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专题22 基因工程
考点1 重组DNA技术的基本工具
(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案 B 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,因此应更换为正常质粒DNA,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。
(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
答案 B由于引物只能引导子链从5'到3'合成,分析图中扩增获得的DNA片段可知,其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段左右侧的黏性末端可知,步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ,B错误;用步骤①的两种酶对载体进行酶切,至少切断2处,切割之后至少获得了2个片段,C正确;图中形成的是黏性末端,E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端,T4 DNA连接酶对平末端和黏性末端均可连接,D正确。
(2023辽宁,19,3分)(不定项)基质金属蛋白酶MMP2和MMP9是癌细胞转移的关键酶。MMP2和MMP9可以降解明胶,明胶可被某染液染成蓝色,因此可以利用含有明胶的凝胶电泳检测这两种酶在不同条件下的活性。据图分析,下列叙述正确的是(　　)
A.SDS可以提高MMP2和MMP9活性
B.10 ℃保温降低了MMP2和MMP9活性
C.缓冲液用于维持MMP2和MMP9活性
D.MMP2和MMP9降解明胶不具有专一性
答案B　由题意知,MMP2和MMP9能降解明胶,明胶可被某染液染成蓝色,所以白色条带越细,酶的分解能力越弱,与37 ℃保温+缓冲液组相比,SDS+37 ℃保温+缓冲液组MMP2和MMP9对应的白色条带变细,说明MMP2和MMP9活性降低,A错误;据图可知,10 ℃保温下,白色条带最细,说明MMP2和MMP9活性降低,B正确;缓冲液是为了维持电泳系统pH相对稳定,C错误;MMP2和MMP9降解明胶专一性的检测缺乏其他酶或底物的对照,不能证明有无专一性,D错误。
(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案　C　酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.coli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案　B　94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(　　)
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案　B　受精卵在体外培养时,由于不同发育阶段的胚胎细胞所需的环境有所不同,因此需要更换不同成分的培养液,A正确;进行胚胎移植的早期胚胎通常为发育到8细胞以上的胚胎,如早期囊胚,B错误;利用胚胎干细胞通过核移植等技术来获得转基因小鼠时,可在短时间内获得大量的转基因小鼠胚胎,再通过胚胎移植技术大量培养转基因小鼠,C正确;根据题干信息可知,EGFP基因被定点插入Y染色体上,而Y染色体只有雄性才具有,因而观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎,D正确。
(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　)
A.6　　　B.250　　　C.4 000　　　D.24 000
答案　C　根据题干信息可知,限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点是由6个碱基对构成的,若用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,则理论上得到DNA的的平均长度(碱基对)约为46碱基对,即约为4 000碱基对。故选C。
(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案　D　PCR反应中出现非特异性条带的主要原因是引物与模板DNA出现了非特异性结合,模板DNA不纯或过多易出现非特异性结合,A错误;延长热变性时间与非特异性条带无直接关系,B错误;延长延伸时间易出现非特异性结合,C错误;复性温度偏低易出现非特异性结合,故提高复性温度可减少反应中非特异条带的产生,D正确。
(2021山东,4,2分)我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”,成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物的多种生物的DNA中识别并分离出来,用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是(　　)
A.“引子”的彻底水解产物有两种
B.设计“引子”的DNA序列信息只能来自核DNA
C.设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列
D.土壤沉积物中的古人类双链DNA可直接与“引子”结合从而被识别
答案　C　根据题意,“引子”是利用现代人的DNA序列设计并合成的,其本质是DNA或RNA,DNA的彻底水解产物有磷酸基团、脱氧核糖、四种碱基,RNA的彻底水解产物有磷酸基因、核糖、四种碱基,A错误;人的细胞核、线粒体中均有DNA,故设计“引子”的DNA序列信息可以来自核DNA和线粒体DNA,B错误;设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列,“引子”是利用现代人的DNA序列设计的,C正确;双链DNA解旋成单链后才能与“引子”序列发生碱基互补配对,从而被识别,D错误。
(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是(　　)
A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案　D　抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理,A正确;感染早期,新冠病毒的核酸已进入机体,但机体可能尚未进行体液免疫产生抗体,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况,B正确;患者康复后,体内留有记忆细胞和抗体,而新冠病毒已被机体清除,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况,C正确;感染该病毒但无症状者,其体内会发生体液免疫产生抗体,适用抗体检测法检测,D错误。
(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案　D　若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传品系中有抗除草剂不抗盐的品系,抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因没有转录,C错误;因为质粒为环形,用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可以推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D正确。
(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　)
图1　酶切位点图
图2　电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案　D　本题通过对酶切位点图和电泳结果示意图的分析,考查基因工程工具酶的相关知识,以及观察图示、分析推理的能力,试题通过两种图示的分析体现了对科学思维素养中的演绎与推理要素的考查。图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是(　　)
A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案　C　本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
[2022福建,21(一)]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是　　　　(填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图1所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案　(一)(1)5'→3'　(2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)　解析　(一)(1)PCR扩增过程中,引物链的延伸方向为5'→3'。(2)两种酶虽然能切出相同的黏性末端,但正向连接的重组DNA,限制酶的识别序列没有变,仍能用原来的两种酶进行酶切;反向连接的重组DNA,不存在XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶的识别序列,无法再进行酶切。
(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指　　　　　　　。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　限制酶切割位点　将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞　(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
解析　(1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。
(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是　　　　　　(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是　　　　　　　。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　　三步, 其中复性的结果是　 　　　　　　　　　　　　。
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与　　　　　　　特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案　(1)④②③①　(2)DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
解析　(1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55~60 ℃,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,理由是　 　。
答案　(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析　(1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:
扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可知,F1~F7末端添加序列后应与XhoⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于调控序列及启动子中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhoⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcoRⅠ符合这一要求,所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:
本实验中,用EcoRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
(2019课标全国Ⅰ,38,15分)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括　　　　　和　　　　　。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是　　　。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　　　　　。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　。
答案　(1)基因组文库　cDNA文库　(2)解旋酶　加热至90~95 ℃　氢键　(3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　本题借助目的基因的获取考查基因工程中的PCR技术以及考生对生物学问题进行科学解释的能力;试题通过PCR技术与体内DNA复制的比较,体现了对科学思维中归纳与概括要素的考查。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)体内DNA复制时,需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋,而PCR扩增目的基因时,是借助高温加热至90~95 ℃使DNA变性解旋。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在70~75 ℃,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
(2018课标全国Ⅰ,38,15分)回答下列问题:
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了 　　　　　　　(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的　　　方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与　　　　　　　　组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是　　　。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用　　　　　　　的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加　　　　的抑制剂。
答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　本题主要考查基因工程的相关知识,试题通过三问并列的命题方式考查基因工程的原理与操作程序,考查考生的识记、理解能力,涉及科学思维素养中归纳与概括、演绎与推理等思维过程。本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
[2018浙江4月选考,32(二),7分]回答与基因工程和植物克隆有关的问题:
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI 121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成　　　　　　。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI 121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成　　　　　　　,获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成　　　　实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。
(3)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行　　　　,然后接种到培养基中培养,幼胚发生　　　　　　形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出2点即可)。
答案　(1)粘性末端　磷酸二酯键
(2)转化　使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(3)消毒　脱分化　水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
解析　(1)用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体PBⅠ121,可在切口处形成粘(黏)性末端,通过DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成磷酸二酯键,从而获得重组质粒。(2)经CaCl2处理过的农杆菌,成为感受态细胞,与重组质粒混合,使重组质粒进入细胞,从而完成转化实验。将其置于摇床慢速培养一段时间,目的是使经CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。(3)田间获取的水稻幼胚,需要先进行消毒处理,后接种培养,经脱分化形成愈伤组织,并进行继代培养。影响愈伤组织能否再生出植株的因素,除了培养条件,还有水稻本身的基因型这一内因,也跟继代培养次数有关。
易错警示　影响愈伤组织再生出植株的因素,题干中给出了外界培养条件,所以应从内因考虑。同时,一些植物在多次继代培养后也会丧失细胞全能性的表达能力,所以也跟继代培养次数有关。
(2017课标全国Ⅰ,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是　　　　　　　。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用　　　作为载体,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有　　　　　　　　　　　(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是　　　　　　　　　　(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是　。
答案　(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A　(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕　(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析　本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。 (1)真核生物和原核生物的基因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存在内含子。真核生物在基因表达时,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。 (2)病毒对宿主细胞的侵染具有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。 (3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否翻译出蛋白A,一般用抗原—抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了理论基础。
(2017课标全国Ⅱ,38,15分)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题:
(1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料,原因是　　　　　　　　　　　。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制剂,其目的是　　　　　　　　。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理是 　。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是　　　　　　　。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高,根据中心法则分析,其可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键　(5)目的基因的转录或翻译异常
解析　本题主要考查基因工程的相关知识,考查学生获取知识,分析与归纳知识等能力。(1)从植物体中提取mRNA需要破碎组织细胞,嫩叶比老叶的组织细胞易破碎,mRNA提取效率高。由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板,按照碱基互补配对的原则合成的。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子和终止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中,但是转基因植株抗真菌病的能力没有提高,说明转基因植株体内不存在抗菌活性蛋白,即几丁质酶基因的转录或翻译过程出现异常,从而导致几丁质酶基因没有正常表达合成抗菌活性蛋白。
考点2 DNA的粗提取、PCR、电泳鉴定
(2025湖南,2,2分)用替代的实验材料或者试剂开展下列实验,不能达成实验目的的是( )
选项 实验内容 替代措施
A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片”
B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”
C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”
D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”

答案 B 猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器,不含DNA,不能用猪成熟红细胞替代猪肝细胞用于DNA的粗提取与鉴定实验,B符合题意。
(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的( )
A.1'-碱基 B.2'-氢
C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团
答案 C DNA聚合酶催化游离核苷酸加到已有的核酸片段3'端的羟基上,形成磷酸二酯键,如果保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基,使其无法参与反应,那么DNA聚合酶就不能继续催化下一个脱氧核苷酸的加入,DNA链也就不再继续延伸,C正确。
（多选）（2025江苏，19，3分）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的有( )
A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致
D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
答案BD
审题指导
对比A、a基因碱基对的变化,在基因中确定两种限制酶识别的核苷酸序列及酶切后产生的片段大小分析。
解析 由图可知,基因A发生了碱基对的替换(T/A替换成G/C),而变成基因a,A错误;用限制酶HindⅢ和AluⅠ酶切A基因,形成的末端分别是黏性末端和平末端,B正确;a基因有2个HindⅢ酶切位点,3个AluⅠ酶切位点,用两种酶分别酶切a基因,产生的片段大小不一致,C错误;突变前后,A基因的HindⅢ酶切位点数量发生变化,而AluⅠ酶切位点数量未变,故产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定,D正确。
(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案 A 琼脂糖凝胶浓度太高会影响DNA片段的迁移,浓度太低则会导致分辨率降低,因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小,A正确;凝胶载样缓冲液中的指示剂可避免DNA分子迁移出凝胶,起到指示电泳进程的作用,不能指示DNA分子的具体位置,B错误;DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在同一电场作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长移动速率越慢,C错误;凝胶中的DNA分子通过染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
(2024广东,4,2分)关于技术进步与科学发现之间的促进关系,下列叙述正确的是(　　)
A.差速离心法的应用促进对细胞器的认识
B.电子显微镜的发明促进细胞学说的提出
C.光合作用的解析促进花期控制技术的成熟
D.RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明
答案 A 利用差速离心法可分离出不同细胞器,促进了对细胞器的认识,A正确;光学显微镜的发明促进细胞学说的提出,B错误;人工控制花期的主要途径有温度处理(通过调控温度促进或抑制花芽发育等)、光照处理(控制光照时间长短)、植物生长调节剂处理及栽培措施处理等,花期控制与光合作用的解析无关,C错误;耐高温的DNA聚合酶的发现促进PCR技术的成熟,D错误。
(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案 A DNA的提取过程中可以不使用离心机,可将研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,直接取上清液放入烧杯中,A正确,B错误;鉴定过程需要沸水浴加热,DNA分子在高温下会解螺旋,双螺旋结构会发生改变,C错误;加热是唯一变量,设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。
(2024河北,13,2分)下列相关实验操作正确的是(　　)
A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板
D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落
答案 B PCR利用了DNA复制的原理,DNA的单体是脱氧核糖核苷酸,配制PCR反应体系时,扩增原料不能为4种核糖核苷酸,A错误;琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,B正确;将配制的酵母培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌并冷却至50 ℃左右时,在酒精灯火焰旁倒平板,C错误;将接种环烧红,待冷却后(避免菌种被烫死),迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落,D错误。
(2024湖南,15,4分)（不定项）最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3',为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
答案 AC 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确;电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误;分析电泳结果,以对照个体的一条链为模板复制的子链序列为5'-CTACCCGTGAT-3',模板链序列为5'-ATCACGGGTAG-3',同理患者的子链序列为5'-CTACCTGTGAT-3',模板链序列为5'-ATCACAGGTAG-3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基G突变为A,C正确,D错误。
(2024新课标,5,6分)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测,产物的电泳结果如图所示,其中①~⑧为部分F2个体,上部2条带是一对等位基因的扩增产物,下部2条带是另一对等位基因的扩增产物,这2对等位基因位于非同源染色体上,下列叙述错误的是(　　)
A.①②个体均为杂合体,F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
答案 D 由题意可知,电泳结果中,上部2条带为一对等位基因的扩增产物(假设依次为A、a),下部2条带为另一对等位基因的扩增产物(假设依次为B、b),这两对等位基因位于非同源染色体上,则可推知F1基因型为AaBb,AaBb自交所得F2中,①的基因型为AaBB,②的基因型为Aabb,二者均为杂合体,③基因型为AABb,占比为1/8,⑤基因型为AABB,占比1/16,A正确;④⑥⑦⑧的基因型分别为aaBB、AAbb、aabb和AaBb,故F2中还有一种基因型为aaBb的个体,其PCR产物电泳结果有3条带,B正确;③(AABb)与⑦(aabb)杂交子代的基因型为AaBb和Aabb,其中Aabb对应图中的②,AaBb对应图中的⑧,C正确;①(AaBB)自交子代(1/4AABB、1/2AaBB和1/4aaBB)的PCR产物电泳结果与④(aaBB)电泳结果相同的占1/4,D错误。
(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④
答案 D 反应管②和④虽然只有一种单链,但是单链含回文序列,可以同种单链之间发生互补,四个反应管中单链DNA互补配对情况如图所示:
由图分析可知,D正确。
阅读下列材料,完成第8、9题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查,区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者,以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列,设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物,用于扩增目的片段,如图甲所示。为选出正确和有效的引物,以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR,产物的电泳结果如图乙所示。
(2024浙江6月选考,19,2分)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述,错误的是( )
A.F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B.F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C.F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用
D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段
答案 D 结合图甲、图乙可知,F1-R1引物扩增产物只有一条条带,F1-R2引物扩增产物有三条条带(扩增出的产物不止一种),说明F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段,F1-R2引物不能特异性地扩增目的片段,且R2引物不可用于特异性地扩增目的片段,A、B正确,D错误;F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段,而F2-R1引物扩增后无产物,说明F2为无效引物,C正确。
(2024浙江6月选考,20,2分)为了筛查疟原虫感染者,以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样,处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是( )
A.1号和6号 B.2号和4号
C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号
答案 B
由电泳图可知,2号、4号只有一条条带,故为氯喹抗性患者,B符合题意。
(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案　D　DNA的粗提取与鉴定实验中,通过研磨破碎细胞,使细胞裂解释放DNA等物质,A正确;粗提取的DNA中可能会含有蛋白质、多糖、RNA等杂质,通过分离可以去除混合物中的杂质,B正确;根据DNA和蛋白质等在95%的冷酒精中的溶解度不同,可反复多次沉淀来提高DNA的纯度,C正确;DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后,需要沸水浴加热才会变蓝,D错误。
(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是 (　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案C　为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验时使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,但移液器不需要,A错误;在将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时,应先加样,然后接通电源,B错误;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,因此取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后,析出的白色丝状物即粗提取的DNA,C正确;鉴定DNA时,需要把白色丝状物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴,D错误。
(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 (　　)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案　B　由于在低温条件下DNA酶的活性较低,因此过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A正确;DNA存在于上清液中,离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,B错误;沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确;并非所有蛋白质都可溶于冷酒精,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D正确。
(2022北京,13,2分)下列高中生物学实验中,对实验结果不要求精确定量的是 (　　)
A.探究光照强度对光合作用强度的影响
B. DNA的粗提取与鉴定
C.探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D.模拟生物体维持pH的稳定
答案　B　教材实验中,探究光照强度对光合作用强度的影响需利用盛圆形小叶片的烧杯与光源的距离来调节光照强度,观察并记录同一时间段内各实验装置中圆形小叶片浮起的数量,A不符合题意;利用95%的冷酒精将DNA与蛋白质分离,可粗提取DNA,用二苯胺试剂定性鉴定DNA,B符合题意;探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度需要精确定量生长素类调节剂的浓度,C不符合题意;模拟生物体维持pH的稳定实验中,需准确测定加入酸或碱后不同实验材料pH的变化,D不符合题意。
(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案　A　加入适量的木瓜蛋白酶能分解滤液中的主要杂质——蛋白质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,A符合题意;37~40 ℃达不到破坏蛋白质所需的温度,所选温度应该是60~75 ℃,此温度能够破坏滤液中主要杂质蛋白质的结构,进而去除这些杂质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,B不符合题意;与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是题干中的“特定试剂”,C不符合题意;加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,经过以上处理后DNA析出,过滤后DNA主要存在于纱布上的过滤物中,在滤液中含量极少,经过D项处理后应过滤去除溶液中的杂质,再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,D不符合题意。
(2025安徽,20,11分)稻瘟病是一种真菌病害,水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌,并开展了相关研究。回答下列问题。
(1)采集有病斑的水稻叶片,经表面消毒、研磨处理,制备研磨液。此后,采用 (填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基。分别置于不同温度下培养,目的是 。
(2)经筛选获得一株内生放线菌,该菌株高效合成铁载体小分子,能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株,探究铁载体的功能。主要步骤如下,首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D;然后构建重组质粒;最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对目标基因进行敲除。如图1所示。


说明:用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步,反复循环,可实现基因片段的 。R基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,PCR检测结果如图2所示,其中R基因敲除株为菌落 (填序号),出现菌落④的可能原因是 。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用,从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测,简要写出实验思路。
答案 (1)平板划线法/稀释涂布平板法 筛选出在不同营养条件和温度条件下生长的菌株 (2)指数形式扩增(或大量扩增) ② 重组质粒整合到内生放线菌DNA中 (3)在基本固体培养基中分别添加不同浓度的含Fe3+的物质,在培养基平板中心处,分别同时接种内生放线菌和稻瘟病致病菌,在培养箱中连续培养一段时间,观察、记录菌落的生长状况。
解析 (1)有病斑的水稻叶片经表面消毒、研磨后所得研磨液含多种微生物,可通过稀释涂布平板法或平板划线法在不同的选择培养基中进行接种,并分别置于不同温度下培养,目的是在不同温度和营养条件下,筛选出能生长的内生放线菌,确定其最适生长温度和营养条件,为后续抑菌实验提供适宜菌株。(2)PCR通过变性、复性、延伸,反复循环多次,延伸的产物又可以作为下一个循环的模板,因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍,即实现基因的指数形式扩增(约为2n)。根据实验目的知,本题利用同源重组对内生放线菌的R基因进行敲除,由图分析可知,R基因中间序列为2 000 bp,R-U和R-D总长为1 000 bp,则R基因序列总长为3 000 bp,用引物1和2进行PCR扩增,菌落①和菌落③对应的电泳条带为3 000 bp,R基因未敲除成功;菌落②对应电泳条带为1 000 bp,即内生放线菌DNA片段R基因部分只剩R-U和R-D,R基因敲除成功;菌落④对应电泳条带为7 000 bp,推测重组质粒(4 000 bp)全部整合到内生放线菌的DNA中。(3)若要验证内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用来抑制稻瘟病致病菌的生长,需在以铁离子为唯一铁来源、Fe3+浓度不同的基础培养基上共同培养两种微生物,一段时间后观察两种微生物的生长情况,若稻瘟病致病菌的生长在各个实验条件下均受到抑制则可以证实推测。
(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。

②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有 (答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
答案 (1)①终止子/复制原点 P1和P3 782 ②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外/转速过高使蛋白A发生沉淀/蛋白A亲水性较差发生沉淀/蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解 (2)PEG融合法/电融合法/灭活病毒诱导法 抗体检测
解析 (1)①PCR时选用的两种引物应该方向相反,分析题图,P3是唯一一个与P1和P2方向相反的引物,故必选P3;PCR的目的是确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,P3和P2分别与基因A两端互补配对,若选该对引物进行扩增,无论基因A插入质粒方向是否正确都可以扩增出片段(基因A),不符合要求;P1与质粒一段序列互补配对,P3与基因A的一端互补配对,选P1和P3为引物,扩增时,若基因A未插入质粒,则不能扩增出相应片段;若基因A插入质粒的方向错误,也不能扩增出相应片段,故应选P1和P3对待测质粒进行PCR扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200 bp)和基因A(582 bp),故扩增片段大小为200 bp+582 bp=782 bp。②上清液中检测到蛋白A的条件:重组菌将蛋白A正常表达;蛋白A不被重组菌降解;重组菌裂解或将蛋白A分泌到细胞外;蛋白A易溶于发酵液;离心时转速合适,既能将重组菌和大的颗粒沉淀,又不会将蛋白A沉降下来。(2)诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。对经选择培养所得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
(2025浙江1月选考,24,12分)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料,克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gpd)。采用的方案是:先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分,再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧,经拼接获得完整基因的序列,如图所示:
回答下列问题:
(1)分析不同物种的GPD蛋白序列,确定蛋白质上相同的氨基酸区段,依据这些氨基酸所对应的 ,确定DNA序列,进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR,利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段,进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时,每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要确认或调整刻度和量程,还需要 。
(2)若在上述PCR扩增结果中,除获得一条阳性条带外,还出现了另外一条条带,不可能的原因是 。
A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因,分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后,各自用DNA连接酶连接形成环形DNA,再用苯酚-氯仿抽提除去杂质,最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列,重新设计一对引物,以环形DNA为模板进行第二次PCR,最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物,其序列应是DNA链上的 (A.P1和P2 B.P3和P4 C.P1和P4 D.P2和P3)。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列,其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接,构建重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
答案 (12分,除了特殊标注外,其余每空1分) (1)密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头(2分) (2)C(2分) (3)冷的95%乙醇 D(2分) 调控 (4)基因数据库/序列数据库 表达载体
解析 (1)根据蛋白质的氨基酸序列可得出mRNA上的遗传密码序列,而遗传密码序列和DNA脱氧核苷酸序列存在对应关系,可以依据这些氨基酸所对应的遗传密码,确定DNA序列。利用琼脂糖凝胶电泳可分离并纯化DNA片段。每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要确认或调整刻度和量程,还需要避免污染,所以需更换移液器枪头。(2)若在题述PCR扩增结果中,除获得一条阳性条带外,还出现了另外一条条带,说明产生了不需要的条带,可能是受到了其他微生物DNA的污染或存在与目的基因结构相似的基因,也可能是每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点,所以A、B、D项所述属于可能的原因。在基因组中Gpd基因有2个拷贝,数量太少,不会出现2条条带,C项所述属于不可能的原因。(3)沉淀环形DNA时,应加入冷的95%乙醇,使DNA失水而沉淀。由题干信息“采用的方案是:先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分,再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧,经拼接获得完整基因的序列”和“以环形DNA为模板进行第二次PCR”,由第1次PCR可获得引物P1、P2、P3、P4序列,根据这些序列可获得P1、P2、P3、P4引物,若获得目的基因两侧的序列,所选引物应方向相反且均向两侧延伸,4种引物的延伸方向为5'→3',故引物选P2和P3,设计引物的序列应是DNA链上的P2序列和P3序列,D正确。启动子和终止子是表达载体上在DNA转录时被RNA聚合酶识别,用于启动转录和终止转录,所以具有调控功能。(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的基因(序列)数据库进行比对。获得目的基因后,需将Gpd基因的编码区与表达载体(含启动子、终止子的质粒)连接,形成重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
(2024浙江1月选考,22,13分)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜,具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能,在克隆M、N基因基础上,转化锌吸收缺陷型酵母,进行细胞学鉴定。
回答下列问题:
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物　　　　为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增,PCR每个循环第一步是进行热变性处理,该处理的效果类似于生物体内　　　　的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子因为含　　　　而带负电荷,凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口;当2个PCR产物相对分子质量接近时,若延长电泳时间,凝胶中这2个条带之间的距离会　　　　。回收DNA片段,连接至克隆载体,转化大肠杆菌,测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,然后利用　　　　　　连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,直接在固体培养基进行　　　　培养,活化后接种至液体培养基,采用　　　　　以扩大菌体数量,用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平,无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用　　　　　　法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6,然后各取10 μL菌液。用涂布器均匀涂布在固体培养基上,培养2天,菌落生长如图。该实验中阴性对照为　　　　　　　　　　　。由实验结果可初步推测:转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是　　　　,依据是　　　　　　　　　　　　　。
注: OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高;空载体为未插入M或N基因的表达载体。
答案　(1)根　解旋酶　磷酸基团　变长　(2)DNA连接酶　热变性使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出　(3)划线　振荡培养　(4)梯度稀释　锌吸收缺陷型酵母+空载体　N　转入N基因的这组酵母菌数量多
解析　(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达,说明锌转运蛋白基因在该种植物根部细胞可转录出mRNA,再以mRNA为模板翻译出锌转运蛋白,所以进行锌转运蛋白基因M、N克隆时,可以该植物根为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。PCR中热变性处理时温度超过了90 ℃,双链DNA解旋为2条单链,该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基团故带负电荷。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小等有关,当2个PCR产物相对分子质量接近时,电泳时间过短会导致2个PCR产物分离不完全,而延长电泳时间可使2个PCR产物即凝胶中相应2个条带之间的距离变长。(2)构建重组表达载体时,先分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,以得到相同的黏性末端或平末端,再利用DNA连接酶连接。将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证重组转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是若转化成功,则大肠杆菌的DNA中含有M、N基因,热变性会使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出。(3)菌株一般低温保存于固体培养基上故取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,可直接在固体培养基上进行划线培养。有氧条件下,酵母菌可以大量繁殖,故活化后接种至液体培养基,可采用振荡培养以扩大菌体数量。(4)可采用梯度稀释法对菌液逐级稀释。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载体,其不含M、N基因。由“OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高”及题图中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6),锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组酶母菌数量明显多于锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体组,可知,转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是N。
(2024江苏,23,12分)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图1。其中ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列-(CTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题:
(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时,科研人员常用 处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是 (从图2中的“A~D”中选填)。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。
(i)20 ℃时,加入NaCl后实验效果是 。
(ii)100 ℃时,导致各组中所有蛋白质都沉淀的原因是 。
(iii)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有
。
答案 (12分,特殊注明除外,每空1分)(1)EcoRⅠ、HindⅢ (2)CaCl2 卡那霉素 S-F和E-R(2分) (3)启动子 C(2分) (4)(i)SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 (ii)高温使蛋白变性 (iii)低温下添加 NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持(2分)
解析 (1)目的基因应插入启动子和终止子之间,且题意为将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,再结合图1可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。(2)将目的基因导入大肠杆菌时常用CaCl2处理大肠杆菌,使其处于感受态。由图1可知,重组质粒中含有标记基因——卡那霉素抗性基因,因此转化后的大肠杆菌可采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50,用PCR技术筛选时,所设计的引物应能扩增出SOD和ELP50,结合图1中pET-SOD-ELP50可知,应选择引物S-F和E-R进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后,驱动转录。由图1可知,编码SOD-ELP50蛋白的基因长度为462+750=1 212(bp),理论上其可编码1 212÷3=404(个)氨基酸,已知蛋白中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,则融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11=44.44(kDa),电泳后应该为图2中的条带C。(4)(ⅰ)由图3可知,20 ℃时,与不加NaCl的SOD-ELP50组相比,加入NaCl后SOD-ELP50组纯化的蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时温度过高,导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃时,加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中SOD-ELP50蛋白相对含量高,且大肠杆菌自身蛋白相对含量较低,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,且低温有利于酶活性的保持。
(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有　　　　　　　　　　　　,扩增程序中最主要的不同是　　　　　　　　。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用　　　　。
图2
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有　　　　　　　　。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有　　　。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有　　　　　。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)模板、PCR引物　反应时间　(2)CD　(3)限制酶、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)电泳只能测定DNA长度,不能确定碱基序列是否产生突变
解析　(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有:模板分别是片段F1、片段F2;引物分别是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F,最主要的不同是反应时间(反应时间与模板长短有关)。(2)由题中信息,画出F1与F2片段相接的序列如图所示:
F2-F和F1-R应与F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1与F2片段相接处)相同或互补,C、D所给序列符合要求;而A项序列左右两端分别与F1片段上游序列和F2片段下游序列相同,B项序列左右两端分别与F2片段下游序列和F1片段上游序列互补,故A、B不符合要求。(3)重组酶可以依据PCR扩增序列和线性载体两端的同源序列进行同源重组,不需要使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。(4)该过程的目的不是计数,所以无需控制每个平板30~300个菌落,A错误;抗性平板上未长出菌落,一般因为没有导入含抗性基因的质粒,B错误;含有抗生素的培养基可筛选出成功转化的大肠杆菌,不会出现大量杂菌形成的菌落,C错误;单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物,在抗性平板上长出的单菌落一般无需进一步划线纯化,D正确。(5)EGFP长度为720 bp,AnB1长度为390 bp,二者的总长度为720 bp+390 bp=1 100 bp,用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增,其长度接近于P1、P2的扩增产物,根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的长度,无法确定待检测DNA分子的碱基序列是否发生突变,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。
(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由　　　　　　组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是　　　　　　　　　。PCR扩增时,需在　　　　　　　催化下,在引物的　　　端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物　　　　;②PCR目的产物约为　　　bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是　　　(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明　　　　　　　　　　
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经　　　　形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的　　倍。
答案　(1)脂质和蛋白质　发出星射线,形成纺锤体　(2)溶解DNA　Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)　3'　(3)①a、b　②1 100　③Q4　④蛋白X定位于纤毛基部　(4)逆转录　32
解析　(1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展　在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过　　　获得　　　　用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的　　　　　　　　　位点。设计引物时需要避免引物之间形成　　　　　　　,而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表　　　　,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏　　　　　　　的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但　　　　　　的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有　　　　(填序号:①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
答案　(8分)(1)逆转录　cDNA　(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)引物与模板　GC含量高　(5)②③
解析　本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳　关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
考点3 基因工程的基本操作程序及应用
(2025安徽,15,3分)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )

A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案 C 氯化钙可以使大肠杆菌处于感受态,增加转化效率,从而将重组质粒或质粒K导入大肠杆菌,在筛选平板上,因BamHⅠ的酶切位点在β-半乳糖苷酶基因中,故导入重组质粒的大肠杆菌无法分解X-gal,其菌落为白色,导入质粒K的大肠杆菌菌落为蓝色,故筛选平板上蓝色、白色菌落会增加,A正确;如果筛选平板中只含卡那霉素,只能筛选掉未成功转化的大肠杆菌,含质粒K或重组质粒的大肠杆菌都能存活,所以白色菌落不能判定为含有目的基因的菌株,B正确;质粒K中含有卡那霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶两个标记基因,筛选平板中出现的白色菌落为成功转化重组质粒的菌落,但其是否表达目标蛋白还需要进行抗原—抗体杂交实验进行验证,C错误;筛选平板中蓝色菌落偏多,可能是因为质粒K只有一个酶切位点,用单酶切后易自身环化,较多含质粒K的大肠杆菌正常合成β-半乳糖苷酶,分解X-gal产生蓝色菌落,D正确。
【回归教材】
人教版选择性必修3 P82基因工程的步骤四:目的基因的检测与鉴定,要通过抗原—抗体杂交检测是否成功表达目标蛋白。
(2024江西,12,2分)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　)
A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
答案 A 分析题意,从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB,然后利用PCR扩增目的基因,A正确;由题意知,L-谷氨酸钠是生产γ-氨基丁酸的底物,不能用来供能,B错误;将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB,E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸,C错误;选择限制酶时需考虑多重条件,如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等,同时在设计特异性引物时,还需要在其5'端设计限制酶酶切位点,以便构建重组质粒,根据题干提供的信息,无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ,D错误。
(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案　D　用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
(2024·浙江1月选考·1,2分)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是(　　)
A.试管动物的培育 B.转基因食品的生产
C.治疗性克隆的研究 D.生物武器的发展和生产
答案 D　我国禁止生物武器的发展和生产。
(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去 (　　)
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案B　根据题干信息,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起,如果两个基因中编码起始密码子和终止密码子的序列完整,将得到两条多肽,若想只表达出一条多肽,结合图可知,CD163基因编码起始密码子的序列需保留,编码终止密码子的序列需除去,使得CD163基因翻译结束后不停止,继续合成红色荧光蛋白RFP,即可得到一条多肽,B正确。
(2023浙江1月选考,2,2分)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述确的是(　　)
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
答案　D　试管婴儿技术可以帮助不育夫妇解决生育问题,不应全面禁止,A错误;治疗性克隆也需要监控和审查,B错误;生殖性克隆存在伦理道德方面的风险,C错误;我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,D正确。
(2022浙江1月选考,21,2分)羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc,但不发病。当羊感染了PrPSc后,PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc,导致PrPSc积累,从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病。下列分析合理的 (　　)
A.动物体内的 PrPSc可全部被蛋白酶水解
B.患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C.产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D.给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc,小鼠不会发病
答案　D　感染性蛋白粒子PrPSc会将羊体内的PrPc不断转变为PrPSc,PrPSc在体内积累从而导致发病,可见动物体内的PrPSc并不会全部被蛋白酶水解,A错误;患病羊体内存在指导蛋白质PrPc合成的基因,而PrPSc并不是自身合成的,而是外界感染的,B错误;PrPSc在体内积累从而导致发病,说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用,C错误;把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病,原因是患瘙痒病的羊组织匀浆含有感染性蛋白粒子PrPSc,小鼠体内含有PrPc,PrPc基因敲除小鼠不含PrPc,接种PrPSc后也不会发生使PrPc转变为PrPSc并积累PrPSc而致病的现象,D正确。
(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是(　　)
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案　A　高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
(2018浙江4月选考,3,2分)将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中,培育成耐低温的西红柿新品种。这种导入外源基因的方法属于(　　)
A.杂交育种　　 　B.转基因技术
C.单倍体育种　　　D.多倍体育种
答案　B　将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中培育出耐低温的西红柿新品种,突破了物种间生殖隔离的障碍,属于转基因技术。
(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
甲
乙
下列叙述正确的是(　　)
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
答案　B　从图甲可知GFP和Gata3基因使用同一个启动子,故Gata3基因的启动子同时控制GFP和Gata3基因的表达,A错误;由于启动子区在左侧,基因的编码区在右侧,因此转录的方向是从左到右,mRNA的5'端为Gata3基因,3'端为GFP基因,因此翻译时先合成Gata3蛋白,B正确;大片段为Gata3-GFP基因,小片段为Gata3基因,因此2号为Gata3-GFP基因纯合子,4号为野生型,C错误;若用引物1和引物3进行PCR,则Gata3基因无法扩增,不利于区分纯合子和杂合子,D错误。
（2025河北，22，14分）为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。
回答下列问题:
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ,则表明融合蛋白能结合镉离子。
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。
240 μmol·L-1镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。

(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。(填标号)
①衣藻作为生物材料在水体

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