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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
科技探索之路 | 动物细胞工程的发展历程
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞工程常用的技术：
——动物细胞工程的基础
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植等
一 动物细胞培养
一、动物细胞培养的条件
（1）概念：
指动物机体中取出相关的组织，将它分散成 ，然后，放在 ，让这些细胞 的技术。
（2）原理：
细胞增殖（有丝分裂）
单个细胞
适宜的培养基中
生长和增殖
1.动物细胞培养
体内细胞维持生命活动和增殖需要营养和稳定的内环境，体外培养细胞需要类似的以下条件：
2.动物细胞培养的条件
营养物质
其他条件
动物细胞培养的条件
<
<
氨基酸
糖类
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养的条件
2.动物细胞培养的条件
（1）营养
合成培养基
+
①合成培养基：
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培养基。
②血清等一些天然成分：
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。细胞培养时，一般需添加10%～20%的血清或血浆。
培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
血清等一些天然成分
一、动物细胞培养的条件
（2）无菌、无毒的环境
2.动物细胞培养的条件
①培养液、培养用具灭菌处理以及在无菌环境下进行操作；
②添加抗生素，以防培养过程中污染；
③定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）温度和pH、渗透压
一般与动物体内相同
①适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以______________为宜；
36.5±0.5℃
②适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为_____________
7.2-7.4
③适宜的渗透压：
维持细胞正常的形态和功能
一、动物细胞培养的条件
（4）气体环境
①气体的组成及作用
O2：
CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
②容器：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
③仪器：置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
2.动物细胞培养的条件
二、动物细胞培养的过程
1.动物细胞培养的过程
（1）取动物组织
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
②取材原因：
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
①动物相关组织的选择：
（2）动物组织处理——制成细胞悬液
①将组织分散成单个细胞：
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
原因：
成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖
一是能使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需要的营养供应；
②用培养液将细胞制成细胞悬液。
二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养。
二、动物细胞培养的过程
思考：
①常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
②胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？
细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。
因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。
二、动物细胞培养的过程
（3）原代培养
①悬浮生长类：
②贴壁生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。
（大多数细胞）
培养瓶或培养皿内表面的要求：光滑、无毒、易于贴附。
1.动物细胞培养的过程
大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻；贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象。
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
二、动物细胞培养的过程
（4）分瓶、进行传代培养
①收集细胞
悬浮生长类：
直接用离心法收集
贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
1.动物细胞培养的过程
通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养。
将分瓶后的细胞培养成为传代培养。
【思考】动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶？
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
原代培养：
传代培养：
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
悬浮生长
贴壁生长
传代培养
细胞悬液
原代培养
细胞分裂
受阻
1.动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
原代培养
转入培养液中进行
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
二、动物细胞培养的过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
主要过程
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
脱分化-再分化
原代培养-传代培养
比较植物组织培养与动物细胞培养
二、动物细胞培养的过程
拓展：细胞株与细胞系
传代培养一般培养有限代次后，细胞就会死亡，如果细胞不死，就意味着细胞的遗传物质发生了改变，即具有异倍体核型。
目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。
细胞株
从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。
细胞系
传到40-50代后，有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。
癌细胞
三、干细胞培养及其应用
动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫做干细胞。
1.干细胞的概念：
2.干细胞的来源：
3.干细胞的类型：
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
存在于 、 和 等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
三、干细胞培养及其应用
胚胎干细胞（简称ES细胞）
①分布：
②特点：
③应用实例：
④局限性：
存在于早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，在体外培养可分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞。
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
三、干细胞培养及其应用
成体干细胞
①分布：
③特点：
②常见类型：
存在于成体组织或器官内的干细胞
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
发现最早、研究最多、应用最成熟
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
④作用：
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
三、干细胞培养及其应用
⑤应用实例
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞：
神经干细胞：
成体干细胞
三、干细胞培养及其应用
诱导多能干细胞（iPS细胞）
①概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞）。
②诱导方法：
借助载体将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）；
用小分子化合物诱导形成。
③诱导多能干细胞优点：
诱导过程无须破坏胚胎；
iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
iPS细胞
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
三、干细胞培养及其应用
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
移植
取成纤维细胞等
转入相关因子
细胞发生转化
分化
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
诱导多能干细胞（iPS细胞）
三、干细胞培养及其应用
三种干细胞的比较
比较 项目 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞
来源 诱导高度分化的组织细胞形成
特点 具有分化成为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 具有 ，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 类似胚胎干细胞；诱导无须破坏胚胎，应用前景更广泛
早期胚胎
成体组织或器官中
组织特异性
四、练习与应用
一、概念检测
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
×
√
×
×
A
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
四、练习与应用
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
谢谢观看

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