1）原理：
（2）操作水平：
（3）操作环境：
（4）操作对象：
（5）结果：
基因重组。
分子水平。
生物体外。
基因。
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
转基因抗虫水稻（绿色植株）与对照（被害虫侵害的黄色植株）
转基因 抗病毒甜椒
转生长激素基因的鲤鱼（下）与非转基因鲤鱼（上）
我国自主研发的抗虫棉（左）与普通棉花（右）比较
必修二第3章第4节
转基因抗虫棉
普通棉花
转基因抗虫棉为什么能抗虫？
抗虫棉
转基因抗虫棉为什么能抗虫？
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
Bt基因
转录
翻译
mRNA
苏云金杆菌
取出？
转移？
怎么实现这一操作过程？
转基因抗虫棉为什么能抗虫？
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
Bt基因
转录
翻译
mRNA
苏云金杆菌
取出？
转移？
怎么实现这一操作过程？
首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出？
转移？
怎么实现这一操作过程？
首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；
然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。
--ATGCATGCAT…… CCATGCTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GGTACGATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
…… GCAT…… CCATGCTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCA …… CCACATG ……
…… CGTA ……GGTACGATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……GTACGT …… GGTGTAC ……
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
你觉得要把Bt基因导入棉花细胞应该怎么操作？
“分子手术刀”
“分子缝合针”
实际操作和这一样都在体外进行吗？
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出？
转移？
实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即
准确切割DNA分子的“分子手术刀”、
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。
“分子缝合针”
“分子运输车”
“分子手术刀”
总结：
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
① DNA是生物的主要遗传物质
② DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共用一套遗传密码
思考讨论
01
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
限制性内切核酸酶
（限制酶）
1.简称：
限制酶
2.来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
EcoRⅠ
Escherichia coli
属名(大写)
种名 (小写)
属名的头一个字母
种加词的头两个字母
大肠杆菌的R型菌株分离来的
R型菌株中分离出来的第一种限制酶
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
SmaⅠ
Serratia marcescens
属名(大写)
种名 (小写)
属名的头一个字母
种加词的头两个字母
粘质沙雷氏菌中分离出来的第一种限制酶
粘质沙雷氏菌 又称灵杆菌
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
你知道限制酶是如何精确切割的吗？（限制酶的作用）
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
T
T
A
A
C
G
C
G
DNA 平面结构
DNA 双螺旋结构
T
T
A
A
C
G
C
G
1’
2’
3’
4’
5’
O
1’
2’
3’
4’
5’
O
5’
3’
3’
5’
磷酸二酯键
T
T
A
A
C
G
C
G
1’
2’
3’
4’
5’
O
1’
2’
3’
4’
5’
O
5’
3’
3’
5’
磷酸二酯键
具体结构
限制酶切割磷酸二酯键
限制酶切割磷酸二酯键
T
T
A
A
C
G
C
G
1’
2’
3’
4’
5’
O
1’
2’
3’
4’
5’
O
5’
3’
3’
5’
磷酸二酯键
具体结构
限制酶切割磷酸二酯键
限制酶切割磷酸二酯键
脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架是一样的
简化
磷酸二酯键
T
A
T
A
C
G
C
G
5’
3’
3’
5’
T
T
A
A
C
G
C
G
1’
2’
3’
4’
5’
O
1’
2’
3’
4’
5’
O
5’
3’
3’
5’
磷酸二酯键
脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架是一样的
简化
磷酸二酯键
简化
—AGTC—
—TCAG—
5’
3’
3’
5’
磷酸二酯键
5’
3’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为
从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键
你知道限制酶是如何精确切割的吗？
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，
并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
第一步
第二步
中轴线
5’
3’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为
从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键
你知道限制酶是如何精确切割的吗？
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，
并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
第一步
第二步
3’
5’
5’
3’
黏性末端
黏性末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；
注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！
5’
3’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为
从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键
中轴线
5’
3’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
例如，SmaⅠ限制酶的识别序列为
从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键
平末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
3’
5’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
一些常用的限制酶识别序列与切割产生的末端类型（拓展）
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
限制酶切割特定核苷酸序列的特定部位的磷酸二酯键怎么应用呢？
--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
苏-基因2
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
3’
5’
5’
3’
可以用EcoRⅠ限制酶将Bt基因从DNA片段中切割下来！
你知道切割结果是怎样的？
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
苏-基因2
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
3’
5’
5’
3’
一
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
苏-基因2
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
02
DNA连接酶 — “分子缝合针”
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
…… TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG ……
…… AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC ……
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
它们具有相同的黏性末端!
5’
3’
3’
5’
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
磷酸二酯键形成
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
从大肠杆菌（Escherichia coli）
中分离得到的
从T4噬菌体中分离出来的
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
两种都可以
但连接平末端的效率相对较低
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
A1
A1
A1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A1
A1
B2
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
……会出现非常多种可能
怎么解决这个问题？
A2
还有可能出现环化等
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
DNA聚合酶:
将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上
温故而知新：
还记得DNA复制的过程吗？
1）解旋
在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。
解旋酶
ATP
DNA复制过程:
2）合成引物（补充）
在引物酶的作用下，产生一小段RNA作为引物,后期引物会被切除
引物酶
引物
5’
3’
引物的作用简单理解就是引出DNA聚合酶，因为DNA聚合酶必须识别3’端才能结合上去。
3）合成子链
DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
模板
模板
DNA聚合酶
5’
3’
子链延伸方向
子链延伸方向
两条子链延伸方向相反，但都是从5’→3’
随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。
子链
母链
母链
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
子链
4）重新螺旋
每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
小结：几种相关酶的比较
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
(2)作用不同：
拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。
(1)分子量不同：
拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
（4）易分离，对受体细胞无害。
在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不完全具备对载体的要求，例如缺少合适的限制酶切点(如限制酶切点在标记基因内)、缺少启动子和终止子等。因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。现在常用的质粒，都是早期利用天然质粒经历多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作为标记基因，便于筛选转化成功的细菌)、添加 MCS(多克隆位点)区域等。所谓添加MCS，是质粒中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点。有时为了提高转录效率，还会插入增强子；也有可能需要剔除对受体细胞有害的基因等。
天然质粒为什么要经过人工改造才能被用作载体？（了解）
载体都是质粒吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
载体种类
质粒
动植物病毒
噬菌体
一种常用载体,大多数质粒的受体细胞是细菌。
受体细胞是细菌
受体细胞是动植物细胞
人工改造
“分子缝合针”
“分子运输车”
“分子手术刀”
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
总结：
限制酶
DNA连接酶
载体
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？

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