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3.2基因工程的基本操作程序教案
【教学目标】
课程标准与本节相对应的要求是：阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。结合教材内容，确定本节的教学目标如下：
1.阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程
2.说出基因表达载体的组成
3.列举将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法
4.列举检测与鉴定目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达其遗传特性的方法
5.能够用流程图的形式概括出基因工程的基本操作程序
6.针对人类生产或生活中的某一需求，能运用基因工程尝试设计获得某一转基因产品的方案
7.能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就
【教学重难点】
1.教学重点
(1)基因工程基本操作程序的四个步骤。
(2) DNA片段的扩增及电泳鉴定。
2.教学难点
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2) DNA片段的扩增及电泳鉴定。
【新课导入】
教师利用课件展示“转基因抗虫棉”和“非转基因抗虫棉”的相关图片，并利用教材中的“从社会中来”的文字部分，让学生思考“转基因抗虫棉抗虫的机制是什么？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？”
通过联系生产、生活实际，激发学生的学习兴趣。
【新课讲解】
第一步：目的基因的筛选与获取
（1）目的基因：
用于改变受体细胞性状或获取预期表达产物等的基因，这些基因主要是指编码蛋白质的基因。（基因通常是指有遗传效应的DNA片段）
改变受体细胞性状：如抗逆性、抗虫性、抗病性、生长迅速、品质优良
获得预期表达产物：生产药物、毒物降解酶、工业用酶等
（2）区分抗虫棉目的基因：
来源：苏云金杆菌（Bt），原核生物
苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）：破坏鳞翅目昆虫的消化系统
Bt抗虫基因（Bt基因）
原理：Bt抗虫蛋白在碱性环境中被酶分解为多肽，多肽可以和昆虫肠上皮细胞膜上特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，害虫死亡。而人和牲畜胃呈酸性，Bt抗虫蛋白不能分解为相应的多肽，肠上皮细胞膜上也没有相应的受体。所以对人和牲畜无害。
1、筛选合适的目的基因
（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
（2）实例：苏云金杆菌常用于制成生物杀虫剂，研究表明其杀虫作用与Bt基因有关，科学家已经了解了Bt基因的结构、功能以及其翻译产生的Bt抗虫蛋白的结构与功能。
（3）三大核酸序列数据库：GenBank（美国）、EMBL（欧洲）、DDBJ（日本）
上面有许多生物的全基因组测序数据，以及一些研究清楚的基因的结构及功能注释，可以直接从中获得目的基因的序列以及它在染色体上的位置。
2、利用PCR获取和扩增目的基因
（1）获取目的基因的方法
①人工合成法：利用DNA合成仪合成序列已知、片段较小的基因
②从基因文库中获取：某生物基因碎片化后连在载体上导入受体菌中保存
③PCR扩增法：提取苏云金杆菌的DNA→设计特异性引物→体外扩增Bt基因
（2）PCR简介
全称：聚合酶链式反应（(Polymerase Chain Reaction）
原理：DNA半保留复制
实质：DNA在体外的大量复制
发明者：穆里斯（我国台湾科学家钱嘉韵发现耐高温酶），获诺贝尔奖
DNA复制所需条件：
体内复制 体外复制 在DNA复制中的作用
解旋酶 高温 打开DNA双链
DNA母链 DNA母链 提供DNA复制的模版
4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷酸（dNTP） 合成DNA子链的原料（供能）
DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶 （Taq DNA 聚合酶） 催化合成DNA子链
引物（RNA） 引物(DNA或RNA) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 （DNA复制方向：5'→3'）
Mg2+缓冲溶液 激活DNA聚合酶
PCR引物：2种，各为一小段能与DNA母链的一段序列互补配对的短核苷酸单
链，常为20-30bp。
PCR过程：变性、复性、延伸
①变性：温度升高到90℃以上，DNA双链中氢键打开变为单链
②复性：温度降为50℃左右，两条引物通过碱基互补配对分别与DNA两条单链的特定部位结合（引物序列必需紧挨目的基因，两条分别位于目的基因的上下游）
③延伸：温度又升高到72℃，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链
PCR在PCR仪中完成，一般设置30个循环，最终由1个DNA复制形成230个DNA，产生的许多Bt基因可以与载体相连。
让学生观看PCR过程的视频
思考：用PCR可以扩增单链mRNA吗？（不可以，需要逆转录形成双链DNA）
过程：mRNA→逆转录酶合成DNA-RNA杂交链→核酸酶水解RNA→DNA单链→DNA聚合酶合成双链DNA
第二步：基因表达载体的构建
构建基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
基因表达载体的构建
首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
目的基因导入受体细胞的方法
（1）目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。
②农杆菌转化法
Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的Ti质粒上的T DNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。
Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA中，让农杆菌侵染植物细胞。
（2）目的基因导入动物细胞
①常用方法：显微注射法。
②常用受体细胞：受精卵。
（3）目的基因导入微生物细胞
①方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌）。
第四步：目的基因的检测与鉴定
只有一部分Bt基因能成功导入棉花细胞并表达Bt抗虫蛋白，这需要检测和鉴定才能知道，如何进行检测和鉴定呢
让学生结合学过的基因表达相关的知识推出检测与鉴定目的基因的几个水平。思考、回答，认识到可以分别从DNA、RNA和蛋白质水平进行检测;检测棉花是否具有抗虫特性最直接的办法是观察它是否对棉铃虫产生了抗性，这属于个体水平的检测。并介绍在其他不同水平进行检测与鉴定的方法。
【板书】
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选和获得
筛选合适目的基因、PCR、
2.基因表达载体的构建
目的基因、标记基因、启动子、终止子
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测和鉴定

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