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第九单元　生物技术与工程
第53讲　基因工程
复习目标　1.从结构与功能观角度理解基因工程的原理，构建基因工程操作流程图； 2.通过“DNA 的粗提取与鉴定”实验和DNA片段的扩增及电泳鉴定培养实验与探究能力； 3.对比分析基因工程的三种操作工具，明确各自的应用及特点。
考点1　重组DNA技术的基本工具
A基础知识重点疑难
1. 基因工程概念
别名 技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 水平
结果 创造出更符合人们需要的新的 和
重组DNA　
DNA分子　
生物类型　
生物产品　
提醒　基因工程的理论基础
基因拼 接的理 论基础 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
外源基 因在受 体细胞 内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界共用一套遗传密码
2. 重组DNA技术的基本工具
笔记：工具≠工具酶；工具有3种，工具酶有2种
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
笔记：“分子手术刀”
来源 主要存在于原核生物中
特点 识别双链DNA分子的特定 ，并使每一条链中特定部位的 断开
作用 结果 产生 或平末端
提醒　(1)将一个基因从DNA分子上切割下来通常需要切两处，同时产生四个黏性末端 或平末端。
(2)限制酶主要来源于原核生物，不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在 该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
核苷酸序列　
磷酸
二酯键　
黏性末端　
(2)DNA连接酶
种 类 E. coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来 源 T4噬菌体
作 用
及 特 点 都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 ，但 E. coli DNA连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶
大肠杆菌
磷酸二酯键　
笔记：“分子缝合针”
提醒　(1)DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸 连接到已有的DNA片段上。
(2)DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较
名称 作用部位 作用底物 形成产物
限制酶 磷酸二酯键 DNA分子 带黏性末端或平末端 的DNA片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA分子 重组DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA分子 游离的脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA分子 脱氧核苷酸长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 单链RNA分子
(3)载体
笔记：“分子运输车”
种 类 质粒(常用载体，环状双链DNA分子)、 、动植物病毒等
特 点 ①能自我复制，或整合到 上同步复制
②有一个至多个 ，便于限制酶识别切割
③常有特殊的 基因　，便于重组DNA分子的筛选
作 用 携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行复制和表达
笔记：常见的标记基因：如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基 因、绿色荧光蛋白基因等
噬菌体　
受体DNA　
限制酶切割位点　
标记
3. 限制酶的选择原则
甲　 乙
(1)不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结 构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中 PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的 基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)要保证切割位点在质粒的启动子和终止子之间。
4. 标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
B拆解真题情境推理
[情境推理]
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别 序列和切点是 ，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过 程。 　　。
提示：(1)限制性内切核酸酶Ⅰ：
限制性内切核酸酶Ⅱ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。 　　。
提示：(2)用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限 制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ切割的位点，故使用限制酶Ⅱ时， 可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质 粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒
C升华思维实战演练
基因工程的基本工具
1. (2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将 目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建 重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
　　
C
解析：E. coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到 的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏 性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表 达载体的构建方案最合理且高效，C正确；酶4切割质粒，会破坏质粒上的抗生素抗性 基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
解题方法
限制酶的几点认识误区
（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（2）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或 平末端。
（3）原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA分子中不存在该酶的识别 序列或识别序列已被修饰。
（4）获取目的基因和切割载体时一般应使用同种限制酶，目的是产生相同的末端。
（5）限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线 处切开形成的是平末端。
2. (2025·河北石家庄期末)研究人员利用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培 育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株。主要过程如图(图中a链和b链分别是相应基因转录 的模板链)。回答相关问题：
(1)第①步：PCR扩增sGFP基因。PCR扩增sGFP的原理是 ；图 中b链的碱基序列黏性末端(5‘→3’)为 。
解析：(1)PCR扩增sGFP的原理是DNA半保留复制。由图可知，b链5‘端是利用 HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindⅢ识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端 碱基序列(5’→3')为AGCT。
DNA半保留复制　
AGCT　
解析：(2)过程②为将目的基因与载体结合，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是 RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动 子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在 大丽轮枝菌细胞中表达。
DNA连接酶　
构巢曲霉　
保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表
达　
解析：(3)转化后的农杆菌中含有潮霉素抗性基因，因此放置于含有潮霉素的培养基中 筛选；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌细 胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
潮霉素　
(绿
色)荧光(强度)　
考点2　基因工程的基本操作程序
A基础知识重点疑难
1. 目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
②筛选目的基因的方法：从相关的已知 清晰的基因中进行筛选是较为 有效的方法之一。
笔记：2023山东卷T25：综合考查PCR过程中的引物选择、蛋白质表达及表达水平检 测等
2023江苏卷T22：跨章节创新考查微生物培养与引物选择等
受体细胞性状　
预期
表达产物　
编码蛋白质　
结构和功能　
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR含义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因 的核苷酸序列进行大量复制的技术
PCR原理
要 求 模板 目的基因的两条链
原料 4种脱氧核苷酸
酶 耐高温的
引 物① 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链
在一定的缓冲液中进行；需要控制温度的变化
DNA半保留复制
DNA聚合酶　
核
酸　
PC R 反 应 过 程 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链②
复性 温度下降到 左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合
50 ℃　
碱基互补配对　
端
PC R 反 应 过 程 延伸 72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 作用下，从引物3'端开始进行互补链的合成
扩增方向 　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从已有片段的 3‘端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的 ’ 延伸　③
耐高温的DNA聚合
酶　
5端向
3'端
方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)
结果 短时间内大量扩增目的基因
产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳
笔记：①引物的作用，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA链，同时限定了 复制区域　②无需解旋酶，高温可使双 链 DNA解聚为单链　③PCR过程中，形成子 链的个数与消耗引物的个数相同 　
提醒　(1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既 可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的 合成起点，只能结合在母链的3‘端，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧 核苷酸。
(3)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均 无法获得PCR产物。
(4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要 添加Mg2＋。
2. 基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的 基因能够表达和发挥作用。
笔记：2024新课标卷T35：结合生产情境考查酶切及引物相关问题
2024山东卷T25：结合多个图示考查基因工程的基本操作程序中有关限制酶选择等(形 式创新)
(2)基因表达载体的构建
基因表达载体的组成及作用 构建过程
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 位于基因的上游 位于基因的下游 位于mRNA首端 位于mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(通常不编码氨基酸)
3. 将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达其遗传特性的 过程。
(2)常用的转化方法
受体细胞种类 植物细胞
常用
方法 花粉管
通道法 农杆菌转化法
转化过程 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶 液直接注入子房中
②植物受粉后，剪去柱头，将DNA溶液 滴在花柱切面上，使目的基因借助花粉 管通道进入胚囊 农杆菌细胞内的Ti质粒 ②上的T－DNA可携带 目的基因整合到受体细 胞的染色体DNA上
动物细胞 原核①细胞(大肠杆菌)
显微注射法 Ca2＋处理法
将含有目的基因的表达载体提 纯→取受精卵→显微注射→受 精卵移植→获得具有新性状的 动物 用Ca2＋处理受体细胞→使细胞处于一种能吸收周围 环境中DNA分子的生理状态→将重组表达载体DNA 分子与细胞混合→细胞吸收DNA分子→表达特定性 状
笔记：①微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，获 得的目的基因的产物多　②是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核 细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子 　
提醒　(1)农杆菌的特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染 能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到 被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体 DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非 人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体 DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4. 目的基因的检测与鉴定
笔记：2024河北卷T22：跨模块考查限制酶选择、目的基因的导入方法及免疫调节等
检测 水平 检测目的 检测方法
分子 水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
个体 水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如 　抗虫、抗病的
PCR等技术
抗原—抗体杂交
接种实
验
笔记：如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了植物抗虫特性以 及抗性的程度
5. 构建基因表达载体时“酶切”四要素
酶切的目的是正确连接，所以一要切出相同的黏性末端，二要防止单酶切目的基因自 身环化，三要防止破坏目的基因或标记基因，四要保证切割位点在质粒的启动子和终 止子之间。
6. PCR中引物的设计要求
引物的 作用 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA链，同时限定了复制区域
设计两 种引物 的原因 基因的两条链都作为模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3'端延 伸子链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增
引物
长度 用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。若引物过短，则引物与模板 链结合的特异性较差
其他
要求 ①每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物二聚体产 生
引物中 设计限 制酶的 酶切位 点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的 酶切位点，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，主要目的是保证目的 基因与载体的正向连接
7. 图解法记忆目的基因的检测与鉴定
×　
√　
×　
√　
[情境推理]
1. (2024·安徽卷节选)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因 是 　　。
提示：在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会 变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
2. 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环 需要消耗多少个引物数？ 　　。
提示：经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为 2n个
3. (2024·全国甲卷节选)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受 态，感受态细胞的特点是 　　。
提示：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
4. (2023·海南卷节选)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞 时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 　　。
提示：农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞 中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
5. (2018·江苏卷节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的 　　端加 上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的 是 　　。
提示：5'　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
A. 增加模板DNA的量
B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间
D. 提高复性的温度
D
解析：PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不 会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚 为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成 新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选 择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
解题方法
扩增片段与预期结果不符的原因
（1）未出现扩增条带的可能原因
（2）出现非特异性扩增条带的可能原因
2. (2024·浙江6月选考)阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编 码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患 者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目 的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行 PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
A. F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
D
解析：根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性 扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不 能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增目的1条带， F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； 根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条， 说明R2引物无法特异性的扩增目的片段，D错误。
A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因GadB
B. E. coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
A
C. E. coli A和E. coli B都能高效降解γ－氨基丁酸
D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
解析：题意显示，研究人员采用题图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(GadB) 导入生产菌株E. coli A，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因GadB，A正确； 题意显示，用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的 重要途径之一，E. coli B中能表达L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E. coli B发酵 生产γ－氨基丁酸，该过程中L－谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E. coli A中没有L －谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L－谷氨酸，而E. coli B中含有该酶的基因， 因而能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点，因 而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。
4. (2025·八省联考四川卷)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底 物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y 基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－ GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能， 实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有 个氨基酸。通过PCR分别 扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有 (填标号)。
a.模板 b.引物
c.DNA聚合酶 d.反应缓冲液
解析：(1)基因片段上的碱基数目∶转录出的mRNA上的碱基数目∶翻译出的蛋白质(多 肽链)中氨基酸数目＝6∶3∶1，不考虑终止密码子，则该蛋白质最多由735÷3＝245个 氨基酸组成。PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩 增目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板(待扩增的DNA片段)、引物。故 选a、b。
245　
a、b　
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除， 理由是 。
解析：(2)从构建好的重组质粒上看，GFP基因位于目的基因下游，若构建Y基因与 GFP基因的融合基因时应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，否则核糖体移动到 终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能被翻译出来。
核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来　
解析：(3)据图步骤一中的Y基因信息可知，Y基因结构内部含有EcoR Ⅰ限制酶的酶切 位点，所以在构建重组基因表达载体时不能选择EcoR Ⅰ限制酶，否则Y基因结构会被 破坏。
Y基因结构内部含有EcoR Ⅰ限制酶的酶切位
点，Y基因结构会被EcoR Ⅰ限制酶破坏　
解析：(4)若Y－GFP蛋白有激酶活性，则A蛋白会被磷酸化，而磷酸化的A蛋白可被磷 酸化抗体特异性识别，所以可以用磷酸化抗体检测是否存在磷酸化的A蛋白。根据电 泳结果可知若后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是④泳道。Y －GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光 的Y－GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。
④　
磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和
ATP同时存在　
分析A
蛋白被磷酸化的水平　
解析：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体 后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
重组乙肝疫苗成分为
蛋白质，无法独立在宿主体内增殖　
解析：(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。RNA聚合酶结合目的 基因启动子并驱动转录。
解析：(3)检测目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞核染色体DNA进行DNA分 子杂交。基因探针是一段带有检测标记，与目的基因互补的核酸序列。
筛选　
RNA聚合
酶　
核染色体DNA　
被标
记的目的基因的单链DNA片段　
解析：(4)目的基因能否在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴 定才知道。翻译检测：提取受体中的蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检 测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白
质　
解题方法
（1）标记基因的常见类型及相应筛选方法
标记基因常见类型 筛选方法
标记基因为抗生素的抗性基因 基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体 细胞并表达后，可以使受体细胞表现出对相应抗 生素的抗性，在受体细胞的培养体系中加入致死 浓度的相应抗生素后，存活的便是转化成功的细 胞
标记基因为必需营养物质合成
基因 基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基 因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将 细胞在不含有此营养组分的培养基中培养，存活 的便是转化成功的细胞
标记基因常见类型 筛选方法
标记基因为报告基因[如绿色荧
光蛋白（GFP）基因 基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光 蛋白在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标 记基因的重组质粒导入细胞后，若细胞可发出绿 色荧光，则说明目的基因已成功导入
（2）对空质粒的筛选一—蓝白斑筛选法：载体上携带有抗生素抗性基因及LacZ基因。LacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。该载体上仅在LacZ基因中存在目的基因插入位点，若目
的基因插入LacZ基因，则LacZ基因失去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后，未导入质粒的菌株不能生长，白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌，呈现蓝色的菌落则是转入空质粒的大肠杆菌。
考点3　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
A基础知识重点疑难
1. DNA的粗提取与鉴定
(1)原理
DNA 酒精，某些蛋白质溶于酒 精 初步分离DNA和蛋白质
DNA能溶于物质的量浓度为 的NaCl溶液 溶解DNA
一定温度下，DNA遇 试剂呈现 蓝色 鉴定DNA
不溶于　
2 mol·L－1　
二苯胺　
(2)方法步骤
研磨 材料 新鲜洋葱①，切碎、加研磨液充分研磨②
获取含 DNA
的滤液 过滤(纱布)、提取 ；或离心取上清液
DNA 的析出 在上清液中加入体积分数为 预冷的酒精，静置后用玻璃棒沿 搅拌卷起白色丝状物，或离心取沉淀物
上清液　
95％　
一个方向
溶解 DNA 将丝状物或沉淀物溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中
DNA 的鉴定 在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5 min，溶液变成
笔记：①取材原则：DNA含量高，材料易得，便于提取
②目的是破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中
提醒　(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致 DNA分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无DNA)。
蓝色　
2. DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
PC R
原 理 DNA半保留复制
双链DNA 单链DNA
电 泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电 荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移 动，这个过程就是电泳
鉴 定 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 凝胶的浓度、DNA分子的 等有关
相反　
大小和构象　
(2)PCR实验操作步骤
加 样 用 按照配方或PCR试剂盒的说明书，向微量离心管中依次加入各 组分，盖严 的盖子
离 心 将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的
反 应 设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入 中进行反 应
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被 检测出来。
①成功扩增出DNA片段的判断依据是 。
②进行电泳鉴定的结果应该是 条条带。如图所示，该片段大小约为 bp。
微量移液器　
离心管　
底部　
PCR仪　
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带　
一　
750　
笔记：电泳结果初步分析：根据条带位置判断DNA分子大小；根据电泳条带判断限制 酶酶切位点数量
提醒　(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏 水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更 换，避免试剂的污染。
(3)电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速 率越快。
B拆解真题情境推理
[判断正误]
√　
√　
×　
√　
×　
×　
×　
×　
A. 整个提取过程中可以不使用离心机
B. 研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
解析：在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃ 的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清 液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入 烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加 入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样 才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变 蓝的干扰，D错误。
剖析题眼 找答案：DNA鉴定过程中需要 加热，DNA双螺旋结构会被破坏， 由以上可以推断C 。
沸水浴　
错误　
A. 琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物
B. 双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大
C. 凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测
D. 凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛选效应，来进行分离、 鉴定DNA分子的混合物，A正确；凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有 关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；凝胶制备中 加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用 于分离后DNA的检测，C、D正确。
溯源教材 找答案：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 的紫外灯下 被检测出来，由以上可以推断D 。
300 nm　
正确　第53讲　基因工程
复习目标　1.从结构与功能观角度理解基因工程的原理，构建基因工程操作流程图； 2.通过“DNA 的粗提取与鉴定”实验和DNA片段的扩增及电泳鉴定培养实验与探究能力； 3.对比分析基因工程的三种操作工具，明确各自的应用及特点。
@考点1　重组DNA技术的基本工具
考点1　重组DNA技术的基本工具
A基础知识重点疑难
1.基因工程概念
别名 　重组DNA　技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 　DNA分子　水平
结果 创造出更符合人们需要的新的　生物类型　和　生物产品　
提醒　基因工程的理论基础
基因拼接的理论基础 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 ②DNA分子都遵循碱基互补配对原则 ③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
外源基因在受体细胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码
2.重组DNA技术的基本工具
笔记：工具≠工具酶；工具有3种，工具酶有2种
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
笔记：“分子手术刀”
来源 主要存在于原核生物中
特点 识别双链DNA分子的特定　核苷酸序列　，并使每一条链中特定部位的　磷酸二酯键　断开
作用结果 产生　黏性末端　或平末端
提醒　(1)将一个基因从DNA分子上切割下来通常需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
(2)限制酶主要来源于原核生物，不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 　大肠杆菌　 T4噬菌体
作用 及特点 都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的　磷酸二酯键　，但E.coli DNA连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶
笔记：“分子缝合针”
提醒　(1)DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
(2)DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较
名称 作用部位 作用底物 形成产物
限制酶 磷酸二酯键 DNA分子 带黏性末端或平末端的DNA片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA分子 重组DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA分子 游离的脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA分子 脱氧核苷酸长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 单链RNA分子
(3)载体
笔记：“分子运输车”
种类 质粒(常用载体，环状双链DNA分子)、　噬菌体　、动植物病毒等
特点 ①能自我复制，或整合到　受体DNA　上同步复制 ②有一个至多个　限制酶切割位点　，便于限制酶识别切割 ③常有特殊的　标记基因　，便于重组DNA分子的筛选
作用 携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行复制和表达
笔记：常见的标记基因：如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因等
3.限制酶的选择原则
甲　乙
(1)不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)要保证切割位点在质粒的启动子和终止子之间。
4.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
B拆解真题情境推理
[情境推理]
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。　　。
提示：(1)限制性内切核酸酶Ⅰ：
限制性内切核酸酶Ⅱ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。　　。
提示：(2)用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ切割的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒
C升华思维实战演练
基因工程的基本工具
1.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
　　
　　
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　C　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
解析：E.coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；酶4切割质粒，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
解题方法
限制酶的几点认识误区
（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（2）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。
（3）原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。
（4）获取目的基因和切割载体时一般应使用同种限制酶，目的是产生相同的末端。
（5）限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。
2.(2025·河北石家庄期末)研究人员利用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育表达绿色荧光蛋白的转基因菌株。主要过程如图(图中a链和b链分别是相应基因转录的模板链)。回答相关问题：
(1)第①步：PCR扩增sGFP基因。PCR扩增sGFP的原理是　DNA半保留复制　；图中b链的碱基序列黏性末端(5‘→3’)为　AGCT　。
解析：(1)PCR扩增sGFP的原理是DNA半保留复制。由图可知，b链5‘端是利用HindⅢ切割形成的黏性末端，根据HindⅢ识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列(5’→3')为AGCT。
(2)第②步：目的基因与载体结合。②需要的工具酶是　DNA连接酶　，此时目的基因插入　构巢曲霉　启动子之后，目的是　保证sGFP基因可以在大丽轮枝菌细胞中表达　。
解析：(2)过程②为将目的基因与载体结合，需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP插入构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达。
(3)第③步：目的基因导入大丽轮枝菌。该过程需要先将目的基因导入农杆菌，而后将转化后的农杆菌放置于含有　潮霉素　的培养基上，筛选出含有目的基因的农杆菌。将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测　(绿色)荧光(强度)　，筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
解析：(3)转化后的农杆菌中含有潮霉素抗性基因，因此放置于含有潮霉素的培养基中筛选；转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌细胞中绿色荧光强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
@考点2　基因工程的基本操作程序
考点2　基因工程的基本操作程序
A基础知识重点疑难
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变　受体细胞性状　或获得　预期表达产物　等的基因。主要是指　编码蛋白质　的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的已知　结构和功能　清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
笔记：2023山东卷T25：综合考查PCR过程中的引物选择、蛋白质表达及表达水平检测等
2023江苏卷T22：跨章节创新考查微生物培养与引物选择等
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR含义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
PCR原理 　DNA半保留复制　
要求 模板 目的基因的两条链
原料 4种脱氧核苷酸
酶 耐高温的　DNA聚合酶　
引 物① 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链　核酸　
在一定的缓冲液中进行；需要控制温度的变化
PCR反应过程 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链②
复性 温度下降到　50 ℃　左右时，两种引物通过　碱基互补配对　与两条单链DNA结合
延伸 72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在　耐高温的DNA聚合酶　作用下，从引物3'端开始进行互补链的合成
扩增方向 　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从已有片段的3‘端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5’端向3'端延伸　③
方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)
结果 短时间内大量扩增目的基因
产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳
笔记：①引物的作用，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA链，同时限定了复制区域　②无需解旋酶，高温可使双 链 DNA解聚为单链　③PCR过程中，形成子链的个数与消耗引物的个数相同 　
提醒　(1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3‘端，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
(3)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
(4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
笔记：2024新课标卷T35：结合生产情境考查酶切及引物相关问题
2024山东卷T25：结合多个图示考查基因工程的基本操作程序中有关限制酶选择等(形式创新)
(2)基因表达载体的构建
基因表达载体的组成及作用 构建过程
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 位于基因的上游 位于基因的下游 位于mRNA首端 位于mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(通常不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达其遗传特性的过程。
(2)常用的转化方法
受体细胞种类 植物细胞
常用 方法 花粉管 通道法 农杆菌转化法
转化过程 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 ②植物受粉后，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌细胞内的Ti质粒②上的T－DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上
动物细胞 原核①细胞(大肠杆菌)
显微注射法 Ca2＋处理法
将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵移植→获得具有新性状的动物 用Ca2＋处理受体细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将重组表达载体DNA分子与细胞混合→细胞吸收DNA分子→表达特定性状
笔记：①微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，获得的目的基因的产物多　②是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子 　
提醒　(1)农杆菌的特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
笔记：2024河北卷T22：跨模块考查限制酶选择、目的基因的导入方法及免疫调节等
检测水平 检测目的 检测方法
分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 　PCR等技术　
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质 　抗原—抗体杂交　
个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如　抗虫、抗病的接种实验　
笔记：如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了植物抗虫特性以及抗性的程度
5.构建基因表达载体时“酶切”四要素
酶切的目的是正确连接，所以一要切出相同的黏性末端，二要防止单酶切目的基因自身环化，三要防止破坏目的基因或标记基因，四要保证切割位点在质粒的启动子和终止子之间。
6.PCR中引物的设计要求
引物的作用 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA链，同时限定了复制区域
设计两种引物的原因 基因的两条链都作为模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3'端延伸子链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增
引物 长度 用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。若引物过短，则引物与模板链结合的特异性较差
其他 要求 ①每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物二聚体产生
引物中设计限制酶的酶切位点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接
7.图解法记忆目的基因的检测与鉴定
B拆解真题情境推理
[判断正误]
1.(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(　×　)
2.(2024·河北卷)利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。(　√　)
3.(2022·辽宁卷改编)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(　×　)
4.(2021·湖北卷改编)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生。(　√　)
[情境推理]
1.(2024·安徽卷节选)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是　　。
提示：在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？　　。
提示：经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个
3.(2024·全国甲卷节选)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是　　。
提示：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
4.(2023·海南卷节选)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是　　。
提示：农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
5.(2018·江苏卷节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的　　端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是　　。
提示：5'　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
C升华思维实战演练
PCR技术及应用
1.(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　D　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
解析：PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
解题方法
扩增片段与预期结果不符的原因
（1）未出现扩增条带的可能原因
模板DNA含有杂蛋白或TagDNA聚合酶的抑制剂：TagDNA聚合酶失活；引物出现质量问题或浓度不合适;Mg浓度过低;变性温度低或变性时间短：目的序列变异;等等。
（2）出现非特异性扩增条带的可能原因
模板DNA出现污染：TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强（如与非目的序列有同源性）;Mg+浓度过高;复性时的温度过低;PCR循环次数过多;等等。
2.(2024·浙江6月选考)阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　D　)
A.F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B.F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C.F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段
解析：根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增目的1条带，F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的片段，D错误。
基因工程的操作程序
3.(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(GadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　A　)
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因GadB
B.E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
解析：题意显示，研究人员采用题图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(GadB)导入生产菌株E.coli A，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因GadB，A正确；题意显示，用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一，E.coli B中能表达L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸，该过程中L－谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coli A中没有L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L－谷氨酸，而E.coli B中含有该酶的基因，因而能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点，因而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。
4.(2025·八省联考四川卷)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有　245　个氨基酸。通过PCR分别扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有　a、b　(填标号)。
a.模板 b.引物
c.DNA聚合酶 d.反应缓冲液
解析：(1)基因片段上的碱基数目∶转录出的mRNA上的碱基数目∶翻译出的蛋白质(多肽链)中氨基酸数目＝6∶3∶1，不考虑终止密码子，则该蛋白质最多由735÷3＝245个氨基酸组成。PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩增目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板(待扩增的DNA片段)、引物。故选a、b。
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是　核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来　。
解析：(2)从构建好的重组质粒上看，GFP基因位于目的基因下游，若构建Y基因与GFP基因的融合基因时应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，否则核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能被翻译出来。
(3)据图步骤一分析，为确保Y－GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcoR Ⅰ限制酶，理由是　Y基因结构内部含有EcoR Ⅰ限制酶的酶切位点，Y基因结构会被EcoR Ⅰ限制酶破坏　。
解析：(3)据图步骤一中的Y基因信息可知，Y基因结构内部含有EcoR Ⅰ限制酶的酶切位点，所以在构建重组基因表达载体时不能选择EcoR Ⅰ限制酶，否则Y基因结构会被破坏。
(4)为检测Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别。若Y－GFP蛋白有激酶活性，则后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是　④　泳道(从泳道①④中选填序号)，从Y－GFP蛋白功能角度分析，理由是　磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和ATP同时存在　，利用表达的具有绿色荧光的Y－GFP蛋白还可开展的实验有　分析A蛋白被磷酸化的水平　(答出1个即可)。
解析：(4)若Y－GFP蛋白有激酶活性，则A蛋白会被磷酸化，而磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，所以可以用磷酸化抗体检测是否存在磷酸化的A蛋白。根据电泳结果可知若后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是④泳道。Y－GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光的Y－GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。
5.(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是　重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖　。
解析：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是　筛选　。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是　RNA聚合酶　。
解析：(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取　核染色体DNA　进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是　被标记的目的基因的单链DNA片段　。
解析：(3)检测目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞核染色体DNA进行DNA分子杂交。基因探针是一段带有检测标记，与目的基因互补的核酸序列。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。　通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质　。
解析：(4)目的基因能否在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才知道。翻译检测：提取受体中的蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
解题方法
（1）标记基因的常见类型及相应筛选方法
标记基因常见类型 筛选方法
标记基因为抗生素的抗性基因 基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体细胞并表达后，可以使受体细胞表现出对相应抗生素的抗性，在受体细胞的培养体系中加入致死浓度的相应抗生素后，存活的便是转化成功的细胞
标记基因为必需营养物质合成 基因 基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养，存活的便是转化成功的细胞
标记基因为报告基因[如绿色荧 光蛋白（GFP）基因 基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后，若细胞可发出绿色荧光，则说明目的基因已成功导入
@考点3　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
考点3　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
A基础知识重点疑难
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)原理
DNA　不溶于　酒精，某些蛋白质溶于酒精 初步分离DNA和蛋白质
DNA能溶于物质的量浓度为　2 mol·L－1　的NaCl溶液 溶解DNA
一定温度下，DNA遇　二苯胺　试剂呈现蓝色 鉴定DNA
(2)方法步骤
研磨材料 新鲜洋葱①，切碎、加研磨液充分研磨②
获取含DNA 的滤液 过滤(纱布)、提取　上清液　；或离心取上清液
DNA的析出 在上清液中加入体积分数为　95％　预冷的酒精，静置后用玻璃棒沿　一个方向　搅拌卷起白色丝状物，或离心取沉淀物
溶解DNA 将丝状物或沉淀物溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中
DNA的鉴定 在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5 min，溶液变成　蓝色　
笔记：①取材原则：DNA含量高，材料易得，便于提取
②目的是破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中
提醒　(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
PCR 原理 DNA半保留复制
双链DNA单链DNA
电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　相反　的电极移动，这个过程就是电泳
鉴定 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　大小和构象　等有关
(2)PCR实验操作步骤
加样 用　微量移液器　按照配方或PCR试剂盒的说明书，向微量离心管中依次加入各组分，盖严　离心管　的盖子
离心 将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的　底部　
反应 设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入　PCR仪　中进行反应
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
①成功扩增出DNA片段的判断依据是　可以在紫外灯下直接观察到DNA条带　。
②进行电泳鉴定的结果应该是　一　条条带。如图所示，该片段大小约为　750　 bp。
笔记：电泳结果初步分析：根据条带位置判断DNA分子大小；根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量
提醒　(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
(3)电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。
B拆解真题情境推理
[判断正误]
1.(2024·安徽卷)利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA。(　√　)
2.(2024·安徽卷)DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物。(　√　)
3.(2024·安徽卷)将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质。(　×　)
4.(2024·黑吉辽卷)琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小。(　√　)
5.(2024·黑吉辽卷)凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置。(　×　)
6.(2024·黑吉辽卷)在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(　×　)
7.(2024·黑吉辽卷)琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来。(　×　)
8.(2023·江苏卷)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(　×　)
C升华思维实战演练
DNA的粗提取与电泳鉴定
1.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　A　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
解析：在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
剖析题眼 找答案：DNA鉴定过程中需要　沸水浴　加热，DNA双螺旋结构会被破坏，由以上可以推断C　错误　。
2.(2025·山东青岛模拟)DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　B　)
A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物
B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大
C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测
D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛选效应，来进行分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C、D正确。
溯源教材 找答案：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为　300 nm　的紫外灯下被检测出来，由以上可以推断D　正确　。
提醒 完成限时跟踪检测(五十三)
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