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(共40张PPT)
第3章 基因工程工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第二课时）
目标
01
02
03
关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
（社会责任）
探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。（科学思维）
运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
（生命观念）
学习目标
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
温故知新
实验原理
材料用具
实验步骤
粗提取原理
鉴定原理
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
概述DNA粗提取和鉴定的原理，以及材料的选择。
以小组为单位画出实验流程简图。
2
3
4
1
合作探究一：请同学们自主阅读教材P74-75，小组合作思考讨论完成问题。
第一次过滤后DNA在沉淀中还是上清液中？
你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
原理一
原理二
原理三
思路 ：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
一、实验原理：
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
二、实验材料及用具：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
1.选材：
问题1:能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
2.试剂：
试剂
研磨液
体积分数为95%的酒精
二苯胺
2mol/L 的NaCl溶液
蒸馏水
溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
二、实验材料及用具：
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
研磨
加酒精析出
溶解与鉴定
提取上清液
取上
清液
充分
研磨
纱布过滤
95%冷酒精
离心
离心
丝状物
沉淀物
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
1.破碎细胞——
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，
研磨。
洋葱
研磨液
充分
问题2:如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
2.去除杂质——
在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
问题3:过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
问题4:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
3.DNA的粗提取——
在上清液中加入体积相等的 溶液,
静置2~3min，溶液中出现的 就是
粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
用冷却的酒精析出DNA
问题5:此步骤的目的是？
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
预冷的酒精的优点
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
3.DNA的粗提取——
用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。
一个方向
沉淀物
丝状物
问题6:为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
避免破坏DNA
用冷却的酒精析出DNA
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
4.DNA的鉴定——
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理
步骤3 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象
实验结论 加丝状物或沉淀物
加4mL的二苯胺试剂
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
4.DNA的鉴定——
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
三、实验步骤：
4.DNA的鉴定——
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
实验组
对照组
问题7:如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
问题8:与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
问题8:与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
实验结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，
影响鉴定效果。
DNA的粗提取和鉴定
探究.实验
核心归纳
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
拓展延伸：DNA的粗提取与鉴定
当实验试剂缺乏时，可以用家用洗洁精或洗衣粉（含有蛋白酶的表面活性剂）代替研磨液，也能达到裂解细胞膜、让蛋白质变性的目的。还可以在研磨过滤后的滤液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶）促使蛋白质水解。
拓展延伸：DNA的粗提取与鉴定
①取一段长约2 cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。
②加入10 mL温水，2 g食盐，5滴洗洁精，充分研磨。
③用双层纱布过滤研磨液，收集滤液。
④向滤液中加入2 g嫩肉粉，混合均匀。
⑤将滤液置于55~60℃（木瓜蛋白酶作用的最适温度）的水浴中加热5～10 min
⑥冷却，加入等体积、预冷的体积分数为95％的酒精。
⑦静置2～3 min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮状析出物。
香蕉中DNA的粗提取实验
　实战训练　
1.下表关于DNA粗提取与鉴定实验的表述,不正确的是 (　　)
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取、溶
解DNA
B 2 mol/L NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
C 冷却的酒精 加入离心后的上清液中 溶解DNA
D 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的溶液中 鉴定DNA
　实战训练　
2.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 (　　)
A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B.植物材料需先研磨破碎细胞
C.DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后颜色呈紫色
　实战训练　
3．下列有关生物学实验研究的叙述中，正确的是（ ）
A．可以用洋葱外、内表皮为材料观察植物细胞质壁分离实验，黑藻不可以做本实验材料B．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开C．观察细胞减数分裂时，可以选择动物细胞，如蝗虫的精巢，但不可以选择植物细胞D．在DNA的粗提取与鉴定实验中，体积分数 95%酒精的作用是溶解某些蛋白质、析出 DNA
　实战训练　
4．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
　实战训练　
5．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（　　）
A．用SDS处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
　实战训练　
6．“DNA粗提取与鉴定”实验需要对材料进行选择、处理。为了提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，下列对实验材料的选择和处理，正确的是（ ）
A．以猪成熟红细胞为实验材料时，可在滤液中加入适量的木瓜蛋白酶B．以菜花为实验材料时，在研磨过程中可加入适量的纤维素酶C．以植物叶片为实验材料时，一般使用体积分数为50%的预冷酒精提取DNAD．以香蕉为实验材料时，将研磨液在4℃的冰箱中放置几分钟后，取沉淀物进行离心
　实战训练　
7．下列关于DNA的粗提取与鉴定实验的叙述错误的是（ ）
A．以洋葱为实验材料进行DNA的粗提取必须在无菌条件下进行B．DNA可溶于2mol/L的NaCl溶液C．在提取液中加入预冷的95%的酒精溶液后DNA会与蛋白质分离并析出D．溶解后的DNA遇二苯胺试剂在沸水中加热5min冷却后会呈现蓝色
　实战训练　
8．下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　）
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液B．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水涨破，释放DNAC．DNA 不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/L的NaCl溶液D．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
　实战训练　
9．某实验小组进行“DNA 的粗提取与鉴定”实验。下列有关叙述正确的是（ ）
A．取材时可选用鸡血、洋葱、菜花等富含 DNA 的材料进行实验B．破碎植物细胞时，加入洗涤剂以加速细胞壁瓦解C．DNA 的释放和溶解是实验成功与否的关键，调节 NaCl溶液浓度利于 DNA 释放D．鉴定时，需将 DNA 溶解在2 mol/L NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂即可出现蓝色
　实战训练　
10．如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是（ ）
A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大
　实战训练　
11．下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（ ）
A．应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜B．可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开C．研磨材料得到的滤液应在4℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作D．向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量
　实战训练　
12．下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验和“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．利用DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精的原理可以分离DNA和蛋白质B．鉴定DNA时需使用二苯胺试剂，该试剂需现用现配，加入后置于沸水浴加热C．进行琼脂糖凝胶电泳时，长度相同的DNA片段会出现在同一位置出现条带D．利用PCR扩增4次后，得到的DNA含两种引物的DNA片段所占比例为1/8
　实战训练　
13．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，正确的是（ ）
A．将猪的红细胞置于清水中，红细胞涨破后DNA会释放出来B．在研磨液中加入等体积的预冷的酒精析出的丝状物即为粗提取的DNAC．将白色丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，离心后弃去上清液D．提取到的丝状物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热后变蓝
　实战训练　
14．以下生物学实验的部分操作过程，正确的是（ ）
选项 实验名称 实验操作
A 酵母菌的纯培养 倒平板后将培养基放入高压蒸汽锅内灭菌
B 菊花的组织培养 将生长良好的愈伤组织先转接到诱导生根的培养基，长根后再转接到诱导生芽的培养基
C DNA的粗提取与鉴定 将丝状物放入2mol/L NaCl溶液再加二苯胺试剂，沸水浴中加热可观察到溶液变蓝
D DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR实验使用的微量离心管等在使用前不需灭菌
　实战训练　
15．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的~880kb至~903kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法错误的是（ ）
A．上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的B．应在用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液冷却后加入甲紫等染色剂C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小D．该突变体出现的根本原因是第4对引物对应区间发生了基因突变
　实战训练　
16．不同生物的DNA的提取方法有所不同，DNA提取的原理和实验流程大致相同（如图所示）。下列说法错误的是（ ）
A．破碎细胞在冷冻下进行，可将组织材料冻裂和降低DNA酶的活性B．溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质C．DNA粗提取时离心需使用塑料离心管，用二苯胺试剂对离心结果进行鉴定D．鉴定絮状物中DNA时，需用2mol·L- NaCl溶液溶解DNA后加入二苯胺试剂直接观察
　实战训练　
17．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是（　　）
A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
18.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
　实战训练　
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序
是__________________________
(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目
的是 。
③→②→①→④→⑤
溶解DNA
(3)步骤①的目的是 ，
其依据的原理是 。
析出并获得DNA
DNA不溶于酒精
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴
加 试剂， 后，如果出现 _______则证明该丝状物的主要成分为DNA。
白
二苯胺
沸水浴冷却
蓝色
感谢观看

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