资源简介 (共89张PPT)选择性必修三<第六课时>高考生物基因工程的基本工具和基本操作程序焦聚高考考点 高考考情具体分析基因工程的基本工具基因工程的基本操作程序DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定(2024贵州卷）(2024湖南卷)(2024江西卷) (2023湖北卷）(2024天津卷）(2024福建卷) (2024海南卷)(2024重庆卷）(2024贵州卷) (2024江西卷)(2024北京卷）(2024湖南卷) (2024甘肃卷)(2024安徽卷）(2024广东卷)(2024安徽卷）(2024山东卷)内容索引考点一基因工程的基本工具考点二基因工程的基本操作程序考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定一、基因工程的概念【考点一】基因工程的基本工具是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。体外环境1.操作环境：基因重组2.原理：基因3.操作对象：分子水平4.操作水平：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品5.结果：定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍6.意义：【考点一】基因工程的基本工具重组DNARNA蛋白质性状转录翻译①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）②都遵循碱基互补配对原则③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构①基因是控制生物性状的结构与功能单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界几乎共用一套遗传密码拼接的基础表达的基础复制二、 基因工程的基本工具【考点一】基因工程的基本工具限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”1、 限制性内切核酸酶（简称限制酶）【考点一】基因工程的基本工具来源主要来自原核生物数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）一种限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（因此具有专一性）特定切点上的磷酸二酯键大多数是6个核苷酸序列产生黏性末端或平末端种类特点作用部位识别序列长度结果【考点一】基因工程的基本工具EcoRI 限制酶大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别 序列，并切割___和___之间的 。切割后产生__________。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开黏性末端：限制酶限制酶【考点一】基因工程的基本工具SmaI 限制酶SmaI 限制酶只能识别 序列，切割___和___之间 切开，切割后产生________。限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开平末端：CG平末端磷酸二酯键CCCGGG限制酶限制酶【考点一】基因工程的基本工具思考(1)选择性必修3 P71“旁栏思考”: 原核生物中存在限制酶的意义是什么？原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)选择性必修3 P74“拓展应用”:限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？限制酶的选择原则【考点一】基因工程的基本工具限制酶的选择原则【考点一】基因工程的基本工具(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ(单酶切)；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接(反向连接)，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(双酶切)。2.DNA连接酶【考点一】基因工程的基本工具①作用将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。②种类类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶来源功能 只缝合____________ 缝合____________和____________结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯键2.DNA连接酶【考点一】基因工程的基本工具【思考】T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同吗？不同，因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。③与DNA有关的几种酶的比较【考点一】基因工程的基本工具作用底物作用部位作用结果DNA分子磷酸二酯键将DNA切割成两个或多个片段DNA分子片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端限制酶DNA限制酶DNA聚合酶③与DNA有关的几种酶的比较【考点一】基因工程的基本工具作用底物作用部位作用结果DNA分子将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链碱基对中的氢键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键解旋酶DNA水解酶DNA分子3.基因进入受体细胞的载体【考点一】基因工程的基本工具①作用将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制②种类质粒（常用载体）：独立于拟核或细胞核外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。动植物病毒噬菌体思考题若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕【考点一】基因工程的基本工具③运载体需具备的条件有切割位点有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别DNA大肠杆菌细胞质粒目的基因插入位点抗四环素抗性基因控制质粒DNA转移的基因能复制并带着插入的目的基因一起复制复制原点氨苄青霉素抗性基因【考点一】基因工程的基本工具③运载体需具备的条件能够在宿主细胞中复制并稳定地保存能使目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个限制酶切点可携带多个或多种外源基因有某些标记基因便于重组DNA分子筛选对受体细胞无害、易分离实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。对点练习【考点一】基因工程的基本工具1．（2024·青海·一模）Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（ ）A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同B．能被Sau3AI识别的DNA位点均能被BamHI识别C．该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点D．该DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6个片段C对点练习【考点一】基因工程的基本工具2．（2024·安徽安庆·模拟预测）2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是（ ）【考点一】基因工程的基本工具2．（2024·安徽安庆·模拟预测）2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是（ ）A. sgRNA通过与目标DNA序列互补配对引导Cas9蛋白到位B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱 靶率越低C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键D．可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除B【考点一】基因工程的基本工具3．（2024·湖南衡阳·三模）CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas系统的组成如图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成）已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是（ ）A．CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用B．该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化C．内切核酸酶Cas9具有专一性D．CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割D【考点二】基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定苏云金芽孢杆菌抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子提取与载体拼接导入普通棉花 （无抗虫特性）抗虫基因已插入染色体DNA中棉花细胞（含抗虫基因）抗虫棉（含有并表达抗虫基因）1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定（保证）一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序在基因工程的设计和操作中，用于__________________或获得预期基因表达产物等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因。1.目的基因改变受体细胞性状一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序2.基因结构原核细胞基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子转录相应的mRNA，能编码蛋白质的DNA序列RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA终止转录c连续的、不间隔的一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序2.基因结构真核细胞基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子内含子外显子间隔的、不连续的外显子能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。内含子能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序3.筛选合适的目的基因（1）从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。（2）利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。结构和功能清晰4.获取目的基因的方法（1）通过构建_____________来获取目的基因基因文库一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序4.获取目的基因的方法（1）通过构建_____________来获取目的基因基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因），如：cDNA文库。基因组文库部分基因文库基因组文库的构建模式图【考点二】基因工程的基本操作程序提取某种生物的全部DNA一定大小的DNA片段导入受体菌中储存基因组文库用适当的限制酶切将DNA片段与载体连接部分基因文库构建模式图【考点二】基因工程的基本操作程序成熟mRNAcDNA文库基因组文库和 cDNA 基因文库的比较【考点二】基因工程的基本操作程序文库类型 cDNA文库 基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序4.获取目的基因的方法（2）人工合成目的基因前提基因比较小，核苷酸序列已知方法通过DNA合成仪用化学方法直接合成一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序（3）通过______特异性的快速扩增目的基因PCR①PCR的概念PCR是________________的缩写，是一项根据_______________的原理，在____提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列全称:聚合酶链式反应原理:DNA半保留复制操作环境:体外(PCR扩增仪/PCR仪)目的:对目的基因的核苷酸序列进行大量复制优点:可以在短时间内大量扩增目的基因一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序②体外PCR的条件DNA模板稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸（dNTP）耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）引物（2种）DNA模板（需含有目的基因）分别与模板DNA相结合的2种引物四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）能严格控制温度的温控设备一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序③引物在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。3’3’3’3’5’5’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’PCR的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序④过程引物待扩增的DNA片段（模板）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序④过程温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链变性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。复性温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。延伸5’5’一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序⑤PCR的结果每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增（约2n）。1个DNA片段2个DNA片段第一轮一、 目的基因的筛选与获取【考点二】基因工程的基本操作程序⑤PCR的结果2个DNA片段第一轮4个DNA片段8个DN A片段第二轮第二轮【考点二】基因工程的基本操作程序【思考1】获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？第二轮第一轮产生的子链长度小于模板链长度，到第三轮循环时，才出现2个两条脱氧核苷酸链等于目的基因。5’3’5’5’3’5’3’3’第三次循环至少要三次循环【考点二】基因工程的基本操作程序⑥PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。n代后，DNA分子有_____个n代后，DNA链有_____条第____代出现完整的目的基因n代后，含引物的DNA分子有_____个n代后，共消耗 个引物第n代复制，消耗了______个引物n代后，完整的目的基因有 个2n2n+132n2n+1-22n2n-2n二、基因表达载体的构建【考点二】基因工程的基本操作程序1、构建基因表达载体的目的01使目的基因可以遗传给下一代02使目的基因在受体细胞中稳定存在03使目的基因能够表达和发挥作用构建基因表达载体的目的二、基因表达载体的构建【考点二】基因工程的基本操作程序2、基因表达载体的组成及作用复制原点是载体DNA复制的起点，若复制原点被破坏，则载体将不能复制鉴定受体细胞中是否含有目的基因转录的终点，在转录过程中起调控作用编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子RNA聚合酶识别和结合的部位（基因的上游）；驱动基因转录出mRNA【考点二】基因工程的基本操作程序注意（1）基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了________ 。（2）目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入________________________ ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。目的基因启动子和终止子之间的部位启动子与终止子 起始密码子与终止密码子位于DNA分子中，起始和终止 转录过程 位于mRNA分子中，起始和终止翻译过程【考点二】基因工程的基本操作程序3、构建过程目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程酶切后产生开环质粒用限制酶切割载体，使它出现一个缺口01用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因02用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。03【考点二】基因工程的基本操作程序1、单酶切（同一种酶）（1）目的（结果）：产生相同的黏性末端，以便进行连接（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：酶切后产生开环质粒质粒目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接单酶切缺点质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接【考点二】基因工程的基本操作程序2、双酶切使用两种限制酶的优点防止目的基因与载体的反向连接防止目的基因和载体的自身环化-G-CTTAA-A-TCTAG三、将目的基因导入受体细胞【考点二】基因工程的基本操作程序1.将目的基因导入植物细胞（1)花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中植物细胞微生物细胞动物细胞方法花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法显微注射技术Ca2+处理法(感受态细胞法)【考点二】基因工程的基本操作程序在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。【考点二】基因工程的基本操作程序（2）农杆菌转化法① 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。② 农杆菌特点：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。【考点二】基因工程的基本操作程序③该过程经过__次拼接、__次导入两两第一次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）第二次拼接第一次导入将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌第二次导入含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）【考点二】基因工程的基本操作程序③该过程经过__次拼接、__次导入两两农杆菌转化法流程图Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒农杆菌植物细胞植物细胞表现出新性状的植株转入目的基因插入植物细胞染色体DNA中导入植物组织培养【考点二】基因工程的基本操作程序④农杆菌转化的具体方法可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后______________，并_____________；受体细胞为_________可以将______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得_______，再进行_______、_______等；受体细胞为________与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵2、将目的基因导入动物细胞考点二 基因工程的基本操作程序显微注射早期胚胎培养胚胎移植发育受精卵全能性高，高度分化的体细胞全能性受到抑制表达载体提纯受精卵胚胎雌性动物的输卵管或子宫内新性状的动物显微注射法受精卵（1）导入方法：（2）受体细胞:考点二 基因工程的基本操作程序3.将目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）（2）受体细胞：（3）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态重组Ti质粒吸收感受态细胞用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。考点二 基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定分子水平的检测个体生物学水平的鉴定抗虫接种实验或病原体感染法抗原一抗体杂交技术目的基因是否翻译成蛋白质PCR等技术染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA考点二 基因工程的基本操作程序——通过PCR等技术检测过程：① 首先取出转基因生物的基因组DNA。② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中。1.分子水平检测15N15N变性变性（1）检测目的基因是否导入考点二 基因工程的基本操作程序——通过PCR等技术检测用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。提取RNARNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA（2）检测目的基因是否转录转基因生物提取RNA标记的DNA/RNA探针RNA电泳分离洗去未结合的探针放射自显影杂交转 膜RNA分子杂交(Northern Blot)流程图考点二 基因工程的基本操作程序提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体苏云金芽孢杆菌抗原抗体杂交提取蛋白电泳分离——通过抗原-抗体杂交检测（3）检测目的基因是否翻译考点二 基因工程的基本操作程序2、个体水平检测（2）活性比较实验:将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。（1）检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。如：抗虫做抗虫接种实验，观察 （害虫/生物）的生存状况。抗病做病原体接种实验，观察 （病原体/生物）的生存状况。抗盐将转基因植物移栽到 或用一定浓度的盐水浇灌水稻。抗寒将转基因植物移栽到 环境中，观察其生长状况。抗除草剂植物喷洒除草剂害虫生物低温（寒冷）盐碱地4．（2024·广西柳州·一模）图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（ ）对点练习DA．一个基因扩增4次共消耗引物32个B．获取该基因，要破坏2个磷酸二酯键C．用PCR技术获取该基因，设计的引物应分别结合在1、4部位D．在PCR仪中至少需经过6次循环，才可获得32个符合要求的目的基因5．（2024·全国·模拟预测）PCR仪实际就是一个温控设备，将样品放入PCR仪后，重复循环变性、退火、延伸三个过程，2～3小时就能将待扩增的目的DNA片段复制出几百万个。下列叙述错误的是（ ）对点练习BA．DNA热变性可逆转的特点是PCR技术的基础之一B．随着扩增次数的增加，模板链与引物结合的概率增加C．引物序列越短，目的基因扩增产物错误率越高D．PCR技术可用于鉴定牛胚胎的性别6．（2024·全国·模拟预测）科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延伸PCR技术构建融合基因，从而培育既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶识别序列如图2所示。回答下列问题：对点练习(1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过 次扩增循环。PCR1与PCR2的产物能够形成杂交链的条件是 。7 PCR3过程不需要引物，其原因是 。。起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端(1) 2 引物P2和引物P2和引物P3的5‘端存在部分互补配对的碱基序列 两条母链起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端【答案】对点练习2引物P2和引物P2和引物P3的5‘端存在部分互补配对的碱基序列两条母链(2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物 对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插入到Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是 。.。对点练习在引物P1的5'端加上限制酶Nhe Ⅰ 的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaⅠ的识别序列(2) P1和P4 在引物P1的5'端加上限制酶NheⅠ的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaⅠ的识别序列【答案】P1和P4(3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是 ；利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 。。对点练习使其能够吸收周围环境中的DNA先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞(3)使其能够吸收周围环境中的DNA 先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞【答案】3.鉴定DNA的原理：一、DNA的粗提取与鉴定利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1.提取的基本思路：2.提取DNA的原理：（1）DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。酒精酒精在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定4、实验步骤取材、研磨称取约30 g洋葱,切碎,放入研钵中倒入10mL研磨液,充分研磨去除滤液中杂质在漏斗中垫上纱布,将研磨液过滤到烧杯中,在4℃冰箱中放置几分钟后(或直接将研磨液倒入塑料离心管中，离心5min),再取上清液DNA的析出在上清液中加入等体积的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，静置2~3min,用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分(或将溶液倒入塑料离心管中，离心5 min,弃上清液,将管底的沉淀物晾干)DNA的鉴定将丝状物或沉淀物用2mo1/L的NaCl溶液溶解,然后加入二苯胺试剂，混匀后置于沸水中加热5min,冷却后观察颜色变化哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，不适合作为提取DNA的材料。考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定①鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定时颜色反应不明显。②充分地搅拌和研磨原因：DNA会吸附在滤纸上, 用纱布可减少DNA的损失。③使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是:DNA在此浓度下溶解度最大减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。a.低温抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；b.抑制DNA分子运动，使DNA易形成析出；析出DNA考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定④低温放置几分钟的作用:⑤预冷的酒精溶液:⑥搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的:⑦2mol/L的NaCl:二、DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1、实验原理二、DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。DNA片段电泳鉴定的原理：考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。DNA片段的扩增 → PCR技术移液离心扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序 变性 复性 延伸预变性 94℃,5min / /30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定2、实验操作配制琼脂糖溶液制备琼脂糖凝胶根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。① 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定DNA片段的电泳鉴定加样电泳观察将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定DNA片段的电泳鉴定考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3、注意事项为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。01该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。02在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。03在进行操作时，一定要戴好一次性手套。04PCR扩增不能随意加大试剂用量。057．（2024·全国·模拟预测）关于“DNA的粗提取与鉴定”及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）对点练习DA．DNA的提取和鉴定过程中不会发生双螺旋结构的改变B．常使用预冷的体积分数为70%的酒精获得粗提取的DNAC．在向微量离心管中添加PCR反应体系时不需要更换移液器上的枪头D．PCR产物的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳进行8．（2024·浙江台州·一模）从目标生物中提取DNA，是进行基因工程操作的基础。下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）对点练习DA．实验中需加入抑制DNA酶活性的药物，防止DNA水解B．实验中需加入能使核蛋白变性的药物，便于提取DNAC．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAD．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂混合，即可鉴定DNA9．（2024·黑龙江大庆·一模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的相关叙述，错误的是（ ）对点练习DA．DNA粗提取实验中利用“DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精”的原理提纯DNAB．“在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色”，可利用此原理对DNA进行鉴定C．凝胶中DNA的迁移速率与凝胶的浓度、电压的大小、DNA分子的大小等有关D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察1．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）真题演练BA．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶2．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）真题演练DA．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质3．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）真题演练A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰A4．（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）真题演练A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色D5．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）真题演练A CA．上述PCR反应体系中只加入一种引物B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G6．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。真题演练(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。真题演练(1)基因S启动子的基本组成单位是 。脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）EcoRⅠ后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体酶切定向链接（反向链接）真题演练(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段 PCR(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。真题演练品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大【注意】字体安装之后必须要重启PPT，字体（适用于字体种类较少的情况） 才能显示出来。找到压缩包中 鼠标左键双击 双击后，选择左上角的“安装”的字体文件夹 字体文件【注意】字体安装之后也必须重启PPT。（适用于字体种类较多的情况）找到压缩包中 打开后有较多字体安装包，Ctrl+A全选 将字体文件包粘贴到：C盘 >的字体文件夹 windows文件夹 > fonts文件夹（Mac系统的安装与windows系统类似，仅提供路径）找到压缩包中的字体文件夹 应用窗口中打开“字体册”鼠标左键双击字体文件 界面左上方点击“+”双击后，选择左上角的“安装” 选中要安装的字体，点击“打开”【注意】Mac系统与Windows系统一样，都需要重启PPT，字体才能显示出来。“明明自己电脑上安装成功了，播放也正常的，但拿去教室电脑上播放，字体又变得乱七八糟！”老师们自己电脑上安装成功了，代表安装在自己电脑上的C盘（一般情况下），但如果教室电脑上没有安装过PPT内所用的特殊字体，在打开PPT时，会出现字体不一或缺失的情况。把字体文件复制粘贴到教室电脑上的 C盘> windows > fonts文件夹里即可。在教室电脑上找到压 打开后框选中字体 将字体文件包粘贴到：C盘 >缩包中的字体文件夹 包，Ctrl+C复制 windows文件夹 > fonts文件夹【注意】转图片后，图片会自动对齐页面正中在自己的电脑上将有特殊字体的可编辑文字转化成图片即可。 心，需自己移动到原位选中含有特殊字体的可编 Ctrl+V粘贴，点击右下角 点击“粘贴选项” 下右边辑文字框，Ctrl+X剪切 图标 的图标，选择粘贴为图片“下载了字体，安装也成功了，电脑也重启了，但PPT内却找不到这款字体了？！”一般这种情况出现在有多种字重的情况（例：阿里巴巴普惠体），部分字体隐藏了。字重：可以理解为改款字体的不同粗细呈现最直接的方法是 完毕后，打开PPT，直接搜索字体+字重。前提是确保完成一下操作：①字体安装后重启PPT； ②把这款字体整个系列（全部字重）都已下载 展开更多...... 收起↑ 资源列表 《基因工程的基本工具和基本操作程序》（课件版权归属“一起课件”，只供个人使用，请勿私自传播，违者必究）.pptx 【一起课件】字体安装说明书.pdf
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