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选修一 生物技术实践
第一讲 微生物的利用
考纲解读
知识内容
考试属性及要求
加试
微生物的培养和利用
大肠杆菌的培养和分离
实验与探究能力
分离以尿素为氮源的微生物
实验与探究能力
基础知识
考点一 微生物的实验室培养
一、培养基
1.培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需要适宜的PH、温度及特殊营养物质、氧气，以满足微生物生长的要求。
3.牛肉膏蛋白胨固体培养基的配置流程：计算→称量→熔化→灭菌→倒平板
4.培养基的种类及作用：
划分
标准
培养基种类
特点
用途
按物理性质分
液体培养基
不加凝固剂
工业生产、扩大培养
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
运动、保藏菌种
固体培养基
分离、鉴定、计数
按成分来源分
天然培养基
化学成分是天然物质
工业生产
合成培养基
将所需化学成分按需要和比例配制而成
分类、鉴定
按用
途分
选择培养基
抑制不需要的微生物生长，促进所需微生物生长
如培养基中加青霉素，可选出酵母菌、霉菌等真菌，而细菌则不能生长
鉴定培养基
加入某种化学物质或显色剂，鉴别不同种类的微生物
如培养基中加伊红美蓝试剂，可鉴别饮用水等食品中是否有大肠杆菌，若有，则菌落呈深紫色，带金属光泽
二、细菌的分离方法
1. 划线分离法
（1）方法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。
（2）操作步骤：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 3～5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。
（3）操作注意事项
①取菌种前，灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；
②除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；
③取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；
④最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
2. 涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10－5 ～10－7之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。
3.比较：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。
三、无菌技术
1．无菌技术：为避免外来杂菌的污染，应注意：
①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；
②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；
③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；
④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2．消毒方法：
①煮沸消毒法：日常生活常用方法；
②巴氏消毒法（80℃，煮15分钟）：对一些不耐高温的液体；
③化学药剂消毒：实验操作者的双手使用酒精进行化学消毒；
④紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台等实验空间。
3．灭菌方法：
①灼烧灭菌法：如接种环、接种针、试管口等；
②高压蒸汽灭菌法（100kPa,121℃，15～30min）：如培养基、无菌水等，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；
③干热灭菌法（160～170℃，1～2h）：如玻璃器皿、金属用具等不能受潮的实验器具。
4．消毒和灭菌的比较：
比较项
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
强烈
全部微生物
能
考点二 大肠杆菌的培养和分离
1. 细菌是单细胞的原核生物。与真核细胞相比，细菌无成型的细胞核，其细胞壁由肽聚糖组成。不同细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素，染色后呈蓝紫色；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素，染色后呈红色。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。
2. 大肠杆菌是革兰氏阴性、异氧兼性厌养型的肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。
3.一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，用LB固体培养基来划线分离大肠杆菌。
4.大肠杆菌的培养和分离试验流程
①培养基灭菌：将刚配置好的50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基分别装入两个250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。
②倒平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，放置于水平位置并轻轻晃动，使培养基铺平培养皿底部，待凝固后即形成平板。
③接种扩大培养：靠近酒精灯火焰旁将大肠杆菌接种到三角瓶的LB液体培养基中，三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床中震荡培养12h。
④划线分离：将在摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中进行培养，12～24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。
⑤菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线分离法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
考点三 分离以尿素为氮源的微生物
1．实验原理：土壤环境中有一些细菌含有脲酶，它们可以通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素分解的化学方程式为：（NH2）2C=O+H2O→2 NH3+CO2。尿素在脲酶的降解下产生NH3，使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由红黄色变成红色。
2. 实验步骤：
（1）制备培养基：在60℃左右时，将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯火焰旁分别倒入两个培养皿中，摇匀后平放至凝固。
（2） 制备细菌悬液：在无菌条件下，将土样1g加到有99ml无菌水的三角瓶中，震荡10min，即成10-2土壤稀释，依此方制备出10-3、10-4和10-5的土壤稀释液。
（3）涂布分离：取10-4和10-5土壤稀释液各0.1ml，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上的火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
（4）培养：将培养皿倒置，在37℃恒温培养箱中培养24～48h。
（5）观察：观察菌落数。
3.实验结果：LB全营养固体培养基上的菌落多而杂；尿素固体培养基上的菌落少而纯。
4.注意事项：
①实验土样要从有哺乳动物排泄物的地方取得。
②本实验需设置对照，即以LB全营养培养基为对照组，以尿素唯一氮源、其它营养条件与对照组相同的尿素固体培养基为实验组。实验组的菌落数目少于对照组的菌落数目。
③尿素溶液需用G6玻璃漏斗过滤，目的是滤去细菌。
④本实验用涂布分离法分离细菌。实验中要用70%酒精对玻璃刮刀进行消毒并灼烧灭菌。
⑤本实验配制固体培养基时要添加琼脂糖，而不使用琼脂，是因为琼脂中含有氮元素，这样可以排除琼脂中氮元素对实验结果的干扰。
⑥本实验尿素培养基中还加入了酚红作指示剂，因为尿素被尿酶分解后产生的氨与该指示剂显红色。可根据细菌菌落周围红色环状区域大小判断细菌 分解尿素能力的大小。

第二讲 酶的应用
考纲解读
知识内容
考试属性及要求
加试
酶的应用
果汁中的果胶和果胶酶
实验与探究能力
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
实验与探究能力
基础知识
考点一 果汁中的果胶和果胶酶
一、果胶
1．存在：植物细胞壁及胞间层的主要成分。
2．成分：由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。
3．特性：果胶不溶于乙醇，因而可用乙醇提取溶液中的果胶。
二、果胶酶
1．来源：黑曲霉、苹果青霉
2．组成：果胶酶是分解果胶一类酶的总称，主要包括果胶酶和果胶甲酯酶。
3．作用：将果胶分解为可溶性小分子，一方面可以使果汁澄清，另一方面也可以提高出汁率。
三、探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件的实验
1．实验原理
（1）果胶在果胶酶和果胶甲酯酶的作用下分解为半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯。
（2）果胶酶的活性受温度（或pH）的影响，处于最适温度（或最适pH）时活性最高。果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小呈正相关。
（3）果胶不溶于乙醇。
2．实验流程
第一步
制匀浆
第二步
烧杯A
烧杯B
5g匀浆
5g匀浆
10ml黑曲霉提取液
10ml水
间歇搅拌20～30min
第三步
试管1
试管2
试管3
试管4
A烧杯混合物4ml
A烧杯混合物4ml
B烧杯混合物4ml
B烧杯混合物4ml
沸水浴
不加热
沸水浴
不加热
较澄清
最澄清
最浑浊
较混浊
第四步
加入95%酒精4ml
沉淀物较少
沉淀物最少
沉淀物最多
沉淀物较多
3．实验结论：果胶酶能分解果胶，提高果汁的澄清度。
考点二 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
1．固定化酶：将水溶性的酶用物理或者化学的方法固定在某种戒介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
2．特性：固定化酶具有易储存、运输和可重复利用等多种优点。
3．固定化的方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。
4．α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
（1）固定α－淀粉酶的方法：吸附法，载体是石英砂。
（2）实验原理：常用的淀粉指示剂是KI-I2溶液，遇淀粉显蓝色。淀粉的水解产物不同，显色也不同。
（3）实验过程
（4）注意事项
①在固定化α-淀粉酶后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤注射器以除去未吸附的游离淀粉酶。
②实验结束后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱是为了洗去残留的淀粉溶液和产物。

第三讲 生物技术在食品加工中的应用
考纲解读
知识内容
考试属性及要求
加试
生物技术在食品加工中的应用
果酒及果醋的制作
实验与探究能力
泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
实验与探究能力
基础知识
考点一 果酒及果醋的制作
一、果酒的制作
1. 原理：酵母菌只有在无氧条件下，才能进行酒精发酵。
2. 反应式：C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O
3. 实验步骤(装置如图)
（1）方法一：用葡萄制作葡萄酒流程
冲洗→榨汁→制作酵母悬液→装瓶→酒精发酵→过滤、分装、保存
（此方法制作的葡萄酒不含糖，酒精量也低，平均的体积分数为8%。）
（2）方法二：用果汁制作果酒流程
制取果汁→配料（加入蔗糖、果汁、酵母悬液）→发酵→过滤、分装、保存
（此方法制作的果酒酒精含量较高，体积分数约为15%，糖含量也较高。）
4. 实验要点
（1）酿酒的微生物是酵母菌，菌种的不同，所产生的酒的风味也不同。
（2）酵母菌只有在无氧条件下，才能进行酒精发酵，且当培养液中酒精浓度超过16%时，酵母菌就会死亡。
（3）本实验葡萄的消毒用鲜红紫色的高锰酸钾溶液浸泡5min，再用清水冲洗。葡萄皮上本来已经有野生酵母存在，但为了加快发酵速度，还要另外添加干酵母。
（4）酒精发酵装置中使用弯曲的玻璃管，即可以隔绝空气，保持无氧环境，同时还能避免杂菌进入，还可以使产生的二氧化碳气体排出容器，保持压强平衡。
（5）发酵瓶中的溶液量不能超过容积的2/3。装得太满则发酵过程中溶液易溢出。发酵温度应在25～30℃为宜。当瓶内停止出现气泡表示发酵完毕。
（6）用纯葡萄制作的葡萄酒不含糖，酒精含量也低（平均的体积分数为8%）。若要制作酒精含量（体积分数约为15%）和糖含量都较高的果酒，可用果汁制作葡萄酒，发酵液中应该加入一定的蔗糖。发酵开始时，酵母菌进行有氧呼吸，由于其细胞呼吸底物不是葡萄糖，消耗的氧气多，产生的二氧化碳少，发酵瓶会出现负压。获得的果酒可用虹吸法取出。
二、果醋的制作
1. 原理：
（1）若氧气、糖源都充足时，醋杆菌将糖分分解成醋酸。
（2）若缺少糖源时，醋杆菌在有氧条件下能把乙醇氧化为醋酸。
2. 反应式
（1）氧气、糖源充足：C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O
（2）缺少糖源、氧气充足：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O
3. 实验步骤（装置如图）
把800ml酒-水混合物倒入甲瓶中→醋酸发酵在乙瓶中（装锯末至八分满，将适量醋化醋杆菌的培养物或醋曲悬液加在200ml酒-水混合物中混匀，调pH至7.0后倒入乙瓶中，使锯末均匀湿透）→向乙瓶内通入空气，不必太快（通气管内含有脱脂棉球，不要塞的太紧，用以过滤空气）→醋酸发酵约48小时后，用pH试纸检查乙瓶中流出液的pH。若呈明显酸性→调节活塞，使甲瓶滴入乙瓶的液体流量约为每5min1滴，使滴入丙瓶中的液体也是约为每5min1滴→每天用pH试纸检测流出液的pH，监控发酵进行的情况。等流出液的pH不再减少，或者甲瓶中的液体全部流入乙瓶时，停止实验。
4. 实验要点
（1）与醋制作有关的微生物是醋杆菌，菌种的不同，所产生的醋的风味也不同。
（2）醋杆菌只有在有氧条件下，才能将乙醇氧化为醋酸。用醋杆菌发酵，培养液中醋酸含量可以达到13%。
（3）因为是需氧发酵，因此在发酵过程中，必须不断向装置中的乙瓶通入无菌空气，通气的玻璃管塞上脱脂棉，可以过滤空气，避免杂菌感染。
（4）发酵过程中，甲瓶流入乙瓶的液体流量应当等于乙瓶流入丙瓶的液体流量，流速大约是每5min1滴。
三、果酒和果醋制作的比较
比较项目
酒精发酵
醋酸发酵
微生物
酵母菌
醋杆菌
条件
无氧
有氧
实验现象
气味和味道
酒味
酸味
气泡和泡沫
有气泡和泡沫
无气泡和泡沫
发酵液颜色
浑浊
浑浊，液面形成白色菌膜
流程
挑选新鲜的水果→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵
联系
酒精发酵为醋酸发酵提供乙醇
考点二 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
一、泡菜腌制
1. 泡菜腌制过程中起作用的菌类主要是：假丝酵母和乳酸菌。但这类食品含有一定量的对人体有害的致癌物质――亚硝酸盐。
2.泡菜腌制过程
（1）各种菜洗净切成3～4cm长的小块。
（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
（3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛中，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1min后入坛，再加入一些白酒。
（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。
（5）腌制1周左右即可开坛食用，也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。
（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。
3.实验要点
（1）腌制泡菜时加入白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，也是一种调味剂，可增加醇香感。
（2）泡菜坛内的白膜是由于产膜酵母的繁殖而形成的。
（3）用水封闭坛口可起到空气隔绝的作用，有利于坛内蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。
（4）亚硝酸盐是由硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是消化细菌氧化氨形成的。
4.泡菜腌制过程中各物质的变化
发酵时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
发酵初期
少（有O2，乳酸菌活动受抑制）
少
增加（硝酸盐还原菌的作用）
发酵中期
最多（乳酸抑制其他菌活动）
积累增多，pH下降
下降（硝酸盐还原菌活动受抑制，部分亚硝酸盐被分解）
发酵后期
减少（乳酸继续积累，pH继续下降，抑制乳酸菌活动）
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定（硝酸盐还原菌被完全机制）
二、亚硝酸盐的测定
1. 测定亚硝酸盐含量的原理
在盐酸酸化的条件下，亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联 ，形成紫红色产物。
2.检测方法：亚硝酸盐含量不同，颜色深浅也不同，可用光电比色法测定泡菜中的亚硝酸盐的含量。测定时，所测溶液的颜色要与亚硝酸钠标准溶液的颜色进行比对。

第四讲 浅尝现代生物技术
考纲解读
知识内容
考试属性及要求
加试
植物组织培养
植物的组织培养
实验与探究能力
基础知识
考点一 植物组织培养
一、植物组织培养
1.组织培养：就是取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在无菌条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，进而生根发芽。
2.培养基
（1）本实验需要配制三种培养基，即：MS培养基、发芽培养基、生根培养基。
（2）MS培养基：为液体培养基，由大量元素、微量元素和有机成分组成。
（3）发芽培养基：在MS培养基的基础上添加了生长素、细胞分裂素两类激素和琼脂等物质，是固体培养基。
（4）生根培养基：在MS培养基的基础上添加了生长素一类激素和琼脂等物质，是固体培养基。
3.植物组织培养过程：
4.实验要点
（1）愈伤组织培养时，最初避光培养，后期见光培养。
（2）植物激素对再分化的影响
细胞分裂素/生长素比例
对再分化的影响
高
发芽
低
生根
相当
继续生长不分化
（3）实验中用到的激素都是人工合成的，如类似生长素作用的奈乙酸（NAA），类似细胞分裂素作用的苄基腺嘌呤（BA）。人工合成的激素作用时间比天然的植物激素作用时间长，是因为植物缺少分解人工合成激素的酶。
二、菊花的组织培养
1.实验原理：植物细胞的全能性
2.实验操作流程
配置培养基→菊花外植体消毒→接种至发芽培养基→丛壮苗→转入生根培养基→生根→移栽至草炭土或蛭石中→锻炼（炼苗）→定植→长成植株
3.实验要点
（1）外植体消毒方法：先在70%乙醇中浸泡10min，再放入5%次氯酸钠溶液总浸泡5min，然后用另一5%次氯酸钠浸泡5min，最后在超净台中用无菌水清洗。
（2）锻炼（炼苗）：待生根后，将苗移至草炭土或蛭石中，保持80%以上的湿度，2～3天后逐渐降低湿度进行锻炼，直到处于自然湿度下为止。
（3）在菊花植物组织培养中，可以不添加植物激素，因为其茎段培养较为容易。

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