资源简介

课题3　血红蛋白的提取和分离
一览众山小
三维目标
1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。?
2.简述色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。通过查资料或实际操作，理解这些方法的运用过程。提高搜集获取信息、分析问题、解决问题的能力。
学法指导
本节从课题背景着手引出本节重点是凝胶色谱法的原理和方法。理解凝胶色谱法的原理，可以结合教科书上的插图，对凝胶色谱法分离蛋白质的原理和过程有一个直观的认识。具体实验中要注意凝胶拄充填时，应注意那些事项。电泳的原理以及常用的两种方法是本课题的重点内容。
诱学导入

材料：天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。
问题：为什么运用电泳法能达到分离生物大分子的目的？?
导入：电泳利用了各种生物大分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生了不同的迁移速度，从而达到分离各种分子的目的。专题5
DNA和蛋白质技术
课题3
血红蛋白的提取和分离
教材习题点拨
（一）旁栏思考题
你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？
答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无数的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
（二）练习
1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同相对分子质量的蛋白质分子可以获得分离。
2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。
缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。
3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。专题5
DNA和蛋白质技术
课题1
DNA的粗提取与鉴定
教材习题点拨
（一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
（二）练习
1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。课题1　DNA的粗提取与鉴定
一览众山小
三维目标
1.简述DNA的物理化学性质、鉴定DNA的方法、DNA的溶解性，并在此基础上理解DNA粗提取的原理。?
2.描述DNA粗提取和鉴定的主要过程，建立对DNA的感性印象。?
3.认同生物学科和物理、化学等学科协同发展的关系，理解科学工作者提纯生物大分子的艰辛。
学法指导
实验前，大家要学会比较各种实验材料的优劣并选择理想实验材料。在操作过程中，要注意分析主要操作步骤的目的和意义，特别要注意比较相同操作的目的，例如，两次加入蒸馏水，两次析出，多次用玻璃棒沿一个方向搅拌等。跟踪含DNA的物质在滤液和滤渣之间的过渡，并分析每一次过滤为什么能去掉杂质，并尝试用流程图的形式记录操作过程。
诱学导入
材料：
1944年，艾弗里等人从光滑型(S型)肺炎双球菌中分别提取DNA、蛋白质和多糖等物质，并将上述每一种物质单独放入粗糙型(R型)肺炎双球菌的培养基中，结果发现只有DNA能使一部分粗糙型肺炎双球菌转化为光滑型。并首次提出DNA是肺炎双球菌的转化因子，但是这一结论，并没有得到很多科学家的支持。直到后来艾弗里等人又设置了多组对照实验，才最终使其他科学家信服了他们的结论，为DNA是遗传物质提供了有力的实验支持，这在分子遗传学上具有极其重要的意义。
问题：科学家为什么不支持艾弗里等人的结论？艾弗里又设置了哪些对照实验？

导入：受当时技术水平的限制，提纯生物大分子的技术很不成熟，从光滑型(S型)肺炎双球菌中分别提取DNA、蛋白质和多糖等物质的纯度很低，不能排除转化大分子中杂质的作用，要分析为什么提取过程中含有杂质，会含有哪些杂质。艾弗里通过设置对照发现：转化率与供体菌细胞的DNA纯度有关，DNA越纯，转化率也就越高，如果事先用DNA酶降解供体菌细胞中的DNA，那么转化作用就不复存在了，用酶避免了提取DNA不纯的问题，从反面证明了转化作用是由DNA引起的。专题5
DNA和蛋白质技术
课题2
多聚酶链式反应扩增DNA片段
庖丁巧解牛
知识 巧学
一、PCR原理
1.多聚酶链式反应（又称PCR技术）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
2.用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制过程类似。
要点提示
DNA的两条链是反向平行的。为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链。
辨析比较
DNA聚合酶和DNA连接酶?
（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
?
（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
3.在80～100
℃范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
疑点突破
Taq
DNA聚合酶是从Thermus
aquaticus菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94
kDa。这种酶的天然形式可在74
℃复制DNA，
Taq
DNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应，形成双链DNA。
二、PCR的反应过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
1.变性　当温度上升到90
℃以上时，双链DNA解聚为单链。
2.复性　温度下降到50
℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
3.延伸　温度上升到72
℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
要点提示
PCR的反应过程和DNA的复制过程的区别：体外DNA进行、不需解旋酶、条件不同。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA的复制在体外反复进行。
三、实验操作?
1.用微量移液器，按照下列配方在微量离心管中依次加入各组分?
PCR反应体系的配方?
10倍浓缩的扩增缓冲液　　　　　　　　　　　　
5
μL?
20
mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液
1
μL?
20
mmol/L的引物Ⅰ
2.5
μL?
20
mmol/L的引物Ⅱ
2.5
μL?
H2O
28～33
μL?
1～5
U/mL的Taq
DNA聚合酶
1～2
U?
模板DN
A5～10
μL?
总体积
50
μL
2.参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序
循环数
变性
复性
延伸
第1次
94
℃,10
min
——
——
30次
94
℃,30
s
55
℃,30
s
72
℃,1
min
最后1次
94
℃,1
min
55
℃,30
s
72
℃,1
min
问题 探究
?
问题1
PCR技术怎样扩增DNA ?
探究:待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA链的两端序列实现特异性复性结合。此时，两引物的3′端相对，5′端相背，扩增的片段由5′端向3′端延伸。在适当的pH和离子强度下，由TaqDNA聚合酶催化引物的延伸。?
上述反应过程是通过温度控制来实现的。热变性—复性—延伸的一个周期过程称为一个PCR循环。PCR全过程就是在适当条件下的这种循环的多次重复。首次PCR中延伸的产物在进入第二次循环变性后，再与引物互补，充当引导DNA合成的新模板。因此，第二轮循环后，模板由首轮循环后得到的4条增为8条（包括原始模板在内），以此类推，以后每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。从理论上讲，扩增DNA产量可呈指数上升，即n个循环后，产量为2n?拷贝。
问题2
引物的特点是什么？?
思路:引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。?
探究:（1）引物长度：15～30
bp，常用为20
bp左右。?
（2）引物扩增跨度：以200～500
bp为宜，特定条件下可扩增长至10
kb的片段。
?
（3）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。?
（4）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
典题 热题
例1关于PCR引物的下列说法，不正确的是（　　）?
A.引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的（脱氧）核苷酸序列?
B.引物常根据需要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得?
C.DNA聚合酶只能使DNA链从引物的3′端开始向引物的5′端延伸?
D.引物的3′端必须具有游离的-OH基团?
解析：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；延伸DNA链是从5′端向3′端延伸。?
答案：C
例22002年4月，以杭州华大基因研究中心和浙江大学生物信息研究中心为主体的中国科学家协会成功破译了水稻基因的信息。下图1表示DNA测序仪显示的碱基序列，则图2中显示的碱基序列为（　　）?
A.AGGTT　　?　B.ATTGG?　　
C.TAAGG　　　
D.TGGAA?
解析：本题为信息题，通过分析图1可知由上到下代表的是脱氧核苷酸序列，数字代表的是脱氧核苷酸的种类。?
答案：B专题5
DNA和蛋白质技术
课题1
DNA的粗提取与鉴定
庖丁巧解牛
知识 巧学

一、提取DNA的方法?
1.基本思路?
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.DNA的理化性质?
（1）DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用上述特点可达到分离DNA的目的。?
（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60～80
℃的高温，而DNA在80
℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
要点提示
DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于?0.14
mol/L?时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于?0.14
mol/L?时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。
3.DNA的鉴定
DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定Ｄ.Ａ的试剂。
知识拓展
蛋白质的溶解度与盐溶液浓度的关系：在中性盐溶液中，低浓度时，蛋白质的溶解度较高即盐溶现象；高浓度时，蛋白质的溶解度较低，并可析出即盐析现象。
二、实验设计?
1.实验材料的选取?
一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液?
以动物细胞为实验材料时，破碎细胞较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。以植物细胞为材料时，充分研磨破坏了细胞壁，洗涤剂中的表面活性剂成分能够与膜蛋白结合从而破坏细胞膜，这些为核DNA的释放提供了通道。
3.去除滤液中的杂质?
根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开。
4.DNA的析出与鉴定
难点剖析
在DNA的析出步骤中，用玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程中的DNA损失。
辨析比较
（1）实验过程中有两次需要加入蒸馏水，第一次的目的是使红细胞膜破裂，第二次的目的是稀释NaCl溶液使其浓度降低至0.14
mol/L，使DNA沉淀析出。?
（2）两次析出DNA所依据的原理也不同：①DNA在NaCl溶液浓度为0.14
mol/L时溶解度最低；②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出。
问题 探究
?
问题1
析出DNA时为什么要用冷却的酒精溶液？?
思路:DNA溶于一定浓度的NaCl溶液，但不溶于酒精，而且冷却的酒精可以降低分子运动，有利于DNA的聚合和析出，同时低温有利于增加DNA分子的柔韧性以减少断裂，便于用玻璃棒卷起。此外，冷却的酒精还可以降低并抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解，从而提取到较多的DNA物质。?
探究:可以通过设置对照实验，向含有DNA物质的滤液中分别加入等体积的体积分数为95%的冷却酒精和常温态酒精，比较最终获得的白色丝状物的数量。
问题2
制备鸡血细胞液时，为什么要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠？?
思路:制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞、白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液——血浆。?
探究:鸡血中加入柠檬酸钠和不加入柠檬酸钠的血液状态如何？得到的淡黄色半透明的液体的成分有何不同？
典题 热题
例1本实验中有三次过滤，以下三次过滤分别为了获得（　　）?
①过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液　②过滤含黏稠物的0.14
mol/L的NaCl溶液　③过滤溶解有DNA的2
mol/L的NaCl溶液?
A.含核物质的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液?
B.含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、含DNA的滤液?
C.含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、纱布上的DNA?
D.含较纯的DNA滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液?
解析：用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤的相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA在0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，成丝状黏稠物，可经过滤留在纱布上。?
答案：A
方法归纳
过滤操作的目的无非两种，获得滤液，获得滤渣，关键是分析DNA存在于那种组分里面，根据提取DNA的原理，DNA在0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，DNA沉淀析出，存在于滤渣中，DNA在2
mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，DNA存在于滤液中。
例2下列关于DNA的粗提取和鉴定的有关说法，正确的是（　　）?
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的增大而增大?
B.溶有DNA的NaCl溶液中加入4mL二苯胺试剂即变蓝色
?
C.DNA粗提取和鉴定时，选材最好用鸡血而不用猪血
?
D.提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，食盐有利于DNA从细胞中释放出来?
解析：本题考查DNA的粗提取和鉴定中相关步骤的模糊点。需要对每一个选项认真分析，用排除法选择。从DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线可知，NaCl溶液在低于?0.14
mol/L?时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度增加而逐渐下降，?0.14
mol/?L时溶解度最低，当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA溶解度逐渐增加。A选项只注重一段范围内的变化，不够全面。二苯胺试剂使用时需要水浴加热才出现实验现象。猪的成熟红细胞没有细胞核，无DNA，故不能用于本实验。而提取洋葱的DNA时，食盐的作用是溶解释放后的DNA，洗涤剂才能使DNA从细胞中释放出来。?
答案：C专题5
DNA和蛋白质技术
课题3
血红蛋白的提取和分离
庖丁巧解牛
知识 巧学
一、凝胶色谱法
凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。当一个含有各种分子的样品溶液缓慢通过凝胶时，相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。
二、缓冲溶液
缓冲溶液能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持溶液pH基本不变。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
知识拓展
缓冲溶液由足够浓度的酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸，能对抗外来强酸的称为共轭碱，这一对共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系，常见的缓冲对主要有三种类型：弱酸及其对应的盐；多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐；弱碱及其对应的盐。
三、电泳
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的的。
要点提示
电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单地说，这些带电粒子在电泳时的迁移率，与粒子所带的电荷量成正比，与分子量大小成反比。??
四、实验操作：蛋白质的提取和分离?
1.样品处理?
（1）红细胞的洗涤　洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色液体，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
要点提示
洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。
（2）血红蛋白的释放红细胞在蒸馏水和40%的甲苯作用下破裂，释放血红蛋白。?
（3）分离血红蛋白溶液将混合液进行离心后会分层，第3层的红色透明液体是血红蛋白。
（4）透析　目的是除去样品中的分子量较小的杂质。
2.凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作?
（2）凝胶色谱柱的装填?
①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。?
②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现有，必须重装。?
③装填完后，立即用300
ml
20
mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12
h，使凝胶装填紧密。
（3）样品的加入和洗脱?
①按正确方法加样，不能破坏凝胶面。?
②进行洗脱时，等红色的蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。
方法点拨
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步?
包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤和红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
疑点突破
血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选做)?
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
问题 探究
?
问题1
凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？?
思路:凝胶色谱柱的高度、平整程度以及均匀与否都可能会影响样品的分离度。?
探究:（1）装填前为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内空气。?
（2）装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。?
（3）装填后不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
问题2
蛋白质是如何分离的？?
思路:蛋白质是根据离心原理分离的。?
探究:当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用，使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。
典题 热题
例1下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是（　　）?
A.是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法?
B.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出?
C.凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系?
D.一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来。
解析：本题考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理。凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法，凝胶是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，小分子蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度快，因此在洗脱过程中分离。选用不同种凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离的分子大小也不同，故应相关。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来。这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
答案：C?
例2电泳技术可分离和解析氨基酸和核苷酸等有机物，下图是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果。据图分析该多肽由几种氨基酸组成（　　）
A.6
B.4?
C.5
D.3
解析：电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及电性差异将大分子在电场中彼此分离开的。简单地说，这些带电粒子在电泳时的迁移率，与粒子所带的电荷量成正比，与分子量大小成反比。由于组成多肽的氨基酸的分子量，所带电荷不同，会形成不同的电泳带，因为形成六条电泳带，所以该多肽由六种不同氨基酸组成。?
答案：A

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